Name: Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer actine- en microtubulus-cytoskeletten visualiseren in de B-cel immuunsynaps met STED-microscopie. Deze methode biedt nanometerschaalresolutie voor het bestuderen van cytoskeletreorganisatie tijdens immuunrespons.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging faciliteit voor ondersteuning en handhaving van de Microscoop STED. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie #68865 van de Canadese instituten van Health Research (M.R.G.). Wij danken Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) voor de CLIP-170-GFP plasmide.

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van British Columbia Animal Care Comité.
1. uiten van GFP-fusion proteïnen in cellen van de A20-B-lymfoom
<ol><li>Cultuur A20 cellen in volledige RPMI medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat, 50 U/mL penicilline en 50 µg Mo/mL streptomycine) bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met 5 % CO2.</li>
	<li>Voorbereiden van de transfectiereagens (Zie de Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant. Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de specifieke reagentia en transfectie protocol beschreven de Tabel van materialen. Andere transfectie reagentia die we hebben geprobeerd hebben geen voldoende transfectie efficiëntie opgeleverd.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Cellen in een centrifuge 2.5 x 10-6 A20 (voor elke transfectie) voor 5 min op 525 x g. resuspendeer de cellen in 100 µL van transfectiereagens met 1-2,5 µg plasmide DNA. Gebruik voor DNA codering CLIP-170-GFP23, 2,5 µg per transfectie. Meng voorzichtig.</li>
	<li>De cellen overbrengen in een putje van de plaat van een 6-well, en pas het volume aan 2 mL met voorverwarmde volledige RPMI medium. Cultuur van de cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C eiwit expressie mogelijk te maken.</li>
</ol>2. primaire muisknop B cellen isoleren en je ze activeert met LP 's
<ol><li>Gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen gebruiken voor het verwijderen van de milt van een muis, protocollen door de instelling Animal Care Commissie goedgekeurd.</li>
	<li>Plaats een steriele 70-µm cel zeef in de weefselkweek kap, in een 35-mm weefselkweek schotel met 3 mL steriele PBS kamertemperatuur. Gebruik de rubberen deel van de zuiger van een 5 ml-spuit te verpletteren de milt door de zeef van de cel.</li>
	<li>Pipetteer eencellige opschorting van splenoctyes in een steriele tube van 15 mL en centrifugeer bij 525 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gebruik een magnetische kraal gebaseerde B-cel isolatie kit (Zie Tabel van materialen) te verkrijgen van een hoogverrijkt bevolking van B-cellen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen van B naar 3 x 106/mL in volledige RPMI medium aangevuld met 2,5 µg Mo/mL LPS plus 5 ng/mL B-cel activeren factor (BAFF; een cytokine overleven).</li>
	<li>Cultuur van de cellen voor 6 hr bij 37 ° C.</li>
</ol>3. coating glas Coverslips met Anti-Ig antilichamen
<ol><li>Bereid de antilichaam-oplossing voor het coaten van de coverslips. Verdun de stockoplossing van geit-anti-muis Ig antilichamen in kamertemperatuur steriele PBS te maken een 12,5 µg Mo/mL oplossing; 400 µL van antilichaam oplossing is vereist voor elke dekglaasje aan. Opmerking: Gebruik geit-antimuis IgG voor A20 cellen; geit-antimuis IgM gebruiken voor primaire B cellen. Geit IgG antilichamen binden niet ook aan muis Fc receptoren. Echter, om te voorkomen dat elke potentiële Fc receptor bindende, kunt een F(ab) of F(ab')2 fragmenten van anti-muis IgG of IgM-antistoffen anti-muis.</li>
	<li>Duik een dekglaasje aan van #1.5, 18-mm ronde glas in 100% methanol en laat het volledig drogen (~ 10 min).</li>
	<li>Plaats de gedroogde dekglaasje aan met pincet in een 12-well weefselkweek plaat en Pipetteer 400 µL van de 12,5 µg Mo/mL antilichaam oplossing (5 µg totaal; 2 µg/cm2) op het dekglaasje aan, zodat het vormen van een zeepbel in het midden van het dekglaasje aan en zich naar de randen uitbreidt.</li>
	<li>Wees voorzichtig ter dekking van de gehele dekglaasje aan, maar laat niet de antilichaam-oplossing om uit te breiden voorbij de rand van het dekglaasje glas aan en op de plastic weefselkweek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Wassen van de coverslips door pipetting 1 mL steriele PBS in het goed en vervolgens zuigen uit de oplossing. Herhaal de twee meer tijden voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen.</li>
	<li>Voeg 1 mL steriel PBS tot het putje met de antilichaam-gecoate dekglaasje aan totdat cellen zijn klaar om te worden toegevoegd. Opmerking: De coverslips is houdbaar bij kamertemperatuur, bedekt met PBS, voor gebruik op dezelfde dag.</li>
</ol>4. B-cel verspreiden op Anti-Ig-Coated Coverslips
<ol><li>Bereiden gewijzigd HEPES-gebufferde zoutoplossing (mHBS): 25 mM HEPES pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM nb2HPO4, 0.5 mM MgSO4, 1 mg/mL dextrose, 2 mM glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, en 50 µM 2-mercaptoethanol). Filter deze oplossing steriliseren en bewaren bij 4 ° C.</li>
	<li>Breng 50 mL mHBS met 2% op de dag van het experiment, FBS (mHBS-FBS) door toevoeging van 1 mL van de warmte-geïnactiveerd FBS aan 50 mL mHBS. Warm de mHBS-FBS tot 37 ° C vóór gebruik.</li>
	<li>Centrifugeer transfected cellen A20 of de primaire B-cellen, die had zijn gekweekt met BAFF plus LPS bij 525 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL mHBS-FBS, met behulp van een hemocytometer cellen tellen en verdunnen van de cellen tot 2 x 105 cellen/mL in mHBS-FBS.</li>
	<li>Met behulp van Tang, overbrengen in het dekglaasje aan van de weefselkweek plaat een stuk van paraffine film.</li>
	<li>250 µL van B-cellen (5 x 104 cellen) aan elke dekglaasje aan toevoegen.</li>
	<li>Incubeer de coverslips bij 37 ° C gedurende 15 min. in het donker te staan van de B-cellen te verspreiden over het anti-IgG-gecoate oppervlak.</li>
</ol>5. vaststelling en immunokleuring de cellen
<ol><li>De oplossing van de fixatie door verdunning van de stockoplossing paraformaldehyde 16% en de 50% Glutaaraldehyde stockoplossing in kamertemperatuur gedestilleerd water aan opbrengst eindconcentraties van 3% paraformaldehyde en 0,1% Glutaaraldehyde voorbereiden. Bereid de oplossing van de fixatie op de dag dat het is om te worden gebruikt en overmaat negeren. Let op: De paraformaldehyde en Glutaaraldehyde voorraadoplossingen mag alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast. Volg de instructies op het veiligheidsinformatieblad (MSDS).</li>
	<li>Voorbereiden van de permeabilization/blokkeren buffer (3% BSA en 0,1% Triton X-100 verdund in PBS). Filter deze oplossing steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Warm op de dag van het experiment, het normbedrag tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereiden de kleuring buffer (1% BSA en 0,1% saponine in PBS). Deze oplossing met behulp van een 0,2 µm filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Warm op de dag van het experiment, het normbedrag tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Pipetteer 350 µL van de oplossing van de fixatie op elke dekglaasje aan, ervoor te zorgen dat het oppervlak volledig bedekt is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.</li>
	<li>Verwijder de fixatie oplossing uit het dekglaasje aan door zorgvuldig zuigen van de rand van het dekglaasje aan met behulp van een micropipet. Let op: De fixatie oplossing moet worden weggegooid als gevaarlijk chemisch afval.</li>
	<li>Wassen van de coverslips eens met 500 µL van buffer permeabilization/blokkeren. Pipetteer uit de vloeistof.</li>
	<li>Permeabilize en blokkeren de cellen door 250 µL van permeabilization/blokkeren buffer toe te voegen aan elke dekglaasje aan en incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Verdun het konijn anti-tubuline antilichaam 1:100 in buffer kleuring.</li>
	<li>Gecombineerd uit de buffer permeabilization/blokkeren van de coverslips, en 50 µL van de verdunde anti-tubuline antilichaam-oplossing toevoegen aan elke dekglaasje aan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. in het donker.</li>
	<li>Bereid de oplossing van de vlek secundair antilichaam/actine door verder verdunnen van zowel de Alexa Fluor 532-geconjugeerde geit anti-konijn IgG secundair antilichaam en de Alexa Fluor 568-geconjugeerde phalloidin 1:100 in de kleuring van de buffer.</li>
	<li>De coverslips 3 keer voor het verwijderen van overtollige primair antilichaam door toevoeging van 500 µL van kleuring van buffer en aspirating dan het wassen.</li>
	<li>50 µL van het secundaire antilichaam/actine vlek oplossing toevoegen aan elke dekglaasje aan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>De coverslips 3 keer voor het verwijderen van overtollige secundair antilichaam door toevoeging van 500 µL van kleuring van buffer en aspirating dan het wassen.</li>
	<li>Voeg 10 µL van montage reagens op een microscoopglaasje. Monteer het dekglaasje aan op het microscoopglaasje met de cel-zijde naar beneden. Opmerking: Een "anti-fade" montage-medium (Zie Tabel van materialen) wordt sterk aanbevolen voor het behoud van de intensiteit van de fluorescentie van GFP fusion eiwitten. Vermijd het gebruik van montage van reagentia met DAPI, die met de beeldvorming van de fluorophores interfereren kan bij het gebruik van de laser STED.</li>
	<li>Laat de dia's te droog 's nachts in het donker. Het imago van de dia's de volgende dag. Opmerking: De dia's Imaging zodra het dekglaasje aan droge sterk wordt aanbevolen, omdat het GFP-fluorescentie in de tijd afnemen zal.</li>
</ol>6. met behulp van de Microscoop STED imaging
Opmerking: Houd er rekening mee dat alle software stappen hieronder beschreven zijn specifiek voor de Microscoop en de software die we gebruikt (Zie de Tabel van de materialen). De stappen en de instellingen zal moeten worden aangepast als beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een andere Microscoop/software.
<ol><li>Inschakelen van de Microscoop STED, activeren de lasers en epifluorescence verlichting lamp en opstarten van de Microscoop software.</li>
	<li>Stel de parameters voor de STED uitputting lasers. Opmerking: Dit zal afhangen van de specifieke Microscoop wordt gebruikt en de lasers die is uitgerust met. Enkele aanbevolen instellingen zijn wit licht (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%.</li>
	<li>Activeer de instellingen STED en uitlijnen van de STED laserstralen, het streven naar 100 X.</li>
	<li>Met behulp van het oculair, concentreren van het monster en selecteer een cel met matige GFP expressie. Opmerking: Lage GFP expressie worden niet zichtbaar omdat STED de emissie-intensiteit vermindert. Omgekeerd, hoge uitdrukking van CLIP-170-GFP induceert de spontane vorming van grote clusters, die niet met de normale microtubulus plus-end eiwit complex morfologie en distributie overeenkomt. Selecteren van een cel met matige GFP-expressie is essentieel voor het nauwkeurig imaging de cytoskeletal structuren op de contact site van antigeen.</li>
	<li>Inzoomen op de geselecteerde cel en kies de regio van belang zijn voor het image worden gemaakt. De focus aanpassen zodat de x-y -vlak van de B-cel die zich het dichtst bij het dekglaasje aan in focus is.<ol>
<li>Om dit te doen, door het doel geleidelijk dichter naar het dekglaasje aan verplaatsen zodat de B-cel cytoskeletal structuren naar voren komen en vervolgens gaan onscherp. Vervolgens geleidelijk de doelstelling in de tegenovergestelde richting totdat de B-cel cytoskeletal structuren eerst in focus terugkomt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimaliseer de instellingen met inbegrip van de macht van de laser, excitatie lichtbundel en detector bereik. Begin met de instellingen die zijn aanbevolen door de instructies van de fabrikant. Dan pas zo nodig voor het optimaliseren van het signaal voor de monsters. Het imago van alle monsters worden vergeleken aan elkaar met dezelfde instellingen.</li>
	<li>Onder het tabblad "verwerven" van de software instellen de Beeldacquisitie sequentiële frame overname in het lagere linker "Sequentiële scannen" paneel door de optie "tussen frames".</li>
	<li>Stel de volgorde van de overname. Opmerking: We krijgen het GFP-fluorescentie eerst om te voorkomen dat de aantasting van het GFP-signaal. Afhankelijk van de combinatie van fluorophores die naast GFP worden gebruikt, kan de langere golflengte fluorescentie signaal imaging eerst betere resultaten opleveren. De volgorde waarin de fluorophores of fluorescerende eiwitten zijn onderworpen aan de gestimuleerde emissie uitputting en beeld moet echter worden geoptimaliseerd om de sterkste fluorescentie signalen en beste resolutie te verkrijgen.</li>
	<li>Selecteer en stel de STED laser macht voor elke fluorophore onder het tabblad "Verwerven" van de software, en gebruik de schuifbalk voor de 592-nm of de 660 nm STED laser aan te passen de kracht van de laser. Pas de macht voor de 592-nm uitputting laser voor GFP en Alexa Fluor 532. De kracht voor de 660 nm uitputting laser voor Alexa Fluor 568 aanpassen.</li>
	<li>Verhogen van de resolutie en verminderen het signaal van de achtergrond, ga naar de "Overname" instellingen onder het tabblad "Verwerven" van de software, de lijn en/of frame gemiddeld door het selecteren van een waarde groter dan 1 met behulp van het drop-down menu voor elke optie te verhogen.</li>
	<li>Ook het verwerven van het fluorescerende signaal tijd-gated STED via de gating optie voor de fluorophore onder het tabblad "Verwerven" te controleren en waarden opgeven voor de tijd-gating (zie hieronder nota). Verhoog het vermogen laser STED ter verbetering van de resolutie, hoewel dit ook photobleaching van de fluorophores zal verhogen. Opmerking: De gating tijd moet worden geoptimaliseerd voor de Microscoop, monster en fluorophores wordt gebruikt. Een tijd gating van 0,3 tot en met 6 ns wordt aanbevolen. Na fixatie is GFP bijzonder gevoelig voor de laser van de hoge macht. Verklein de photobleaching van GFP en tijd gating moet worden toegepast en de kracht van de laser STED verlaagd moet worden.</li>
	<li>3D STED beelden vastleggen, gebruikt u de schuifregelaar naar het punt wijzigen verspreid functie (PSF) aan "3D STED".</li>
	<li>Handmatig meerdere afbeeldingen zodat de reproduceerbaarheid te verwerven. Deconvolve de beelden (Zie Figuur 1) met behulp van een deconvolutie software pakket41(Zie Tabel van materialen).</li>
</ol>

<ol><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).</li>
<li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li>
<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+B+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li>
<li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+who%2C+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts%3A+Synapses+and+Kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Self+Nonself%22%5BJournal%5D)">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li>
<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311(2010).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873(2009).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunter+to+gatherer+and+back%3A+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+B+cells+capture%2C+process+and+present+antigens%3A+a+crucial+role+for+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li>
<li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk%3A+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li>
<li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li>
<li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li>
<li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li>
<li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%2BTIPs+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li>
<li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li>
<li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li>
<li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Lymphocyte+Migration%3A+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586(2015).</li>
<li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap+GTPases+regulate+the+migration%2C+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li>
<li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology%2C+immune-synapse+formation%2C+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li>
<li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion%2C+cell+spreading%2C+actin+polymerization%2C+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li>
<li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li>
<li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li>
<li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li>
<li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li>
<li>Yuseff, M. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuss%2C+JC+%22The+Image+Processing+Handbook%2C+Sixth+Edition%22">The Image Processing Handbook, Sixth Edition</a>. , CRC Press. (2011).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li>
<li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gedetailleerde beelden van cytoskeletal structuren kunnen worden verkregen met behulp van STED super resolutie microscopie, wat theoretisch van een oplossing van 50 bereiken kan nm, in vergelijking met conventionele confocale microscopie, waarvoor de diffractie-beperkte resolutie ~ 200 is nm 24. de mogelijkheid om op te lossen fijnere structuren wordt verder verbeterd deconvolutie door software te gebruiken voor het berekenen van de meest waarschijnlijke positie van de oorspronkelijke lichtbron va...

Wanneer B cellen binden aan gepolariseerde arrays van antigenen (bijvoorbeeldweergegeven op het oppervlak van het antigeen-presenteren cellen (APCs)), de resulterende B-cel receptor (BHG) signalering stations de vorming van een klassieke immuun synapse structuur die werd voor het eerst beschreven in T cellen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Aanvankelijk, microclusters van antigeen-gebonden vorm van de BCRs aan de rand van de B-cel: APC contact site. Deze microclusters wordt vervolgens verplaatst naar het midden van de antigeen contact site, waar ze in een centrale supramoleculaire activering cluster (cSMAC samensmelten) de kern van de immuun SYNAPS vormt. Immuun synapse formatie optimaliseert BHG signalering en faciliteert het BCR-gemedieerde antigeen extractie van de APC membraan14. Deze overname van antigeen, die wordt gevolgd door antigeen BCR-gemedieerde internalisering en latere antigeen processing, kunt B cellen te presenteren peptide: MHC II complexen naar T-cellen en T-cel help14uitlokken. Omdat immuun synapse formatie B cel activatie bevordert, ophelderen van de mechanismen die stellen dat dit functionele patroon van receptor organisatie kan bieden nieuwe zijn inzichten in hoe humorale immuunreacties gestart en wordt geregeld.
Reorganisatie van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons is essentieel voor immuun synapse formatie. Gelokaliseerde BHG signalering gestimuleerd door een ruimtelijk-gepolariseerde scala aan antigenen induceert snelle en dramatische remodelleren van de actine cytoskelet1,15. De vorming van dendritische actine structuren aan de rand van de B-cel oefent duwen krachten op het plasma-membraan en bevordert de verspreiding van de B-cel. Dit maakt de B-cel voor het scannen van een grotere ruimte van de antigeen-steunvlak, en verhoogt het aantal BCRs dat antigeen te binden en te activeren BHG signalering trajecten. Op hetzelfde moment zijn de MTOC en het netwerk van microtubuli omgebogen naar de site van antigeen contact. Als de MTOC de contact site van antigeen nadert, uitbreiden microtubuli die afkomstig zijn van de MTOC langs de binnenzijde van het plasma-membraan op het raakvlak tussen de B-cel en de antigeen-dragende oppervlak16,17 Deze juxtamembrane microtubuli kunnen vervolgens fungeren als tracks voor de dynein-gemedieerde centripetale beweging van antigeen-gebonden BHG microclusters18, wat leidt tot de vorming van een cSMAC.
De heroriëntatie en polarisatie van de MTOC naar de immuun SYNAPS vereist intact actine en microtubulus cytoskeletons en hangt vaak af van interacties tussen de corticale actine netwerk en microtubuli16,17, 19,20. Corticale actine-bindende eiwitten, zoals IQGAP1, kunnen het vangen van microtubuli door interactie met eiwitcomplexen dat de microtubulus plus-ends21 versieren. Deze dynamische complexen van plus-end bindende proteïnen bevatten EB1 en CLIP-170, die gezamenlijk worden aangeduid als microtubulus plus-einde bijhouden van eiwitten (+ TIPs)21,22. + TIPs aan de uiteinden van de microtubuli kunnen binden aan eiwitten die gekoppeld aan het plasma-membraan of de corticale actine cytoskelet zijn. Hierdoor treden genererende mechanismen (bijvoorbeeldhet min-uiteinde gericht verkeer van dynein cortically-verankerd langs de microtubuli) te oefenen trekken krachten op de microtubuli, en daarmee de MTOC verplaatsen. CLIP-170 kan binden aan de steigers actine-geassocieerde proteïne IQGAP123, en we hebben aangetoond dat zowel van deze proteïnen vereist voor het BCR-geïnduceerde MTOC polarisatie richting de immuun synapse17 zijn. Deze IQGAP1-CLIP-170 interactie kan een belangrijke rol bij de coördinatie van de verbouwing van het cytoskelet actine met de herpositionering van het netwerk van microtubuli in de B-cel immuun synaps.
Conventionele fluorescentie microscopie is gebleken dat de dramatische reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens de B-cel immuun synapse formatie2. Echter, deze aanpak niet het oplossen van kleine cellulaire structuren in detail toe te schrijven aan de limiet van de diffractie van licht, die, volgens Abbe de wet, afhankelijk van de golflengte van licht bestemd is tot verlichting van het monster en de opening van de objectieve24. Deze limiet diffractie Hiermee beperkt u de resolutie van conventionele lichte microscopen 200-300 nm in de laterale richting te 500-700 nm in de axiale richting25. Daarom, kleinere subcellular structuren, evenals de fijne details van de actine en microtubulus-cytoskeletons, kunnen alleen worden waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie. Elektronenmicroscopie beeldvorming van het cytoskelet is tijdrovend, harde monster fixatie en voorbereiding protocollen die biologische structuren kunnen veranderen, en is beperkt tot de antilichaam-gemedieerde detectie vereist. Het vermogen om immunokleuring en gelijktijdig afbeelding meerdere eiwitten of cellulaire structuren is een aanzienlijk voordeel van fluorescentie microscopie. Anderzijds uiting van fluorescerende fusion eiwitten in cellen kunt real-time imaging en is nuttig wanneer daadwerkelijke antilichamen voor immunokleuring de proteïne van belang niet beschikbaar zijn.
Recente technologische vooruitgang in super resolutie microscopie overwinnen van de grenzen van de diffractie van licht en de visualisatie van nanoschaal cellulaire structuren24toegestaan. Een dergelijke super resolutie microscopie techniek heet gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie. STED maakt gebruik van twee lasers, waar een laser prikkelt de fluorophore en een tweede laser met een donut-vormige patroon selectief onderdrukt de fluorescentie emissie rond de fluorophore. Dit vermindert de punt-spread-functie (schijnbare gebied) van een één fluorescerende deeltje en zorgt voor een sub diffractie limiet fluorescerende afbeelding25,26. Grondtoestand uitputting microscopie hanteert ook fluorescentie gebaseerde technieken te verwerven Super resolutiebeelden. De afbeelding verwerving en wederopbouw tijden zijn lang, er zijn echter slechts een beperkt aantal fluorophores die kunnen worden gebruikt, en de gelijktijdige high-resolution beeldvorming van meerdere cytoskeletal onderdelen is technisch uitdagend omdat handhaving actine en microtubulus structuren vereist verschillende fixatie procedures. Daarom STED heeft meerdere voordelen ten opzichte van elektronenmicroscopie en andere super resolutie microscopie nadert dat het biedt snelle Beeldacquisitie post-processing minimumvereisten heeft en maakt gebruik van de dezelfde fluorophores en kleuring technieken die worden gebruikt voor conventionele fluorescentie microscopie van vaste monsters26.
Nu al super resolutie microscopie hanteert voor het visualiseren van actine structuren in de immuun SYNAPS in natural killer (NK) cellen en T cellen26,27,28,29,30, 31. echter super resolutie beeldvorming van het cytoskelet van de microtubuli, alsmede de gecoördineerde reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens immuun synaps formatie, is slechts onlangs gemelde17. Wij STED microscopie gewend in afbeelding B-cellen die verspreid over coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antilichamen, die stimuleren BHG signalering en initiëren cytoskelet reorganisatie had gekregen. Bij het uitplaten op geïmmobiliseerdet anti-Ig antilichamen, ondergaan B-cellen dramatische actine-afhankelijke verspreiden, die de eerste gebeurtenissen recapituleert tijdens immuun synapse formatie. Bovenal bleek STED microscopie de fijne details van de dendritische ring van F-actine die vormen aan de rand van het immuunsysteem synapsen en toonde aan dat de MTOC, evenals de microtubuli die eraan verbonden zijn, dicht bij de antigeen contact site17was verhuisd. Deze microtubuli uitgebreid naar buiten naar de perifere ring van F-actine. Bovendien Multi-Color STED beeldvorming van verschillende combinaties van F-actine, tubuline, IQGAP1, en GFP-gelabeld CLIP-170 + TIPs toonden dat microtubulus plus-ends gekenmerkt door CLIP-170-GFP nauw verbonden met de perifere actine gevlochten en met IQGAP1, een corticale opname eiwitten17.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor imaging-de actine en microtubulus cytoskeletons in de immuun Synaps met behulp van microscopie STED. Deze methoden zijn geoptimaliseerd met behulp van de A20 lymfkliertest B-cel-lijn, die veel heeft gewerkt voor de studie BHG signalering en immuun synapse formatie17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. omdat commerciële antilichamen tegen CLIP-170 niet goed voor immunokleuring in eerdere experimenten werkte, we beschrijven in detail de uitdrukking van GFP-gelabeld CLIP-170 op de A20 cellen, samen met de protocollen voor het visualiseren van gelijktijdig maximaal kleuring drie cytoskeletal componenten of cytoskelet-geassocieerde eiwitten. Methoden voor het gebruik van STED microscopie naar afbeelding actine op NK-cel immuun synapsen zijn40eerder is beschreven. Hier, breiden we dit aan het verwerven van Multi-Color Super resolutiebeelden van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons in B cellen.
Een belangrijke overweging voor super-resolutie microscopie is met behulp van de juiste fixatie-procedures voor het onderhouden van cellulaire structuren en voorkomen van schade aan fluorescerende eiwitten. De fixatie en kleuring van de hier vermelde methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden GFP fluorescentie en hoge resolutie beeldvorming van de actine- en microtubulus-netwerken. Wanneer het uiten van fluorescente proteïnen, opgemerkt moet worden dat B-cellen meestal moeilijk zijn te transfect. Met behulp van dit protocol, 20-50% van de A20 express cellen meestal de transfected GFP fusieproteïne, en onder deze populatie de hoeveelheid eiwit expressie variabel. Niettemin, super resolutie beeldvorming van actine en microtubuli met behulp van de procedures die we beschrijven is heel robuust en afbeeldingen van hoge kwaliteit zijn gemakkelijk verkregen. Ondanks hun kleine formaat ten opzichte van de A20 cellen, laten we zien dat deze procedures kunnen ook worden gebruikt om het imago van het netwerk van microtubuli in primaire B-cellen die kort zijn geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS). We hebben aangetoond dat de LPS-geactiveerde primaire B cellen kunnen zijn transfected met siRNAs op relatief hoge rendement (dat wil zeggen, zodanig dat eiwit uitputting kan worden gedetecteerd door immunoblotting), waardoor ze een goed alternatief voor het gebruik van B cellijnen voor sommige studies 17.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 muis B-lymfoomcellen</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Muur B-cel lymfoom van Balb/c oorsprong dat een IgG-bevattend BCR op zijn oppervlak toont</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Verhit inactiveren bij 56 oC gedurende 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Vloeibaar, 10.000 eenheden</td></tr><tr><td>Aanvullende materialen voor primaire B-cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&micro;m cel zeef</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magneetkraal gebaseerde B-cel isolatiekit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Muis B-cel isolatiekit</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS van E. coli 0111:B4</td></tr><tr><td>B-cel activerend factor (BAFF)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Transfectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid dat CLIP-170-GFP codeert</td><td></td><td></td><td>Cadeau van Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); beschreven in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>Aanbevolen transfectiereagentia en apparatuur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofectiekit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor het mengen van de transfectiereagentia met het DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programma L-013 gebruikt</td></tr><tr><td>Falcon 6-well platen, TC behandeld, sterieel</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Bekleden van deksels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm diameter ronde #1.5 dekglas</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Vergelijkbaar product: Marienfield-Superior catalogus #117580</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Dissectie extra fijn splinter pincet</td></tr><tr><td>Falcon 12-well steriele weefsel polystyreen weefsel kweekplaat</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Geit-anti-muis IgG antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>Voor A20 cellen</td></tr><tr><td>Geit-anti-muis IgM antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>Voor primaire muis B-cellen</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Kleuren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% stockoplossing)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Verdun met PBS tot werkende concentratie</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (50% stockoplossing)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Verdun met PBS tot werkende concentratie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA), fractie V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-tubuline antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1:250 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532-geconjugeerd geit anti-konijn IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>1:100 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-geconjugeerd ftaloidine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>1:100 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Zonder DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscoop Glazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microscopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolutiesoftware</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td>Zie https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualiseren van de actine en microtubulus cytoskeletons in de b-cel immuun synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (sted) microscopie

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B-cellen die zich aan antigenen van de membraan-gebonden (bijvoorbeeldop het oppervlak van een antigeen-presenteren cel binden) vormen een immuun SYNAPS, een gespecialiseerde cellulaire structuur die B-cel receptor (BHG) signalering optimaliseert en BCR-gemedieerde antigeen acquisitie. Zowel de verbouwing van het cytoskelet actine en de heroriëntatie van de microtubuli-netwerk naar de contact site van antigeen zijn essentieel voor immuun synapse formatie. Verbouwing van het cytoskelet van actine in een dichte perifere ring van F-actine gaat gepaard met de polarisatie van het center microtubulus-organiseren naar de immuun synaps. Microtubulus plus-end bindende proteïnen, evenals corticale plus-einde opname eiwitten bemiddelen fysieke interactie tussen de actine en microtubulus cytoskeletons, waarmee ze op een gecoördineerde wijze worden gereorganiseerd. Het ophelderen van de mechanismen die dat besturingselement deze cytoskeletal reorganisatie, alsmede inzicht in hoe deze cytoskeletal structuren vorm immuun synapse formatie en het BHG signalering, nieuwe inzichten in de B-cel-activatie kan leveren. Dit heeft geholpen door de ontwikkeling van super resolutie microscopie benaderingen die nieuwe details van cytoskeletal netwerkorganisatie onthullen. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en transfected GFP-gelabeld microtubulus plus-end bindende proteïnen in B cellen. Om het model van de vroege gebeurtenissen in immuun synaps formatie, toestaan we dat B-cellen te verspreiden op coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antistoffen, die BHG signalering en cytoskelet remodeling initiëren. Wij bieden stapsgewijze protocollen voor het uitdrukken van GFP fusion proteïnen in cellen van de A20-B-lymfoom, voor het verspreiden van anti-Ig-geïnduceerde cel, en voor de daaropvolgende cel fixatie, immunokleuring Beeldacquisitie en afbeelding deconvolutie stappen. De hoge resolutie beelden verkregen met behulp van deze procedures kunnen men gelijktijdig visualiseren actine structuren, microtubuli, en de microtubulus plus-end bindende proteïnen die deze twee cytoskeletal netwerken kunnen koppelen.

Voor B-cellen verspreiden op geïmmobiliseerdet anti-Ig, biedt STED microscopie gebruikt in combinatie met deconvolutie software hogere resolutiebeelden van cytoskeletal structuren dan confocale microscopie. Dit blijkt duidelijk uit Figuur 1, waar de F-actine-netwerk werd gevisualiseerd met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven. Een vergelijking van de confocal en STED Super resolutiebeelden van hetzelfde voorbeeld toont aan dat de STED beelden va...

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Het algemene doel van dit protocol is om actine en microtubuli cytoskeletten bij de B-cel immuunsynapse te kleuren voor gestimuleerde emissie depletie, of STED microscopie, en het beeldvormen van hun structuur, organisatie in ruimtelijke relaties. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over cytoskelet organisatie tijdens B-cel activering, inclusief de reorganisatie van de actine en microtubuli cytoskeletten tijdens immuunsynapse vorming. Het belangrijkste voordeel van multi-kleur STED microscopie is dat het gelijktijdige beeldvorming van het actine cytoskelet, het microtubuli netwerk, en belangrijke cytoskelet geassocieerde eiwitten op nanometer schaal resolutie mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzichten kan bieden in B-cel activering, kan het ook worden toegepast op immuunsynapse vorming van andere immuuncellen zoals natuurlijke killer en T-cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode vinden dat het optimaliseren van de microscoop instellingen voor gelijktijdige beeldvorming en meerdere fluoroforen met behulp van STED enige oefening vereist. Het demonstreren van deze procedure samen met Jia en Madison zal Kate Choi en Caitlin Pritchard zijn.Begin met het centrifugeren van 2,5 keer 10 tot de 6de, A20 B-lymfoomcellen per elke transfectie, en hervat de cellen in 100 microliter transfectie reagens gesupplementeerd met één tot 2,5 microgram van het plasma DNA van belang. Meng de oplossingen voorzichtig en breng elke aliquot cellen over in individuele putjes van een zes-putjes plaat. Pas het volume in elke put aan tot twee milliliter met 37 graden Celsius compleet medium en plaats de cellen in een 37 graden Celsius incubator voor 18 uur.De volgende ochtend, dompel 1,5 18 millimeter ronde glazen deksels in 100% methanol en laat de deksels volledig drogen voor ongeveer 10 minuten. Plaats de gedroogde deksels in individuele putjes van een 12-putjes weefselkweekplaat en voeg 400 microliters geit anti-muis immunoglobuline G antilichaam toe in het centrum van elke deksel zodat er een bubbel ontstaat in het centrum en zich verspreidt naar de randen zonder te druppelen in de put. Incubeer de deksels bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Spoel vervolgens de deksels af met één milliliter steriele PBS per put, drie keer, om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Na de laatste wassing, bewaar elke deksel in één milliliter vers, steriele PBS tot cel zaaien. Wanneer de getransfecteerde cellen klaar zijn, verzamel ze in een 15 milliliter conische buis door centrifugatie en hervat de pellets in één milliliter gemodificeerd HEPES gebufferd zoutje aangevuld met FBS.Na het tellen, verdun de cellen tot een concentratie van twee keer 10 tot de 5de cellen per milliliter en gemodificeerd HEPES gebufferd zoutje plus FBS, en gebruik pincetten om elke deksel over te brengen op een stuk paraffine film. Voeg 250 microliters cellen toe aan elke deksel en incubeer de deksels bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten in het donker om de cellen te laten verspreiden over de anti-immunoglobuline G gecoate oppervlakken. Aan het einde van de incubatie, verwijder het overtollige zoutje van elke glijbaan en coat elke deksel met 350 microliters fixatief, zorg ervoor dat het hele oppervlak bedekt is.Na 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur, gebruik een micropipet om voorzichtig het fixatief van de rand van elke deksel te aspireren en was de deksels met 500 microliters permeabilisatie en blokkeer buffer. Vervolgens, permeabiliseer en blokkeer de cellen met 250 microliters verse permeabilisatie en blokkeer buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Vervolgens verwijdert u het overtollige buffer en labelt u de cellen met 50 microliters van de primaire antilichaam van belang gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de deksel drie keer met 500 microliters kleuring buffer per wasbeurt en voeg 50 microliters van de juiste secundaire antilichaam toe aan elke deksel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen van het secundaire antilichaam, voeg 10 microliters montage reagens toe aan een microscoopglas en monteer de deksels op individuele microscoopglazen, celzijde naar beneden. Laat vervolgens de glazen overnacht drogen in het donker voor beeldvorming de volgende dag.Om de cellen met STED microscopie te beeldvormen, zet eerst de STED microscoop aan. Activeer de lasers in de epifluorescentie verlichtingslamp en open de microscoopsoftware. Stel de parameters in voor de STED depletie lasers en laad het eerste monster op de microscoop.Gebruik de oculaire en focus handmatig op het monster om een cel met een matige GFP expressie te selecteren. Zoom in op de geselecteerde cel en selecteer het gebied van belang om te beeldvormen. Pas de focus aan zodat het XY vlak van de cel dat het dichtst bij de deksel is in focus staat.Controleer vervolgens, onder het tabblad Acquire van de software, de optie Between Frames in het paneel Sequential Scan om de beeldverwerving in te stellen op sequentiële frame verwerving. Stel de STED laser vermogen in voor elke fluorofoor en gebruik de schuifbalk om de laser vermogens aan te passen aan de fluoroforen die in het experiment worden gebruikt. Om de resolutie te verhogen en het achtergrondsignaal te verminderen, open de Acquisition instellingen en gebruik het dropdown menu om een waarde groter dan één te selecteren om de lijn en/of frame gemiddelde te verhogen.Controleer de optie voor het verkrijgen van elke fluorofoor en de specifieke waarden voor tijdsverkrijgen om het juiste fluorescerende signaal te verkrijgen voor tijdsgewogen STED en verhoog het STED laser vermogen om de resolutie te verbeteren. Het is van cruciaal belang om de verkrijgingstijd voor de microscoop monster en fluoroforen die worden gebruikt te optimaliseren om de resolutie te verbeteren zonder te veel van het fluorescerende signaal te verliezen. Verkrijg vervolgens handmatig meerdere beelden om de reproduceerbaarheid te garander

visualizing-actin-microtubule-cytoskeletons-at-b-cell-immune-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Hier illustreren we het protocol voor beeldvorming door twee kleuren STED nanoscopy de cytotoxische immuun synaps van NK-cellen samengevat op glas. Met deze methode krijgen we sub-100 nm resolutie van synapseiwitten en het cytoskelet.

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

We beschrijven hier een combinatie van de glas-ondersteunde lipide dubbellaagstechniek voor het vormen van immunologische synapsen met de superresolutie-beeldtechniek van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Het doel van dit protocol is gebruikers de nodige instructies te geven om deze twee technieken met succes uit te voeren.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Hierin beschrijven we twee benaderingen om celpolarisatie gebeurtenissen in B-lymfocyten te karakteriseren tijdens de vorming van een IS. De eerste, omvat de kwantificering van organel recruitment en cytoskelet herschikkingen op het synaptische membraan. De tweede is een biochemische benadering, om veranderingen in de samenstelling van het zwaartepunt te karakteriseren, die polarisatie ondergaat op het immuunsysteem Synapse.

Het bestuderen van organelle dynamica in B-cellen tijdens immuun Synapse vorming

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Dit protocol presenteert een workflow voor de voortplanting, differentiatie en kleuring van gekweekte SH-SY5Y-cellen en primaire hippocampusneuronen van ratten voor visualisatie en analyse van de mitochondriale ultrastructuur met behulp van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie.

Het gebruik van levende cel STED beeldvorming om de ultrastructuur van het mitochondriale binnenmembraan in neuronale celmodellen te visualiseren

Leer actine- en microtubulus-cytoskeletten visualiseren in de B-cel immuunsynaps met STED-microscopie. Deze methode biedt nanometerschaalresolutie voor het bestuderen van cytoskeletreorganisatie tijdens immuunrespons.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie (Video) | JoVE Journal

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

Meer video's verkennen