Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken
March 29th, 2018
Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.
Het algemene doel van deze procedure is om driedimensionale weergaven te genereren van fragmenten van placentale villusbomen die geschikt zijn voor de analyse van hun bevattende vasculaire netwerken. Deze methode kan ons helpen antwoord te geven op belangrijke vragen in ons veld, zoals waarom een kind mogelijk groeibeperkt is of welke stress en hoe ernstig de stress mogelijk is geweest die tot een vroeggeboorte heeft geleid. Het belangrijkste voordeel van onze procedure is dat we nu in staat zijn om heldere placentale villusboomweefsels immunolabel te geven en vervolgens hun vasculaire netwerken te visualiseren en die visualisaties te gebruiken om deze vasculaire netwerken te karakteriseren en te analyseren.
De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot vele diagnoses en therapieën, aangezien de meeste life sciences afhankelijk zijn van tweedimensionale histologische karakterisering. De procedure zal worden gedemonstreerd door mevrouw Valerie Schwenk, die de immunolabeling en clearing van het placentaweefsel zal uitvoeren, en vervolgens zal meneer Phillip Necaise het placentaweefsel dissecteren en ook de omgekeerde clearing van het weefsel uitvoeren. Om je voor te bereiden op de dissectie van de villusboom, spoel eerst het gevormde en gefixeerde placentaweefsel met fosfaat gebufferd zoutoplossing.
Plaats het vervolgens in een petrischaal op de tafel van een dissectiemicroscoop. Gebruik een scalpel en fijne pincetten om het placentaweefsel uit elkaar te scheuren om de villusboom te lokaliseren. Snijd vervolgens stukken van de villusboom van ongeveer vijf millimeter lengte uit en breng ze over in een microbuisje met één milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing.
Vervang de fosfaat gebufferde zoutoplossing door een verse en wacht 10 minuten met af en toe schudden. Vervang vervolgens de fosfaat gebufferde zoutoplossing door permeabiliseringsbuffer om het weefsel te permeabiliseren en niet-specifieke binding van secundaire antilichamen te blokkeren. Bewaar vervolgens gedurende 30 minuten.
Vervang vervolgens de permeabiliseringsbuffer door fosfaat gebufferde zoutoplossing met twee procent geitenserum met muis monoklonaal anti CD31 en konijn anti CK7. Laat het weefsel een nacht bij vier graden Celsius staan. Verwijder de volgende dag de resterende antilichamen met aanvullende wasbeurten met fosfaat gebufferde zoutoplossing met twee procent geitenserum.
Verwijder vervolgens de fosfaat gebufferde zoutoplossing met twee procent geitenserum en voeg dezelfde buffer toe, aangevuld met geiten anti-muis immunoglobuline G gekoppeld aan een groen fluorofoor en geiten anti-konijn immunoglobuline G gekoppeld aan een infrarood fluorofoor. Bewaar in het donker 30 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens het weefsel eenmaal met PBS-GS en bewaar het gelabelde weefsel in het donker bij kamertemperatuur tot clearing.
Was de monsters drie keer met PBS met tussenpozen van 10 minuten. Om het weefsel te dehydreren, verwijder de fosfaat gebufferde zoutoplossing en voeg 50% ethanol toe aan het weefsel en incubeer gedurende 10 minuten. Na incubatie, gooi weg en was vervolgens drie keer met 70% ethanol met tussenpoizen van 10 minuten gevolgd door drie wasbeurten met 100% ethanol met tussenpoizen van 15 minuten.
Gebruik vervolgens fijne pincetten om het weefsel over te brengen naar een microbuisje gevuld met één milliliter oplossing een voor vier uur. Na vier uur, breng het weefsel over naar een microbuisje gevuld met oplossing twee en incubeer gedurende nog eens vier uur. Gebruik fijne pincetten om het weefsel in een Sykes-Moore Chamber te monteren door een rubberen afdichting in de basis op de dekselafdichting te plaatsen.
Gebruik opnieuw de fijne pincetten om een rubberen afdichting in de basis op de dekselafdichting te plaatsen. Verwijder het in oplossing twee ondergedompeld weefsel en plaats het op het midden van de dekselafdichting. Voeg vervolgens een druppel oplossing twee, ongeveer 40 microliters, toe aan het weefsel.
Neem vervolgens een tweede dekselafdichting en plaats deze op de afdichting. Druk vervolgens de dekselafdichting en de afdichting stevig samen door een vergrendelingsring in de bovenkant van de basis te draaien. Steek vervolgens een 25 gauge naald door de afdichting in de poort op de basis.
Vul vervolgens een drie milliliter spuit met één punt vijf milliliter oplossing twee. Monteer vervolgens een 25 gauge naald op de spuit en steek de naald in het tegenovergestelde poortje door de afdichting heen. Begin vervolgens met het injecteren van de kamer met oplossing twee en controleer of de lucht in de kamer door de andere 25 gauge naald wordt afgevoerd.
Wanneer de kamer vol is, verwijder de naald en de spuit en plaats de Sykes-Moore kamerhouder op het confocale microscoopplatform. Gebruik een 10X objectief om het weefsel dat op de kamer is geplaatst te focussen. Stel vervolgens een referentiepunt voor de fase in en beweeg de microscoopfase op en neer door het focale vlak om de boven- en onderkant van het weefsel te identificeren en in te stellen.
Stel de stappengrootte in op twee punt vijf micrometer en verzamel een confocale beeldbestand met een set beelden van het weefsel van boven naar beneden. Breng vervolgens het weefsel over naar een microbuisje met meer dan 20 keer het volume van 100% ethanol om de clearing om te keren. Vervolgens, vervang elke uur met 70 en vervolgens met 50% ethanol en tenslotte fosfaat gebufferde zoutoplossing.
Bewaar op vier graden Celsius in het donker tot inbedding. Hier, om het placentale vasculaire netwerk te tonen, zijn zowel microscopische als confocale microscopische beelden van een menselijke placenta verkregen. Deze microscopische beelden van de placenta tonen de stralende villusboom die het placentale parenchym zijn binnengedrongen.
Deze microscopische beelden tonen de aanwezigheid van een distale portie van stukken villusboom die eindigt in de cluster van villi. Om vervolgens de trofoblastlaag van de villus te tonen, werd de distale portie van de villusboom immunolabel gegeven. In de afbeelding is de buitenste trofoblastlaag groen weergegeven en zijn de haar
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het genereren van driedimensionale weergaven van fragmenten van de placentale villousboom geschikt voor vasculaire netwerkanalyse. De methode is bedoeld om belangrijke vragen te beantwoorden met betrekking tot groeirestrictie bij kinderen en vroeggeboorte.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van vasculaire netwerken in de placenta is cruciaal voor het bestuderen van groeirestricties.
- Tweedimensionale histologische karakterisering is beperkt in het verschaffen van inzichten.
- Immunomerktechnieken en clearingtechnieken verbeteren de visualisatie van vasculaire structuren.
- Deze studie heeft tot doel diagnostische en therapeutische benaderingen in de levenswetenschappen te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het analyseren van vasculaire netwerken in placentaweefsel.
- Om factoren te onderzoeken die bijdragen aan groeirestricties en vroeggeboorte.
- Om een duidelijker begrip te geven van placentale vascularisatie.
Gebruikte methoden
- Reversibele clearing van placentale villousmonsters.
- Immunokleuring om vasculaire netwerken te labelen.
- 3D-rendering van gecleard weefsel voor visualisatie.
- Dissectie en omgekeerde clearing van placentaweefsel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van vasculaire netwerken in placentaweefsel.
- Verbeterd begrip van de structurele organisatie van placentale vatstelsel.
- Mogelijke implicaties voor het diagnosticeren en behandelen van groeigerelateerde problemen.
- Demonstratie van de procedure door getraind personeel.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt gedetailleerde analyse van placentale vasculaire netwerken mogelijk.
- Deze techniek kan leiden tot vooruitgang in het begrijpen van placentagezondheid.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om kritische gezondheidskwesties aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables detailed three-dimensional analysis of placental vascular networks, supporting mechanistic de-risking in maternal-fetal medicine by clarifying structural determinants of fetal growth restriction and preterm birth. It provides a disease-relevant system for evaluating vascular integrity under pathophysiological conditions such as diabetes, hypertension, and obesity. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking placental microstructure to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular architecture as a therapeutic target in placental insufficiency.
- Operational Value: Provides quantitative structural metrics such as branch points and volume for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible vascular network readouts for compound screening in placental models.
- Operational Value: Supports assay scalability through reversible clearing and multiplex immunostaining of endothelial and trophoblast markers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving human placental tissue architecture for preclinical continuity.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vascular phenotypes with maternal metabolic stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of vascular targets, progresses to screening via standardized 3D vascular phenotyping, and supports translational research through preserved tissue integrity and biomarker-compatible labeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of vascular targets in placental disease models.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible vascular network metrics from cleared tissues.
- Analytics: Generates measurable outputs including capillary volume, branch number, and end points for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation via human tissue relevance and immunohistochemical fidelity post-clearing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for vascular phenotyping across gestational and disease-state placental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vascular target validation through direct structural phenotyping.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via reversible clearing and synchronized immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in maternal-fetal therapeutics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular network integrity in disease-relevant placental models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in placental pathology, immunofluorescence labeling, and confocal microscopy.
- Dependent on tissue clearing infrastructure, Sykes-Moore chambers, and reversible ethanol-based clearing solutions.
- Necessitates cross-team standardization for consistent immunolabeling of CD31 and CK7 across laboratories.
- Involves adaptation considerations for varying placental tissue quality and gestational age.
- Limited by tissue size constraints (~1–2 mm³) and clearing depth (~1 mm) affecting network capture completeness.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
Villous Tree Dissection and Immunofluorescent Staining
3:16
Clarification of the Tissue
4:07
Mounting for Microscopy and Confocal Microscopy
6:04
Reversing the Clearing
6:33
Results: Use of Confocal Microscopy, Immunostaining, and Reverse Clearing to Analyze the Vascularization of Placental Network
8:21
Conclusion
