Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties
10 april 2018
Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor ecosysteem fabrikatie van apparaten (EcoFABs) waarmee de studies van planten en plant-microbe interacties in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.
Het algemene doel van dit protocol is om gestandaardiseerde benaderingen te definiëren voor de constructie van vereenvoudigde modelplant-ecosystemen, EcoFAB's genaamd, die gecontroleerde, gerepliceerde laboratoriumexperimenten mogelijk maken om plant-microbe-interacties te onderzoeken die verder getest kunnen worden in het veld. Deze methode kan worden gebruikt om plant-microbe-interacties te bestuderen binnen gecontroleerde omgevingen, waardoor we gedetailleerde mechanistische inzichten kunnen krijgen in de functies van microbiomen om ze te kunnen benutten voor duurzame landbouw. We hielpen bij het ontwerpen van deze eerste Eco-FAB, die een verscheidenheid aan beschikbare 3D-printtechnologieën gebruikt en om de plantengroeikamers te steriliseren die zowel niet-storende hoge resolutie beelden als chemische analyse mogelijk maken.
Het hier ontwikkelde Eco-FAB-apparaat is goed geschikt voor de analyse van plant-microbe-interacties omdat het de analyse van wortelmorfologie en massaspectroscopische beeldvorming omvat. Na de constructie van Eco-FAB-malen, met behulp van 3D-printen volgens het tekstprotocol, in een wegwerpbare liter container, meng 40 milliliter siloxaan elastomeerbasis met verschillende volumes van verhardingsmiddel, afhankelijk van het experiment. Plaats de container minimaal 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen uit het elastomeermengsel te verwijderen.
Verwijder vervolgens het mengsel en giet het in de geassembleerde 3D-geprinte kunststof mal. Om een uniforme PDMS-laag te genereren, moeten luchtbellen zorgvuldig worden verwijderd. Gebruik perslucht om eventuele luchtresten weg te blazen nadat het mengsel in de mal is overgebracht.
Houd de mal op een verwarmingsblok van 85 graden Celsius gedurende vier uur. Laat de mal vijf minuten afkoelen. Trek vervolgens voorzichtig de inleg uit de mal en gebruik een utilitymes om de PDMS langzaam van het gietframe te scheiden.
Druk de malbasis met PDMS omhoog uit het gietframe. Gebruik vervolgens een mes of andere gereedschappen om de PDMS-laag voorzichtig van de malbasis te scheiden aan de randen en trek hem langzaam van het maloppervlak. Maak met een 15 gauge stompe naald een inlaatkanaal op de PDMS-lagen door gaten van 1,6 millimeter in dat deel te maken.
Gebruik vervolgens een schaar om de randen van de PDMS-lagen bij te knippen. Gebruik methanol om de hechtingszijde van de PDMS-laag bij een microscoopglasplaat van 7,6 bij vijf centimeter te spoelen en blaas ze droog met perslucht of een ultrapuur stikstofpistool. Plaats de microscoopglasplaat en PDMS-laag in een plasmareiniger met hun hechtingszijden naar boven.
Sluit de kamer en de gasontluchtingsklep. Zet vervolgens de vacuüm aan en pomp de kamer een minuut lang leeg. Zet de plasmagenerator in en schakel de radiofrequentie of RF-niveau gedurende een minuut naar hoog.
Schakel vervolgens zowel de vacuümpomp als de plasmakracht uit en laat de kamer ontluchten naar de atmosfeer. Haal de microscoopglasplaat en PDMS-laag uit de plasmakamer en druk snel alle vier de randen van de PDMS-laag met gelijkmatige druk op de plaat. Zorg ervoor dat het centrale ovale gebied, dat de wortelkamer is, de plaat niet raakt.
Spuit de Eco-FAB-apparaten met ultrapuur water. Plaats een Eco-FAB-apparaat in een Eco-FAB-container en voeg 70% ethanol toe tot het apparaat ondergedompeld is. Sluit vervolgens het deksel van de container en schud het voorzichtig om alle oppervlakken binnenin met ethanol te bevochtigen, zorg ervoor dat de wortelgroeikamer van het Eco-FAB-apparaat gevuld is met ethanol, met zeer weinig of geen luchtbellen.
Na incubatie van de apparaten gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, giet de 70% ethanol er af en vervang het door 100% ethanol. Incubeer vervolgens de apparaten gedurende vijf minuten. Na de incubatie, giet de ethanol af en laat de gesteriliseerde Eco-FAB 16 uur in een Laminaire Stroomkast drogen.
Als beschikbaar, steriliseer het systeem door de UV-lamp in de kast gedurende een uur aan te zetten. Om zaadsterilisatie en kieming uit te voeren, week de zaden gedurende twee minuten in 70% ethanol. Vervolgens, met een pipet, verwijder het ethanol en gebruik steriel water om de zaden drie keer te spoelen.
Week vervolgens de zaden gedurende vijf minuten in een 10% bleekmiddeloplossing. Verwijder vervolgens de bleekvloeistof en gebruik steriel water om de zaden drie keer grondig te wassen. Na de wasbeurten, voeg steriel water toe aan de zaden en incubeer de buis gedurende zeven dagen bij vier graden Celsius.
Verspreid de zaden gelijkmatig op 0,5 Murashige en Skoog, of MS-medium, met 0,6% vitagel. En verzegel de platen met micropore tape. Laat vervolgens de planten groeien tot een wortellengte van ongeveer vijf milliliter.
Om de zaailingen in Eco-FAB's over te brengen, gebruik een steriele spuit of micropipet en steriel water, spoel de wortelkamer van een Eco-FAB-apparaat drie keer door en vul vervolgens de wortelkamer met het groeimedium van belang, zoals 0,5 MS-medium. Plaats nu voorzichtig een enkele zaailing in het plantenreservoir van het Eco-FAB-apparaat. Het is belangrijk dat de zaailingen voorzichtig van plaat naar Eco-FAB worden overgebracht, zodat de wortels niet breken.
Voeg drie milliliter steriel water toe aan de container, vermijd het Eco-FAB-apparaat. Dit zal de luchtvochtigheid verhogen en de verdamping van het medium uit de wortelkamer verminderen. Sluit vervolgens de container en gebruik micropore tape om het deksel te verzegelen.
Plaats de Eco-FAB in een plantenincubator, of gebruik het Eco-FAB-verlichtingssysteem in een omgeving met gecontroleerde temperatuur die geschikt is voor de groei van de betreffende plant. Stel vervolgens de kamer in op 24 graden Celsius. Voer ten slotte metabolietprofilering en massaspectrometrie uit, volgens het tekstprotocol.
Deze figuren tonen zeven dagen oude Aaabidopsis thaliana, brachypodium distachyon en panicum virgatum die in Eco-FAB's groeien. Zowel de dicot als de monocot bleken in
Overzicht
Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor de constructie van EcoFABs, die studies van plant- en plant-microbe-interacties in gecontroleerde laboratoriumomstandigheden vergemakkelijken.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Plant-Microbe Interacties
- Gecontroleerde Ecosysteemfabricage
- Laboratoriumprotocolontwikkeling
Achtergrond
- EcoFABs zijn vereenvoudigde model-ecosystemen die zijn ontworpen voor laboratoriumexperimenten.
- Ze maken gecontroleerde en gerepliceerde studies van plant-microbe-interacties mogelijk.
- De methode beoogt mechanistische inzichten in microbioomfuncties te bieden.
- Gebruik van 3D-printtechnologieën verbetert het ontwerp van deze apparaten.
Doel van het Onderzoek
- Om gestandaardiseerde benaderingen voor het construeren van EcoFABs te definiëren.
- Om plant-microbe-interacties in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
- Om verder testen van bevindingen in veldcondities mogelijk te maken.
Gebruikte Methoden
- Constructie van EcoFAB-malen met behulp van 3D-printen.
- Voorbereiding en sterilisatie van plantengroeikamers.
- Zaadsterilisatie en ontkiemingsprotocollen.
- Metabolietprofilering en massaspectrometrie voor analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle groei van verschillende plantensoorten in EcoFABs.
- Gedetailleerde analyse van wortelmorfologie en interacties.
- Demonstratie van de bruikbaarheid van de EcoFAB voor hoge-resolutie beeldvorming.
- Inzichten in de rol van microbiomen in duurzame landbouw.
Conclusies
- EcoFABs bieden een robuust platform voor het bestuderen van plant-microbe-interacties.
- De vastgestelde protocollen kunnen worden toegepast op verschillende plantensoorten.
- Bevindingen kunnen bijdragen aan vorderingen in duurzame landbouwpraktijken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
EcoFABs provide a standardized, reproducible platform for mechanistic studies of plant-microbe interactions under controlled laboratory conditions. This enables de-risking of target validation in agricultural biotechnology by clarifying functional roles of microbiomes in plant health and stress response. The system supports predictive confidence in lead identification for microbiome-based bioinputs through dynamic monitoring of root exudates, microbial localization, and plant growth phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by manipulating microbiome composition, including mutant strains, to assess causal effects on plant phenotypes.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled addition of plant growth promoting rhizobacteria such as Pseudomonas simiae WCS417 and quantification of colonization patterns.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking microbial interventions to measurable outputs like root morphology, exudate composition, and growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling sterile, reproducible mounting of seedlings and controlled media exchange in flow-through devices.
- Quantitative Outputs: Generates standardized metrics including total root area over time, microbial localization via mass spectrometry imaging, and exudate profiling for compound screening.
- Platform Reuse: Designed for scalability across plant species (Arabidopsis, Brachypodium, Panicum) and growth media (hydroponic, sand, soil), supporting cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plant-soil-microbe interactions relevant to sustainable agriculture and bioenergy feedstock production.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by allowing progression from sterile lab conditions to defined soil/sand systems with supplemental media.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on reproducible phenotypes under controlled stress or nutrient conditions prior to field testing.
Pipeline & Workflow Integration
EcoFABs integrate into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supporting iterative design-test cycles for microbiome-based agricultural solutions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling manipulation of microbiome composition and environmental variables while monitoring plant responses.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through sterile fabrication, controlled hydration, and sealed incubation systems that minimize evaporation and contamination.
- Analytics: Provides quantitative measurements including root morphology imaging, metabolite profiling, and mass spectrometry data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting validation in increasingly complex media (sand, soil) while maintaining controlled variables.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable platform rather than a single-use tool, with modular design allowing adaptation across labs and plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in plant-microbe interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through detailed sterilization protocols, 3D-printed molds, and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbiome-based leads before field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, reproducible phenotypes linked to microbial interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, 3D printing, and PDMS handling for device fabrication.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum chambers, and imaging systems for bonding and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for seed transfer, media exchange, and contamination control.
- Requires adaptation considerations when switching between liquid, sand, or soil-based growth media while maintaining sterility.
- Limited by the need for aseptic workflows during exudate sampling and media refresh to prevent biofilm formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
