Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in translationeel onderzoek, zoals de kans om biomarkers te bestuderen bij patiënten uit ontwikkelingslanden. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om bloed- en serummonsters minimaal twee weken op te slaan zonder in te vriezen en hoogwaardig materiaal te leveren voor downstream-analyses zoals qPCR en ELISA. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van ziekten zoals kanker en infectieziekten.

Deze methode kan ook worden toegepast op diagnostische of onderzoeksgebieden, zoals de studie van prenatale ziekten of de analyse van infectieuze pathologie zoals HIV. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we biomarkers vergeleken tussen een caucasische en een Afrikaanse casuseserie waarvoor bevroren monsters niet beschikbaar waren. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de bloedaanbrengstappen moeilijk te leren zijn.

Bij deze procedure wordt drie milliliter bloedmonster in een buis van drie milliliter verzameld met 5,4 milligram EDTA. Schrijf het patiëntcodenummer op de rechteronderhoek van de saver card. Breng het bloed voorzichtig opnieuw in suspensie met een pipet van vijf milliliter.

Pipet vervolgens een druppel bloed op de saver card. Gebruik voor elke bloedaliquot een nieuwe tip en herhaal het aanbrengen om in totaal drie tot vijf bloedvlekken te verkrijgen. Laat de gedroogde bloedvlekken, of DBS, een nacht lang drogen bij kamertemperatuur met het deksel van de saver card open in een horizontale positie over een open, niet-absorberend oppervlak en vermijd direct zonlicht.

Bewaar de kaart de volgende dag bij kamertemperatuur in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik. DNA wordt geëxtraheerd uit drie gedroogde bloedvlekken van de saver card. Begin met het afsnijden van elk van de DBS van de kaart en scheid ze van de kaart.

Snijd de gescheiden DBS in kleine stukjes van ongeveer een millimeter in diameter. Plaats de kleine stukjes van een DBS in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg voor het verteren van de monsters aan de buis 180 microliter lysisbuffer toe uit een commercieel verkrijgbare DNA-extractiekit, en voeg vervolgens 20 microliter proteïnase K toe. Mix door te vortexen.

Plaats de buis in een thermo-incubator en incubeer met schudden gedurende 60 minuten bij 56 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de buis kort om druppels van het deksel te verwijderen. Begin met wassen door 200 microliter lysisbuffer twee toe te voegen en gedurende 10 seconden te vortexen.

Plaats de buis in een thermomixer en incubeer gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius. Plaats de elutiekolom in een nieuwe verzamelbuis van twee milliliter en gooi de oude weg. Voeg 500 microliter wasbuffer toe en centrifugeer gedurende één minuut bij 6000 keer zwaartekracht.

Plaats de kolom in een nieuwe verzamelbuis van twee milliliter en gooi de oude weg. Voeg 500 microliter wasbuffer twee toe en centrifugeer gedurende één minuut bij 6000 keer zwaartekracht. Plaats de kolom in een nieuwe verzamelbuis van twee milliliter en gooi de oude weg.

Centrifugeer gedurende drie minuten bij 20.000 keer zwaartekracht om de membraan te drogen. Om het DNA te elueren, plaats de kolom in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter en gooi de verzamelbuis weg. Plaats 50 microliter gedistilleerd water op het midden van de membraan en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 20.000 keer zwaartekracht. Verzamel het eluaat en plaats het opnieuw op het midden van de membraan. Centrifugeer de buis opnieuw gedurende één minuut bij 20.000 keer zwaartekracht.

Gooi de membraan weg. Nadat de DNA-concentratie is gemeten met behulp van een spectrofotometer, bewaar het DNA bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Voor deze procedure wordt eerst zeven milliliter perifeer bloedmonster verzameld in een buis van zeven milliliter zonder EDTA.

Laat het bloedmonster 30 minuten bij kamertemperatuur coaguleren. Schrijf het patiëntcodenummer op de rechteronderhoek van de saver card. Centrifugeer het bloedmonster gedurende 15 minuten bij 1100 keer zwaartekracht bij kamertemperatuur.

Verwijder het supernatant uit de buis en breng het over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Breng het bloed voorzichtig opnieuw in suspensie met een pipet van vijf milliliter. Pipet en breng een druppel serum op de saver card over.

Herhaal het aanbrengen om in totaal drie tot vijf bloedvlekken te verkrijgen. Laat de gedroogde sere vlekken een nacht lang drogen bij kamertemperatuur met het deksel van de saver card open. Bewaar de kaart de volgende dag bij kamertemperatuur in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik.

Als de opslag langer is dan 14 dagen, bewaar bij min 20 graden Celsius. Bereid de ELISA-test voor door de DSS voor elk monster te ontdooien indien nodig. Om het eiwit uit de DSS te elueren, snijd een DSS in kleine stukjes van ongeveer een millimeter in diameter en plaats de stukjes in een buis van 1,5 milliliter.

Voeg vervolgens vier microliter PBS toe. Schud de monsters met lage snelheid bij vier graden Celsius gedurende een nacht. Gebruik op de volgende dag een geschikte verdunning van het eiwit eluaat als serummonster voor secretie-eiwit- of groeifactoranalyse met behulp van een commercieel verkrijgbare kit.

In dit protocol werden bloed- en serummonsters opgeslagen als gedroogde vlekken op filterpapier bij kamertemperatuur. Een representatieve proteïn saver card wordt getoond vóór en na de bloedafname. Om te bevestigen dat de opslag op filterpapier en de procedure om bloed te elueren geen invloed hebben op de monsterkwaliteit, werden ELISA-tests voor vitamine D-bindend eiwit, of DBP-niveaus, uitgevoerd op acht monsters van serum die in een buis van twee milliliter werden verzameld en onmiddellijk bij min 80 graden Celsius werden bewaard of als gedroogde serumvlekken werden verzameld.

De variatiecoëfficiënt, of CV, tussen overeenkomstige monsters varieerde