Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties
March 22nd, 2018
Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.
Het algemene doel van dit experiment is om de overdracht van oscillerende informatie van cel naar cel te observeren door optogenetische controle en live monitoring van genexpressie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe cellen met elkaar communiceren via de Notch-signaleringsroute, met name hoe cellen de oscillerende informatie aan elkaar overbrengen. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de dynamica van genexpressie met zeer hoge precisie kunnen controleren en monitoren.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Akihiro Isomura, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium die deze nieuwe technologie heeft ontwikkeld. Om plasmidevectoren van Tol2-gebaseerde optogenetische modules samen met het transposase-expressievector in C2C12-cellen te transfecteren, tel eerst trypsineerde cellen met een celteller. Plaats één dag voor de transfectie 50.000 C2C12-cellen per putje in een 12-putjesplaat.
Co-transfecteer vervolgens 0,375 microgram Tol2-gebaseerde optogenetische vectoren, 0,125 microgram van een geneesmiddel-selectievector en 0,5 microgram van het transposase-expressievector met behulp van het lipofectiemiddel. Trypsineer de getransfecteerde cellen en plaats ze één dag na de transfectie in 100-millimeter kweekschalen. Vervang het kweekmedium voor de getransfecteerde cellen door kweekmedium aangevuld met 100 milligram per milliliter hygromycine.
Kweek de cellen drie dagen om niet-getransfecteerde cellen te elimineren. Merk op dat het verversen van het medium niet nodig is. Trypsineer vervolgens de getransfecteerde cellen en zuiver een populatie cellen die fluorescente eiwitten tot expressie brengen voor selectie door de ontvanger en lichtgevoelige cellen te sorteren, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.
Stel twee soorten incubatoren in met of zonder lichtbronnen voor een lichtgeïnduceerde conditie of een donkere conditie. Gebruik een lichtmeter om de lichtintensiteit van een blauwe LED-transilluminator in te stellen. Meet de lichtintensiteit na het sluiten van de deur.
Programmeer de timing en duur van lichtbelichting door een controlescript te laden naar een enkele board microcontroller die programmeerbare schema's voor belichting mogelijk maakt. Tel de trypsineerde cellen met een celteller en plaats 100.000 lichtgevoelige zendercellen die pAI218 en pAI170 dragen op 35 millimeter diameter plastic kweekschalen. Plaats de schalen in afzonderlijke incubatoren voor donkere en lichte condities.
Na het instellen van de schalen, houd de deuren van de incubatoren gesloten totdat de cellysaten worden verzameld. Anderhalve dag na het plateren, begin met lichtbelichting. Stel de cellen niet bloot aan ongecontroleerd licht om ongewenste foto-stimulatie te voorkomen.
Dus doe deze stap zonder de deur te openen. Merk op dat het openen van de deur hier alleen voor demonstratie is. Ongeveer twee dagen na het plateren, verplaats monsterschalen van incubatoren naar ijs met tussenpozen van 30 minuten, en begin met de voorbereiding van cellysaten voor verdere analyse.
Om de cellulaire reacties op optische stimulatie door PMT in real-time te monitoren, trypsineer en tel eerst de aantallen zender- en ontvangercellen met standaardmethoden. Bereid een suspensie van één milliliter totaal volume van 25.000 ontvanger en 125.000 zendercellen. Plaats de gemengde cellen in elk putje van 24-wel plaatjes met zwarte bodem met kweekmedium bevattende één millimolair luciferine.
Analyseer de cellen op een plate reader voor de luciferase assay om te bevestigen dat de uitvoersignaal niet te hoog zijn voor het opnamesysteem. Plaats vervolgens de plaat op het opnamesysteem en start een opnameprogramma. Begin bijvoorbeeld met lichtbelichting 18 uur na het instellen van de opname.
Voor real-time beeldvorming van reacties van enkele cellen onder controle van optogenetische verstoring, plaat eerst 50.000 ontvanger en 250.000 zendercellen op 27 millimeter diameter glasbodem 35 millimeter diameter schalen. Zorg ervoor dat de mengverhoudingen en het totale aantal cellen correct zijn aangepast. Eén dag na het plateren, vervang medium met twee milliliter opnamemedium.
Plaats de glasbodemschaal op een omgekeerde microscoop uitgerust met een omgevingskamer op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Stel een gekoelde CCD-camera in. Zorg ervoor dat de temperatuur van de CCD-sensor is afgekoeld tot de doelwaarde.
Stel parameters in voor multidimensionaal tijdsverloopvenster in automatische acquisitiesoftware om beelden met vijf minuten intervallen en meer dan 288 keer vast te leggen. Selecteer in het multidimensionaal tijdsverloopvenster een luminescentiekanaal. Zorg ervoor dat de uitleesmodus is ingesteld op de langzame 50-kilohertz uitleesmodus, wat cruciaal is voor het verminderen van uitleesruis om zwak lichtgevend bioluminescentielicht te detecteren.
Selecteer in het multidimensionaal tijdsverloopvenster fluorescentiekanalen. Zorg ervoor dat de uitleesmodus is ingesteld op de snelle één megahertz modus om de tijd die nodig is voor fluorescentiebeeldvorming te verminderen. Stel ten slotte twee-op-twee binning met 400 milliseconden belichting in.
Selecteer vervolgens een journaaltab om schema's in te stellen om de cellen te stimuleren met periodieke blauwlichtbelichting. Klik op de plusknop om een nieuw journaalsetup toe te voegen. Selecteer een journaalbestand uit een journaalbox, kies meerdere tijdstippen en stel waarden in de beginpunt en intervalvakken in om een schema voor stimulatie in te stellen.
Zorg ervoor dat het opgegeven journaalbestand sequentiële protocollen bevat voor het selecteren van verlichting, het openen van de sluiter, vertraging, sluiten van de sluiter en vertraging. Stel vervolgens schema's in om cellen te stimuleren met periodieke blauwlichtbelichting. Start tenslotte de tijdsverloopopname door op de knop Acquire te klikken.
Ten slotte worden enkelcellig luminescentiekanaal sporen uit tijdsverloopfilmpjes geëxtraheerd, zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve resultaten van optogenetische zender-ontvanger assays worden hier getoond. De lichtinduceerbare zendercellen produceerden oscillerende patronen van Delta-ligandenexpressie in aanwezigheid van periodieke blauwlichtbelichting, zoals verwacht.</
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van cel-tot-cel overdracht van oscillerende informatie met behulp van optogenetische controle en live monitoring van genexpressie. De methode maakt nauwkeurige controle en observatie van genexpressiedynamiek mogelijk en biedt inzicht in cellulaire communicatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Optogenetica
Achtergrond
- Het begrijpen van celcommunicatie is cruciaal voor het ontcijferen van meercellige systemen.
- De Notch-signaleringsroute speelt een belangrijke rol in cellulaire interacties.
- Overdracht van oscillerende informatie is een sleutelaspekt van cellulaire dynamiek.
- Optogenetische tools maken nauwkeurige manipulatie van genexpressie mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om te observeren hoe cellen communiceren via oscillerende signalen.
- Om de dynamiek van genexpressie in een meercellig context te onderzoeken.
- Om een platform te ontwikkelen voor het testen van de functionele betekenis van genexpressieprogramma's.
Gebruikte methoden
- Transfectie van plasmidevectoren in C2C12-cellen.
- Gebruik van Tol2-gebaseerde optogenetische modules.
- Live monitoring van genexpressiedynamiek.
- Celtelling en plateertechnieken voor transfectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van optogenetische modules in doelcellen.
- Demonstratie van oscillerende informatieoverdracht tussen cellen.
- Hoge precisie in het controleren van genexpressiedynamiek.
- Inzichten in de rol van Notch-signalering in cellulaire communicatie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van celcommunicatie.
- Optogenetische controle verbetert ons begrip van genexpressiedynamiek.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrijpen van meercellige systemen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This optogenetic method enables precise temporal control and live monitoring of gene expression in cell-to-cell interactions, addressing a key challenge in deciphering dynamic signaling mechanisms. By revealing how oscillatory Notch signaling entrains intrinsic cellular rhythms through frequency tuning and phase shifting, the approach provides mechanistic de-risking for target validation in multicellular systems. It supports predictive confidence in early discovery by linking dynamic gene expression programs to functional intercellular communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how periodic inputs of signaling pathways entrain intrinsic oscillations at single-cell resolution.
- Operational Value: Enables functional target validation through optogenetic perturbation and real-time readout of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying how dynamic signaling features influence cellular response patterns in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated sender-receiver coculture systems for downstream screening of modulators affecting oscillatory signal transfer.
- Operational Value: Standardizes light-controlled stimulation protocols and luminescent readouts for reproducible, quantitative assay outputs.
- Scalability: Facilitates platform reuse across signaling pathways by decoupling optogenetic control from specific genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects dynamic gene expression measurements in vitro to potential biomarker alignment in multicellular disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed oscillatory patterns are drivers or passengers in pathogenic signaling, reducing ambiguity in target selection.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating whether modulating signal dynamics alters phenotypic outcomes in receiver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness for lead identification, particularly when dynamic signaling behavior is a key determinant of target validity.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how oscillatory information transfer contributes to cellular decision-making in Notch and similar pathways.
- Screening: Enables assay development for compounds that disrupt or enhance frequency-specific signal transmission between cells.
- Analytics: Provides quantitative time-series data on luminescence and fluorescence readouts, enabling statistical comparison of entrainment efficacy across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when oscillatory dynamics correlate with functional states in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular optogenetic platform applicable to multiple signaling systems beyond Notch, increasing long-term ROI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by resolving mechanistic ambiguity in how dynamic gene expression programs influence intercellular communication.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible control over temporal stimulation and real-time monitoring, reducing variability in complex coculture systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of whether targeting dynamic signaling features yields measurable phenotypic effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets where signal dynamics, not just static expression, are functionally relevant.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, live-cell imaging, and luciferase-based reporter systems.
- Depends on access to programmable light sources, environmental chambers, and plate readers capable of low-light luminescence detection.
- Necessitates standardization of light intensity, timing schedules, and cell mixing ratios across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to primary cells or in vivo models due to differences in transfection efficiency and light penetration.
- Practical limitations include potential phototoxicity from prolonged blue-light exposure and signal saturation in high-density cocultures, as noted in the protocol’s optimization steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Generation of Stable Cell Lines by the Tol2 System
2:07
Evaluation of Photo-sensitivity of Engineered Cells at the Population Level
3:31
Dynamic Sender-receiver Assay at the Population Level and at the Single-cell Level
6:47
Results: Analysis of Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions
7:35
Conclusion
