Name: Een gravende/Tunneling Assay voor het opsporen van hypoxie in Drosophila melanogaster larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer een gravende/tunneling assay om hypoxie in Drosophila melanogaster larven te detecteren onder normale atmosferische omstandigheden. Deze methode onderscheidt hypoxische larven van andere mutanten met vergelijkbare fenotypes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Karen M. Qiang was de 2016-ontvanger van de George J. Schroepfer Research Award aan de Rice University. Fanli Zhou is de ontvanger van een Teaching Fellowship van de Universiteit van de rijst. De diensten van de Bloomington Drosophila voorraad Center, de Harvard reis faciliteit, het Wenen Drosophila Resource Center worden dankbaar erkend.

1. voorbereiding van de larven
<ol><li>Twee of meer dagen voor het begin van de test, instellen kruisen van de gewenste experimentele en controle combinaties (minimum 20 vrouwen en 10 mannen elke) in ei-lay gerechten zoals beschreven door Wieschaus en Nusslein-Volhard 13 maar met behulp van 50 mL polypropyleen bekers en 6.0 cm wegwerp petrischalen met druiven agar en besmeurd met gist plakken net voor gebruik. Houden vliegen in ei-lay gerechten in duisternis bij kamertemperatuur totdat het nodig is.</li>
	<li>Druif agar recept – combineren 100 mL bevroren 100% druivensap sap concentraat, 350 mL deioinized water, 5 mL ijsazijn azijnzuur en 13 g D. melanogaster agar in een bekerglas van 1 L glas. Magnetron in 1-2 min uitbarstingen, roeren tussen uitbarstingen, tot agar is allemaal opgelost. Koel de oplossing gedurende een paar minuten en voeg dan 10 mL 10% (m/v) van Nipagen (methyl-p-hydroxybenzoaat) in 95% ethanol. Mix en Pipetteer 7 mL per plaat in wegwerp 6.0 cm petrischalen, laat de gel en drogen bij kamertemperatuur voor 3-4 h. winkel op 4 0C in plastic zakken.</li>
	<li>Gist plakken recept-7 g gedroogde gist, 10 mL gedeïoniseerd water, meng met een spatel tot uniforme consistentie.</li>
	<li>Getimede ei collecties te genereren experimentele en de controle van de larven. Met nieuwe, gist-besmeurd, druif platen, verzamel eieren bij kamertemperatuur gedurende 4 uur in duisternis tijdens de ochtenduren. Deze 4 h collectie platen verwijderen en vervangen door verse platen. Incubeer de platen collectie 4u 's nachts bij 25 0C tot de middag voor de volgende dag, wanneer de meeste van de larven zal zijn uitgekomen. Deze eerste instar-larven te verzamelen en ze gebruiken om het opzetten van het experiment.</li>
</ol>2. het opzetten van assay platen
<ol><li>Voorbereiding van assay platen. Bereiden voor een enkele run van de bepaling, vijf assay platen elke van 10 experimentele larven en vijf platen van 10 controle larven. Gebruik een 1,5 cm kurk borer te verwijderen van een centrale kern van agar van elke plaat maken een gat voor het eten. Gist plakken (0.8 - 0.9 g) gestoken in het gat en DEP zachtjes met een spatel om een heuvel het gat te vullen.</li>
	<li>Agar plaat voorbereiding – 700 mL gedeïoniseerd water combineren met 16 g D. melanogaster agar in een bekerglas van 2 L glas en magnetron voor 5 min. verwijderen van magnetron en roeren met een roerstaaf om onopgeloste agar in de oplossing. Voeg 17,5 mL 10% (m/v) Nipagen in ethanol van 95%, mix, dan blijven magnetron Verwarming in 30 s uitbarstingen gevolgd door roeren, totdat alle agar volledig is opgelost. Cool voor een minuut of twee, Pipetteer vervolgens 15 mL aliquots in plastic petrischaaltjes van 10 cm. Toestaan agar gel, dekking van de platen met deksels en laat ze drogen bij kamertemperatuur voor een paar uur of 's nachts. Platen worden opgeslagen in verzegelde plastic zakken bij 18 ° C. Opmerking 1: Voorkom de vorming van Nipagen kristallen op het oppervlak van de platen te wijten aan de overtollige dessiccation, platen binnen een paar dagen van voorbereiding te gebruiken. Indien nodig, kunnen de kristallen opnieuw worden ontbonden door een paar microliters van 95% alcohol op hen neer te zetten. Opmerking 2: batches van agar kunnen verschillende gelerend eigenschappen hebben. De droge gel platen moeten stevig aan en voldoende veerkrachtig dat een schone, intact cirkel agar kan worden verwijderd wanneer u de kurk borer om het voedsel gat (zie hierboven) te maken.</li>
	<li>Het opzetten van larven in assay platen. Mechanische druk kunt op het puntje van een plastic microspatula van de kromme en dompel de tip in gist plakken om te voorzien in "lijm" oppakken van larven. Eerste instar-larven individueel halen en leg ze op de agarplaat dichtbij de heuvel van voedsel. Bereiden ten minste vijf repliceren platen van 10 larven voor beide experimentele- en controle genotypen. Zodra voltooid, cap en label van elke plaat en instellen van de platen (deksel kant naar boven) in een donkere ruimte bij kamertemperatuur (dit is in ons lab 22 ° C).</li>
</ol>3. monitoring assay platen
<ol><li>Platen dagelijks onder een ontleden Microscoop onderzoeken en registreren het aantal larven op de top van het levensmiddel of op het oppervlak van de agar. Opmerking elke zichtbare dood of stervende larven. Opmerking Wanneer, als, tunneling in de agar substraat wordt gezien als larven verhuizen naar derde instar. Opmerking datums waarop poppen beginnen te vormen en noteer eventuele pop afwijkingen. Dagelijkse waarnemingen blijven totdat alle larven gestorven of pupated.</li>
	<li>Verwijder poppen zorgvuldig van de plaat met een gebogen plagen naald en overdracht aan een druif plaat. Indien gewenst, blijven volgen poppen om te bepalen hoeveel eclose als volwassenen.</li>
</ol>4. voorbereiding assay platen voor imaging
<ol><li>Verwijder voorzichtig en gooi alle gist voedsel uit de centrale put van elke plaat.</li>
	<li>Zachtjes overstromen elke plaat met leidingwater en een zachte kunstenaar kwast kunt zorgvuldig afwrijven puin dat op het oppervlak van de agar heeft zijn bijgehouden. Vervang het water meerdere keren en blijven zachte borstelen totdat elke plaat helemaal schoon is. Geef platen een laatste spoeling met gedeïoniseerd water, cap hen en verlaten bij kamertemperatuur drogen overnachting. Opmerking: Meest intense rond de heuvel van voedsel in de agar onder tunneling wordt (zie figuur 2). Dientengevolge, is de rand van het gat eten meestal uitgebreid buiten de eerste 1,5 cm diameter. Bovendien kan de kwetsbaarheid van de gewerkte agar in deze regio veroorzaken kleine stukjes getunnelde agar te zijn van de omtrek van het gat verloren gaan tijdens het reinigen. Het verhogen van de concentratie van de agar gel kan helpen met deze problemen, maar correcties zijn mogelijk tijdens de afbeelding J kwantificatie stappen (zie hieronder).</li>
</ol>5. kwantificatie van tunneling
<ol><li>Het imago van de platen. Een afbeelding van elke plaat genomen tegen een zwarte achtergrond zodat de tunnels in de agar weergeven als heldere witte lijnen voor te bereiden. Opmerking: We gebruiken een systeem dat vaak wordt gebruikt om het imago van DNA gels voor deze stap (Zie tabel van materialen en reagentia). Alternatief beeldvormende systemen geschikt voor het genereren van TIFF-bestanden, zoals digitale camera's of mobiele telefoon camera's kan produceren geschikt beelden worden aangepast.</li>
	<li>Het publieke domein programma NIH afbeelding J te kwantificeren larvale tunneling gebruiken. Het programma downloaden van http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Ga naar http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html voor meer informatie over het programma. Opmerking: Andere beeldvormende systemen kunnen worden gebruikt om het kwantificeren tunneling. De onderstaande instructies gelden voor NIH afbeelding J.</li>
	<li>Na het openen van een TIFF-bestand-afbeelding van een tunneling plaat, gebruikt u het gereedschap Ovaal om een gebied voor kwantificatie die vertegenwoordigt het gehele agar oppervlak maar dagzoomt de kunststof rand van de plaat te definiëren.</li>
	<li>Toepassing van de automatische drempel voor de productie van een omgekeerde afbeelding van de plaat met de tunnels als zwarte lijnen weergegeven. Gebruik de Plukker van de kleur en penseel hulpmiddelen wit uit zwarte gebieden die schade aan de agar in plaats van tunnels vertegenwoordigen.</li>
	<li>Selecteer onder het analyseren pull-down menu, Set schaal | Klik om dit te verwijderen van de schaal en controleert u het venster instellen van metingen (ook onder Analyze) gebied en limiet aan de drempel.</li>
	<li>Druk op toets van de Cntrl + M-toets om het zwarte gebied (tunnels) in pixels weergeven.</li>
	<li>Kopiëren en plakken is de waarde in pixels voor elke plaat naar een spreadsheetprogramma (zoals Excel) die kwantitatieve analyse mogelijk zal maken.</li>
	<li>Het centrale gat is meestal uitgebreid als gevolg van intense tunneling in deze regio. Om te kwantificeren de ontbrekende tunneling, uncheck "Beperken tot drempel" en het gereedschap Toverstaf gebruiken om te definiëren van het centrale gat. Druk op de toets van de Cntrl + M-toets om de pixelwaarde van dit gebied te verkrijgen. Aftrekken van deze waarde de pixelwaarde van een 1.5 cm gat en het verschil met de verkregen in stap 5.6 tunneling waarde toe te voegen.</li>
	<li>Voor sommige platen, kan het centrale gat worden ontbreekt een stuk getunnelde agar waarin een regio untunneled agar grenzend aan het gat. Wanneer quantitating het centrale gat voor het gebruik van deze platen borstel de Plukker van de kleur en Paint hulpprogramma's voor het toevoegen van een zwarte balk over de ontbrekende regio definiëren de getunnelde regio en het gebied van niet-tunnelverbinding uitsluiten kwantificatie. Opmerking 1: Als de experimentele larven een tunneling uitvoeren, toegestaan deze kwantificatie berekening van de gemiddelde waarden voor verzamelingen van platen en statistische vergelijking van controle en experimentele tunneling.</li>
</ol>

<ol><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+responses+to+oxygen+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li>
<li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/22/19/6842.full">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li>
<li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534649/">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li>
<li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li>
<li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17998052">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li>
<li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+hypoxia-induced%2C+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li>
<li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4975476/">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233(2016).</li>
<li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2754235/">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19818339">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li>
<li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15159437">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li>
<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3127060/">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li>
<li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+E+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).</li>
<li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/216/23/4334">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23382692">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230(2013).</li>
<li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark%5BTitle%5D)+AND+%22Scient.+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier hebben we een eenvoudige test ontworpen voor het opsporen van weefsel hypoxie in D. melanogaster larven gepresenteerd. Diagnose is gebaseerd op de verminderde gravende in voedsel terpen in larvale jeugd en de afwezigheid van substraat tunneling laat in het larvale leven. Larvale verdringing kan leiden tot vroegtijdige migratie uit de buurt van een bron van voedsel en een kritische aspect van de test is dus dat een klein aantal larven worden bepaald in aanwezigheid van een grote overtollig voedsel. Integratie van het fungicide methyl-p hydroxyl benzoaat (Nipagen) in de agar-platen is ook essentieel om te voorkomen dat schimmel groei tijdens de test.
Wij vinden dat de agar platen een bron van variabiliteit in de test kunnen. Larven van de dezelfde genotype, vanuit verschillende batches instellen van ouders of vanuit verschillende collecties van larven, tonen meestal relatief beperkte variatie in hun gedrag in de bepaling. In tegenstelling, agar platen gemaakt op verschillende dagen of met verschillende batches instellen agar verschillen bij tunneling kunnen opleveren. Een eis is daarom dat besturingselement en experimentele larven moeten allemaal worden getest met behulp van agar platen uit de dezelfde batch voorbereiding. Agar van verschillende fabrikanten of zelfs verzendingen van de dezelfde vervaardiging kunnen variëren in hun gelerend kracht, en zo kan het nodig zijn om het aanpassen van de concentratie van de agar omhoog van de 2,2% hier gebruikt om een optimale gel. We hebben gevonden dat wild type larven gemakkelijk door 3% agar gels kunnen ingraven.
Om aan te tonen van de waarde van deze test, wij zijn gewend het onderzoeken van potentiële weefsel hypoxie in larven met onderdrukte functie van uninflatable in de tracheae. Onze bevindingen sterke ondersteuning biedt voor de hypothese dat verlies van tracheale uitdrukking van dit gen hypoxie produceren kan: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larven blijkt ingraven in voedsel en volledige afwezigheid van substraat tunneling tijdens de derde instar. In onze eerdere studies van andere genotypen, we waargenomen dat hypoxie-geïnduceerde verlies van voedsel gravende niet zo volledig verlies van het substraat tunneling en de btl is-Gal4 > UAS -uif RNAi larven studeerde hier op dezelfde manier gedragen. De mislukte tunneling component van deze bepaling biedt daarom de sterkste indicatie van hypoxie.
Hoewel de btl-Gal4 > uif RNAi larven toonde gedrags eigenschappen diagnostische van hypoxie, de gesneden(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi deed niet deze afwijkingen vertonen. De btl en gesneden(ue) stuurprogramma's worden uitgedrukt in verschillende stadia en in verschillende patronen, binnen het larvale tracheae Gal4. De btl-Gal4 bestuurder wordt uitgedrukt in de trachea systeem beginnen van haar ontwikkeling in embryogenese en verder door het larvale leven. In contrast, Gal4-expressie aan vanaf de gesneden(ue)-Gal4 bestuurder alleen begint aan het einde van embryonaal leven, na de morfogenese van het tracheae, en is beperkt tot de extreme posterieure secties van de dorsale stam, grote longitudinale vaartuigen van De tracheale systeem. UIF knockdown met deze Gal4-lijn mogen daarom niet verlagen voor uif expressie vroeg genoeg of breed genoeg voor de productie van sommige drempel van hypoxie nodig om te activeren het gedrag gemeten in deze test.
Een voorafgaande studie vond dat derde instar-larven blootgesteld aan lage (10%) zuurstofniveaus Toon verminderde groei en vertraagd begin van pupariation 14. De btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larven studeerde hier stapte over naar de derde instar, maar de gevolgen voor hun groei en verpopt tarieven waren meer uitgesproken: zij waren aanzienlijk kleiner dan besturingselementen met weinig vetweefsel onder de epidermis (Figuur 3) en slechts een kleine fractie (~ 10%) geprobeerd pupariation. Deze verschillen stellen voor de btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larven ervaren een grotere mate van hypoxie, omdat uif knockdown in de tracheae was aanwezig tijdens hun hele larvale leven, of omdat het een meer geproduceerd ernstige zuurstof ontbering in derde instar. Hoe verlies van uif functie in de tracheae misschien voorkomen dat zuurstoftransport is onduidelijk op dit punt. De tracheae van de btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larven waarneembaar door de cuticle (Figuur 3), een indicatie dat ze lucht opgenomen en niet tot het punt dat vloeibare vermelding gecompromitteerd functie werden beschadigd waren. Daarom is het formeel mogelijk dat de tracheale schade gemaakt door verlies van uif functie niet uitlokken doet hypoxie maar eerder enkele andere gebrek dat tunneling remt. Voor de genotypen studeerde eerder, vastbesloten wij dat niet-tunnel geassocieerd met verhoogde niveaus van LDH mRNA7, de canonieke indicator van de glycolyse en hypoxie in eind derde instar larven 15 wordt. Dus, definitieve bevestiging van hypoxie voor de btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larven (en larven onderzocht in de toekomst gebruik van deze test) zou betekenen dat RT-PCR voor de beoordeling van LDH mRNA niveaus of gebruik van een commercieel beschikbare indicator om te meten intracellulaire zuurstofniveaus (bijvoorbeeld Zie 16).

De geavanceerde matrix voor moleculaire genetische tools beschikbaar in D. melanogaster maken het een waardevolle organisme voor de studie van de evolutionair geconserveerde biologische processen. Belangrijke moleculaire reacties op de beschikbaarheid van zuurstof hebben bewezen te worden geconserveerd over evolutie en voorafgaande studies in D. melanogaster hebben gegenereerd inzichten in de universele componenten van deze trajecten 1,2, signalering 3,4,5,6.
Als onderdeel van een onderzoek gericht op het ontleden van sensorisch neuron functie in D. melanogaster larven, vastgesteld we twee gedrags reacties die bleek te worden geactiveerd door weefsel hypoxie op normale zuurstof niveaus 7. Een van deze, niet ingraven in voedsel, is sterk verwant aan het antwoord op de lage zuurstofniveaus gemeld door Wingrove en O'Farrell 8. Het tweede gedrag, niet-tunnel in een zachte onderlaag tijdens de late derde instar zwerven fase, had niet eerder geïdentificeerd als hypoxie-gerelateerde. Wij vastbesloten dat bloot wild type dolende larven te lage zuurstofniveaus ook remt substraat tunneling 7, dus tot de oprichting van dat zowel deze gedragingen zijn afkomstig uit hypoxie - hetzij door weefselbeschadiging of door inname van lage zuurstof veroorzaakt. Hier beschrijven we een bepaling die we hebben ontwikkeld om te kwantificeren van deze twee hypoxie-geïnduceerde gedragingen, die met opmerkingen onmiddellijk na het larvale uitkomen begint.
Hypoxische reacties in de vroege larvale stadia niet eerder onderzocht zijn en daarom het uitvoeren van een analyse larvale levenslange is een waardevol onderdeel van onze test. De meeste voor de hand liggende uitingen van hypoxie – trage ontwikkeling, slechte groei en motorische traagheid – overlappen met larvale fenotypen geproduceerd door vele mutaties. Maar wij hebben gevonden dat alleen derde instar-larven met hypoxie Toon een complete mislukking om te tunnelen 7. Dus vastbesloten wij dat zelfs larven meer gecompromitteerd in termen van groei en motoriek dan onze hypoxische larven, nog steeds uitgevoerd sommige tunneling, overwegende dat hypoxische larven nooit tunnelverbinding 7. Een ander waardevol onderdeel van deze test is dus dat het biedt een manier om vast te stellen wanneer hypoxie de bron van een bepaalde set van pleiotropic fenotypen, in tegenstelling tot sommige andere stress of metabole storing is. Als een demonstratie van de bepaling, hier beschrijven we het gebruik ervan in het karakteriseren van de antwoorden van larven met verminderde tracheale uitdrukking van uninflatable, een gen dat de functies in de larvale airways 9.
We denken dat deze test van waarde aan onderzoekers die zich bezighouden zijn zal met het karakteriseren van larvale fenotypen waarin slechte groei en trage gedrag. Als een resultaat, nieuwe genen die invloed hebben op de distributie, gebruik of reacties op, kan zuurstof door het lichaam worden geïdentificeerd. Verder, opneming van deze bepaling in een mutant screening protocol zou zorgen voor een directe route naar identificatie van mutaties die produceren van hypoxie. Deze test zal ook waardevol in het analyseren van de circuits die de hypoxie-geïnduceerde aangeboren gedrag hier beschreven lokt. Neuraal netwerkanalyse van dit type is een focus van veel huidige onderzoek en het eenvoudig zenuwstelsel van de larve van de D. melanogaster is een waardevolle systeem voor het ontleden van geautomatiseerde gedrag. Sensorische neuronen betrokken bij larvale zuurstof perceptie zijn reeds geïdentificeerd, bieden een eerste stap naar de volledige circuits voor hypoxie-geïnduceerde reacties 10,11te definiëren. Met behulp van onze assay in combinatie met selectieve neurale knockdown via de GAL4-UAS systeem12 is een duidelijke route uitgezet verdere onderdelen van het neurale netwerk.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gedroogde gist&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bevroren druivensap concentraat</td><td>Welch's</td><td></td><td>&nbsp;Verkrijgbaar bij de meeste grote supermarkten</td></tr><tr><td>Glazuur azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-para-hydroxybenzoaat</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen bekers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6,0 cm wegwerp Petri-schaaltjes</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 cm wegwerp plastic Petri-schaaltjes</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>Plastische microspatula's</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pluknaald</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td>Elke microscoop met 10-30X vergroting</td></tr></tbody></table>

een gravende/tunneling assay voor het opsporen van hypoxie in drosophila melanogaster larven

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Zuurstof ontbering in dieren kan voortvloeien uit blootstelling aan lage atmosferische zuurstofniveaus of van interne weefselschade die met zuurstof distributie interfereert. Het is ook mogelijk dat afwijkend gedrag van zuurstof-sensing neuronen hypoxie-achtig gedrag in het bijzijn van normale zuurstofniveaus kan induceren. In D. melanogaster, ontwikkeling op lage zuurstofniveaus leidt tot remming van de groei en trage gedrag tijdens de larvale stadia. Echter, deze gevestigde uitingen van zuurstof tekort overlappen aanzienlijk met de fenotypen van vele mutaties die regelen van groei, stress reacties of motoriek. Als resultaat is er momenteel geen test beschikbaar om te identificeren i) cellulaire hypoxie geïnduceerd door een mutatie of ii) hypoxie-achtig gedrag wanneer veroorzaakt door abnormale neuronale gedrag.
Onlangs hebben wij twee kenmerkende gedragingen in D. melanogaster larven die zich bij normale zuurstofniveaus in reactie op interne opsporing van hypoxie voordoen vastgesteld. Eerst, in alle stadia Vermijd deze larven gravende in voedsel, vaak dwalen ver weg van een bron van voedsel. Ten tweede, tunneling in een zachte onderlaag, die normaal optreedt tijdens de dolende derde instar fase is volledig afgeschaft als larven hypoxische. De hier beschreven test is ontworpen om te detecteren en kwantificeren van deze gedragingen en dus een manier om te ontdekken van hypoxie geïnduceerd door inwendige schade in plaats van lage externe zuurstof te bieden. Test platen met een agar-substraat en een centrale stekker voor gist paste zijn gebruikt ter ondersteuning van dieren door het larvale leven. De standpunten en de staat van de larven worden dagelijks bijgehouden als zij uit eerste naar het derde instar voortkomen. De mate van tunneling in de agar substraat tijdens dolende fase is quantitated na met behulp van NIH ImageJ verpopt. De test zal worden van waarde om te bepalen wanneer hypoxie is een onderdeel van een mutant fenotype en dus inzicht geven in mogelijke locaties voor de actie van het betrokken gen.

Als een demonstratie van de waarde van deze test hebben wij gebruikten het aan het onderzoeken van potentiële hypoxie in larven met verminderde functie van het gen uninflatable (uif) in de tracheae. UIF codeert een grote transmembraan eiwit dat sterk op het apicale oppervlak van de larvale tracheale cellen uitgedrukt wordt. Mutanten voor uif waren eerder opgemerkt om afwijkend gedrag dat op weefsel hypoxie als gevolg van de trachea storing 9 duiden kantentoon te stellen. Wij onderdrukt specifiek uif expressie in de larvale luchtpijp met behulp van de Gal4-UAS-systeem. Twee Gal4 lijnen werden gebruikt: i) ademloos (btl)-Gal4, die sterk wordt uitgedrukt in de tracheae vanaf het begin van hun embryonale ontwikkeling en ii) gesneden(ue)-Gal4, die expressie in een kleine posterieure provincie begint de tracheae van de belangrijkste dorsale stam aan het einde van de embryogenese en sterke expressie in deze regio in de gehele larvale leven 7blijft. Een UAS -uif RNAi lijn is verkregen uit het Wenen Drosophila Research Center (VDRC ID #1050).
Zoals beschreven in het bovengenoemde protocol, repliceren vijf platen van nieuw gearceerde eerste instar larven waren voor elk van de vier kruisen als volgt instellen.
Experiment 1 1) control 1 - gesneden(ue)-Gal4 x Canton-S (+) 2) experimentele 1 - gesneden(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Experiment 2 3) control 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+) 4) experimentele 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
Het gedrag van de gesneden(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larven van Experiment 1 was vergelijkbaar met die van de controle knippen(ue)-Gal4 > + dieren in termen van gravende, tunneling en overleven tot verpopt, (Figuur 1 en Figuur 2). In tegenstelling, down-regulering uif expressie gedurende het gehele tracheale systeem vanaf vroeg in de ontwikkeling (Experiment 2) geproduceerd sterk verschillende reacties. De btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larven weergegeven beide gedragsmatige uitingen van weefsel hypoxie – minder voedsel gravende en een totaal gebrek aan substraat tunneling later in het larvale leven (Figuur 1 en figuur 2 ). De experimentele larven waren ook merkbaar kleiner, dunner en meer traag dan controles (Figuur 3), en een hoog sterftecijfer bleek in de loop van de test. Zoals hierboven is besproken, zijn verminderde groei, traagheid en organisch dood symptomen van larvale hypoxie bekend. Bovendien, instar allermeest naar de experimentele larven mislukte poging verpopt en bleef als derde larven lange na controle larven had pupated. Sommige larven overleefde meer dan 15 dagen vóór het uiteindelijk sterven zonder verpoppen (figuur 1A). Een paar van de experimentele larven geprobeerd om te verpoppen, maar in alle gevallen abnormale poppen die deed niet het genereren van levensvatbare volwassenen werden gevormd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figuur 1. Kwantificatie van voedsel gravende en larvale ontwikkeling. (A) percentage van levende larven buiten de terpen voedsel voor de vier genotypen studeerde hier. Gemiddelden voor de platen van de vijf assay voor elk genotype gebruikt worden weergegeven. Door overmorgen 3 broedeieren, ~ 70% van de btl-Gal4 > UAS uif RNAi larven waren buiten het voedsel, terwijl geen larven buiten het eten of op het oppervlak van de agar voor de andere drie genotypen werden ontdekt. De btl-Gal4 > UAS uif RNAi larven sterft langzaam tussen dagen 4-20, met ~ 15% van hen nog in leven 15 dagen na het uitkomen. De zwarte pijl langs de x-as hier en in (B) geeft aan dat de dag waarop alle larven van de drie andere genotypen had pupated. (B) percentage van de dode larven zichtbaar buiten het voedsel voor de vier genotypen. Gemiddelden voor de platen van de vijf assay voor elk genotype worden weergegeven. Dode btl-Gal4 > UAS uif RNAi larven accumuleren in de tijd met de meeste sterven buiten het voedsel. De andere genotypes alle aan verpopt overleven (C) Percentage overleven tot verpopt voor de vier genotypen studeerde. Gemiddelden voor de platen van de vijf assay voor elk genotype worden weergegeven. Geen normale poppen van de btl-Gal4 > UAS uif RNAi genotype werden geproduceerd. Foutbalken in de hele figuur vertegenwoordigen SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figuur 2. Kwantificatie van larvale tunneling. (A) voorbeelden van de platen assay voor alle vier genotypen studeerde na voorbereiding voor tunneling kwantificatie. Opmerking volledig ontbreken van tunneling voor de btl-Gal4 > UAS uif RNAi larven. Assay platen zijn 10 cm Petri platen. (B) tunneling kwantificatie afgeleid van Image J voor de vier genotypen. Gemiddelde pixelwaarden voor de platen van de vijf assay voor elk genotype. Geen tunneling werd waargenomen voor de btl-Gal4 > UAS uif RNAi larven. Foutbalken = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figuur 3. Vergelijking van btl-Gal4 > UAS uif RNAi en btl-Gal4 > + larven Larven van dezelfde leeftijd (dag 6 na het uitkomen) voor de btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) en btl-Gal4 > + (B) genotypen. Rode pijlen wijzen naar de tracheae van de dorsale stam. Beide larven beeld op de dezelfde vergroting. Schaal bar = 0.5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Het protocol beschrijft een eenvoudige test om te identificeren van Drosophila melanogaster larven die hypoxie onder normale atmosferische zuurstofniveaus ondervindt. Dit protocol staat hypoxische larven te onderscheiden van andere mutanten die aantonen dat overlappende fenotypen zoals traagheid of trage groei.

Een gravende/Tunneling Assay voor het opsporen van hypoxie in Drosophila melanogaster larven

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Het algemene doel van deze test is om drosophila-larven te identificeren die lijden aan weefselhypoxie ondanks normale zuurstofniveaus. Bij drosophila zijn er veel mutaties die leiden tot langzame, slechte groei van de larven en sommige larven zijn sloom. Deze test identificeert binnen die klasse van larven, diegenen die lijden aan weefselhypoxie.Uiteindelijk zal deze test helpen bij het identificeren van meer mutaties die door verschillende fysiologische processen zuurstofgebrek in de weefsels veroorzaken. Het idee voor deze test ontstond uit de observatie dat larven met beschadigde luchtwegen of trachea twee vreemde gedragingen vertoonden. Deze abnormale gedragingen zijn het niet graven in voedsel tijdens de vroege larfleven en het niet graven in een zachter substraat tijdens de zwerffase.Stel de controle en experimentele genetische kruisingen in eilegschalen in zoals beschreven in het protocol in de tekst. Houd de vliegen minimaal twee dagen in het donker voordat u begint met getimede eicollecties. Voor getimede eicollectie, verplaats de volwassenen naar nieuwe druivenagarplaten versierd met een verse smeer van gistpasta vroeg in de dag en laat de volwassenen gedurende vier uur eieren op de platen leggen.Na vier uur, verplaats de volwassenen naar verse druivenagarplaten. Vervolgens incubeer de vier uur collectie platen een nacht bij 25 graden Celsius. Tegen de volgende middag zullen de meeste larven zijn uitgekomen.Plan om er ten minste 50 te hebben voor elke experimentele groep. Voor een enkele uitvoering van de test, bereid minimaal vijf testplaten per experimentele groep voor. Voeg 16 gram vlieg-agar en 700 milliliter gedeïoniseerd water toe door te verwarmen.Bereid een 17,5 milliliters Nipagen in 95% ethanol. Verwarm de agaroplossing tot het bijna volledig is opgelost. Voeg vervolgens Nipagen-oplossing toe aan de agaroplossing en verwarm tot de agar volledig is opgelost.Koel de agaroplossing kort af, belaad vervolgens 10 centimeter platen met 15 milliliter van de agaroplossing. Zodra de agar is gevormd, zet de deksels op de platen en laat ze enkele uren of een nacht drogen op kamertemperatuur. Geharde agar moet stevig aanvoelen en brokkelen weerstaan wanneer er stukken uit worden gesneden.Zodra de agar is uitgehard, gebruik een 1,5 centimeter kurkbord om een centraal gat in de agargel in elke plaat te maken. Vul vervolgens de gaten netjes met verse gistpasta. Om de larven over te brengen naar de testplaat, maak een eenvoudig gereedschap.Buig een curve in de punt van een plastic microspatula en doop de punt in gistpasta om het plakkend te maken voor larven. Pak nu de eerste instar larven individueel op en plaats ze op de agarplaat dicht bij de voedselhoop. Bereid voor elke experimentele groep minimaal vijf platen voor, elk met 10 larven.Om een reproduceerbaarheid tussen testreplica's te garanderen, is het van cruciaal belang dat er slechts 10 larven op elke testplaat worden geplaatst. Zorg ervoor dat u de testplaat zorgvuldig controleert om te bepalen dat er telkens een en slechts één larve wordt overgebracht wanneer u een larve met de microspatula-tip levert. Zodra een plaat is geladen, label het, dek het af en plaats het in het donker met de deksel naar boven op kamertemperatuur.Bekijk elke plaat dagelijks totdat alle larven zijn gestorven of verpopt. Hier zijn voorbeelden van platen voor een wildtype stam voor dag twee tot dag acht van de test. Op dag twee worden larven in voedsel begraven en er vindt geen graven plaats.Graven begint op dag drie en bereikt een maximum tussen dag vijf en dag acht, terwijl larven stoppen met zwerven en in hun tunnels verpoppen. Verplaats de poppen voorzichtig met een gebogen priknaald naar een druivenplaat en tel desgewenst hoeveel poppen zijn omsloten. Houd de popvorming in de gaten en evalueer de poppen op abnormaliteiten.Om de tunnels binnen de testplaat af te beelden, verwijder en gooi eerst voorzichtig al het gistvoedsel uit de centrale put van elke plaat weg. Overspoel vervolgens elke plaat voorzichtig met kraanwater en gebruik een zachte verfborstel om voorzichtig eventueel puin te verwijderen dat op het agaroppervlak is aangekomen. Sommige stukken agar kunnen brokkelen waar graven het intenst is.Dit kan later worden gecorrigeerd. Blijf het water meerdere keren vervangen en veeg voorzichtig het puin weg totdat de plaat helemaal schoon is. Geef de plaat vervolgens een laatste spoeling met gedeïoniseerd water, dek hem af en laat hem een nacht op kamertemperatuur drogen.Het is belangrijk om een zachte waterstroom en zachte penseelstreken te gebruiken om de agarplaten schoon te maken, zodat u geen delen van de agargel breekt of beschadigt. De volgende dag bereidt u een tiff-bestandsafbeelding van de plaat voor met een zwarte achtergrond om de tunnels als heldere witte lijnen te laten zien. Geldocumentatiesystemen werken goed voor deze stap.Kwantificeer vervolgens het graven in de afbeelding met behulp van Image J met het Oval tool, definieer de agargel tot aan, maar niet inclusief, de plastic rand van de petrischaal. Pas vervolgens een automatische drempel toe om een omgekeerde afbeelding van de plaat te produceren, zodat de tunnels als zwarte lijnen verschijnen. Om donkere gebieden die geen tunnels bevatten te corrigeren, gebruikt u de Kleurkiezer en Verfkwast gereedschappen om die regio's wit te maken.Selecteer vervolgens onder het Analyseer uitklapmenu de optie Schaal instellen en klik om de schaal te verwijderen. Ga vervolgens naar het Venster met metingen onder Analyse en vink Gebied en Beperken tot drempel aan. Druk nu op de Control toets samen met de M toets om een meting van het zwarte gebied in de afbeelding in de eenheid pixels te krijgen, wat het geboorde gebied vertegenwoordigt.Om het graven te kwantificeren dat verloren is gegaan door agarerosie rond het centrale gat, vink Beperken tot drempel uit. Gebruik de Toverstok om het centrale gat te definiëren en druk op Control plus M om de waarde in pixels te meten. Trek van

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Deze video toont een methode om hypoxie bij Drosophila-larven te testen door hun graaf- en tunnelcapaciteiten te beoordelen. Met behulp van deze techniek kunnen onderzoekers larven met zuurstoftekort onderscheiden van larven met ontwikkelingsachterstanden. Het voorbeeldprotocol demonstreert de instellingen voor deze test.

Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: een methode om weefselhypoxie bij vlieglarven te beoordelen

Deze video beschrijft een eenvoudige methode om vliegbeweging te kwantificeren en toont de uitgevoerde klimtest.  De vliegklimtest is een algemene test van de motorische functie die afhankelijk is van een negatieve geotaxis-respons.

Fly Climbing Assay: een methode om algemene voortbeweging in Drosophila melanogaster te testen

Source:Siddarth Gunnala1, Nafisa M. Jadavji2,3,41Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, Glendale, AZ, USA2Division of Integrative and Molecular Physiology, Department of Biomedical Sciences, Southern University of Illinois, Carbondale, IL, USA3Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, Phoenix, AZ, USA4Department of Neuroscience, Carleton University, Ottawa, ON, CanadaThis video demonstrates hypoxia-induced climbing behavior in Drosophila...

Hypoxia-Induced Climbing Behavior of Drosophila melanogaster

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Dit protocol is ontworpen om de levensvatbaarheid van Drosophila in elke ontwikkelingsfase, van embryo tot volwassene, te beoordelen. De methode kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van verschillende genotypen of groeiomstandigheden te bepalen en te vergelijken.

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer een gravende/tunneling assay om hypoxie in Drosophila melanogaster larven te detecteren onder normale atmosferische omstandigheden. Deze methode onderscheidt hypoxische larven van andere mutanten met vergelijkbare fenotypes.

Een gravende/Tunneling Assay voor het opsporen van hypoxie in Drosophila melanogaster larven

Meer video's verkennen