Name: Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Leer gestandaardiseerde EcoFAB-protocollen voor het bouwen van laboratoriumecosystemen om plant-microbe-interacties te bestuderen. Deze methode biedt mechanistische inzichten in microbioomfuncties voor duurzame landbouw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door laboratorium gericht onderzoek en ontwikkeling (LDRD) programma van het Lawrence Berkeley National Laboratory ondersteund door het Office of Science, van het US Department of Energy onder Contract nr. DE-AC02-05CH11231 en een award DE-SC0014079 van het VS departement van energie Office of Science aan UC Berkeley. Werk op de moleculaire lettergieterij steunde onder VS departement van energie Contract nr. DE-AC02-05CH11231. Wij danken ook Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen en Benjamin J. Cole bij het Lawrence Berkeley National Laboratory voor al hun hulp.

<ol><li>Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+microbes+at+the+root+of+a+solution+to+world+food+production%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Are microbes at the root of a solution to world food production.</a> EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).</li>
<li>Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+engineering+beneficial+plant-microbe+interactions%3A+plant+growth+promotion+in+energy+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops.</a> Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(16)30084-1">Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production.</a> Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).</li>
<li>Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959652615019022">Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions.</a> J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).</li>
<li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+microbiomes+and+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Plant microbiomes and sustainable agriculture.</a> EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).</li>
<li>van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1002378">Networking in the Plant Microbiome.</a> PLoS Biol. 14 (2), e1002378(2016).</li>
<li>Vessey, J. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1026037216893">Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers.</a> Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).</li>
<li>Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19056309">Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress.</a> Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/02-0298/abstract">GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS.</a> Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).</li>
<li>Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526617300158">Understanding and exploiting plant beneficial microbes.</a> Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).</li>
<li>Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK447357/">Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes.</a> National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).</li>
<li>Busby, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+priorities+for+harnessing+plant+microbiomes+in+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture.</a> PLOS Biology. 15 (3), e2001793(2017).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).</li>
<li>Oburger, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847212002328">Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques.</a> Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).</li>
<li>Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2435.2002.00611.x/full">Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability.</a> Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+penetrative+forces+using+lab-on-a-chip+technology+and+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling.</a> P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).</li>
<li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703(2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Root+Hair+Morphology+of+Arabidopsis+Seedlings+in+a+Two-layer+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform.</a> J. Vis. Exp. (126), (2017).</li>
<li>Garvin, D. F., et al. <a target="_blank" href="https://dl.sciencesocieties.org/publications/cs/abstracts/48/Supplement_1/S-69">Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research.</a> Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).</li>
<li>Lisensky, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed076p537">Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer.</a> J. Chem. Educ. 76 (4), 537(1999).</li>
<li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Metabolomics+Datasets+with+High-Performance+Computing+and+Metabolite+Atlases%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases.</a> Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis+Chemical+Analysis+Working+Group+%28CAWG%29+Metabolomics+Standards+Initiative+%28MSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI).</a> Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).</li>
<li>Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Black+Silicon+for+Nanostructure-Initiator+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-Driven+Control+of+Metabolite+Selectivity+Using+Nanostructure-Initiator+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).</li>
<li>Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure-initiator+mass+spectrometry%3A+a+protocol+for+preparing+and+applying+NIMS+surfaces+for+high-sensitivity+mass+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis.</a> Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).</li>
<li>Rübel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenMSI%3A+A+High-Performance+Web-Based+Platform+for+Mass+Spectrometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging.</a> Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).</li>
<li>López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nutrient+availability+in+regulating+root+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of nutrient availability in regulating root architecture.</a> Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).</li>
<li>Lynch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steep%2C+cheap+and+deep%3A+an+ideotype+to+optimize+water+and+N+acquisition+by+maize+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems.</a> Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).</li>
<li>Rellán-Álvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLO-Roots%3A+an+imaging+platform+enabling+multidimensional+characterization+of+soil-grown+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems.</a> eLife. 4, e07597(2015).</li>
<li>Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+enhanced+competitive+plant+root+tip+colonizers+selects+for+a+new+class+of+biocontrol+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria.</a> Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).</li>
<li>Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Stable+Isotope+Labeling+and+Molecular+Networking+for+Biosynthetic+Pathway+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization.</a> Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De protocollen gemeld hier voor het gebruik van ecosysteem fabricage maken dat ecofabs voorziet in communautaire middelen systematische plant biologie studies in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Voorschotten in 3D printen bieden breed toegankelijke technologieën voor bouw en iteratief verfijnen EcoFAB ontwerpen. De wortel kamer hier gepresenteerd blijkt te zijn geschikt voor imaging microscopie en onderhouden van steriliteit, gecontroleerde toevoeging van microben te onderzoeken plant-microbe interacties inschakelen. Het platform van EcoFAB is compatibel met verschillende plantensoorten. Het is belangrijk om te erkennen van de fysiologische effecten van het kweken van de planten binnen de smalle root kamer zodanig zijn dat bijkomende experimenten dient te generaliseren van bevindingen aan planten die groeien in een natuurlijke omgeving.
Het gebruik van steriele kamers en LED licht van groeien in staat stelt het onderzoek van de effecten van verschillende licht omstandigheden, met inbegrip van golflengte, intensiteit en duur, op plantengroei en bijbehorende fysiologische parameters in parallel. Omkeerbare hechting wortel kamers staan het gebruik van vaste substraten evenals te verzamelen ruimtelijk solide monsters voor biochemische en genetische analyse. De toepassingen van solide substraten, zoals bodem, zand en kwarts kralen, bieden de mogelijkheid van het gebruik van EcoFABs voor de bouw van meer ecologisch relevante laboratorium ecosystemen. Echter verfijnen alle systemen hier gepresenteerde gebruik verzadigde vloeistof (hydrocultuur culturen) die niet een accurate weerspiegeling zijn van de meeste bodems en het is belangrijk om te verder deze ontwerpen om luchtzakken binnen de bodem zodat zij beter vertegenwoordigen natuurlijke bodems.
Het gebruik van zowel eenvoudige camera's en microscopen wordt beschreven aan de ontwikkeling van de morfologie van images wortelsysteem op beide bulk op cellulair niveau. Deze geschiktheid voor toezicht wortel morfologie beeldvorming en kwantificering zal wellicht nuttig voor het begrijpen van de regelgevende mechanismen van plant-fysiologische en moleculaire signalen veroorzaakt door plant genotypische aanpassingen aan voorwaarden van de groei. Een beperking voor de studie van fysiologische wortel ontwikkeling is echter de huidige horizontale plaatsing van het EcoFAB-apparaat. In een natuurlijke omgeving leidt de wortels gravitropic reactie tot een overwegend verticale ontwikkeling van het wortelsysteem. Dus, het horizontale systeem gepresenteerd hier waarschijnlijk verschilt in sommige factoren van een natuurlijke omgeving, en de fabricage van EcoFAB systemen met verticale plaatsing van de wortel kamer is een wenselijk doel voor toekomstige versies van de EcoFAB. Hoewel de huidige EcoFAB apparaten horizontaal geplaatst worden, is de analyse van root morfologie parameters in verschillende omstandigheden, of in antwoord op de microben, mogelijk. Hoge resolutie beeldvorming kan worden toegepast om vast te leggen van de wortel kolonisatie dynamiek van één isolaten of gemeenschappen, het verstrekken van informatie over welke plant delen in verschillende voedingsstoffen voldoende en gebrekkige omstandigheden zijn gekoloniseerd. Verwacht wordt dat dergelijke studies belangrijke nieuwe inzichten in hoe plant microbiomes worden geassembleerd, en hoe deze dynamiek veranderen na verloop van tijd zal opleveren, bijvoorbeeld als de wortels te ontwikkelen.
Microfluidic apparaten inschakelen beeldvorming van zeer jonge planten, en meestal de hoeveelheid metabolieten verzameld is niet voldoende voor LCMS analyse. Bodem-gebaseerde systemen, zoals rhizotrons, geven de beeldvorming van de morfologie van de wortel of de planten worden omgezet met chemiluminescentie construct (Glo-root) of met NMR gebaseerde methoden33,34. Metaboliet extracties uit deze systemen zijn tijdrovend vanwege grote omvang van de monsters. EcoFABs zijn een combinatie van beide: de fabricage is vergelijkbaar met de microfluidic apparaten. EcoFABs werden ontworpen om eenvoudig en goedkoop te reproduceren, maar de grootte van de kamer kan worden aangepast om te groeien planten met kleine of grote wortelsystemen, tot hun reproductieve fasen. Gelijktijdige opmerkingen van wortel morfologie veranderingen en afscheiding van de hoofdmap zijn mogelijk. Het systeem is steriele, gecontroleerde toevoeging van specifieke microben inschakelen.
EcoFABs zijn ontworpen om gecontroleerde invoering en monsterneming van microben en metabolieten. Specifiek, monsters verzameld uit wortel groei chambers blijken te zijn voldoende voor massa spectroscopische metaboliet profileren. De integratie van massaspectrometrie beeldvorming (bijv., NIMS techniek hier gepresenteerd) zorgt voor een niet-destructieve manier van het bestuderen van de ruimtelijke distributies metaboliet van wortelstelsel. Deze techniek zal wellicht nuttig in de toekomst stabiele isotoop tracering experimenten en toewijzing microbiële localization voor specifieke metabolieten36. Terwijl dit protocol is gericht op één isolaten, kan hetzelfde ontwerp zeker worden gebruikt voor meer complexe Gemeenschappen. De monster volumes en biomassa binnen de EcoFABs zijn waarschijnlijk meer dan voldoende voor verdere integratie met DNA sequencing technologieën, die zal moeten karakterisering en controle van de microbiële Gemeenschap structuur en gen-expressie.
Kortom, dit protocol gegevens de fabricage van laboratorium ecosystemen ontworpen voor het onderzoek van plant-microbe interacties, met nadruk op eenvoudige en toegankelijke methoden die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd en uitgebreid door onderzoekers rond de wereld. Huidige inspanningen zijn gericht op het aantonen van de reproduceerbaarheid tussen labs en de integratie van een temperatuur controlesysteem zodanig dat elke EcoFAB zal apart hebben geregeld, licht en temperatuur. Een verdere verbetering van het systeem zullen de integratie van geautomatiseerde bemonstering en bijvullen van de kamers van de wortel EcoFAB en de ontwikkeling van reproduceerbare protocollen voor de vaststelling van relevante plant microbiomes binnen EcoFABs.

De toepassing van heilzame plant microben in de landbouw biedt grote mogelijkheden om duurzaam voedsel en de productie van biobrandstoffen om te voorzien in een groeiende bevolking1,2,3,4te verhogen. Een aanzienlijke hoeveelheid werk ondersteunt het belang van de plant microbiomes plant opname van voedingsstoffen, tolerantie aan spanningen en weerstand tegen ziekte5,,6,,7,8. Het is echter moeilijk te onderzoeken van deze mechanismen van plant-microbe interacties in veld ecosystemen als gevolg van de complexiteit en de bijbehorende irreproducibility en de onmogelijkheid om te precies regelen microbiome samenstelling en genetica (bv. met behulp microbiële mutanten)4,9,10.
Een strategie is om te bouwen van ecosystemen in het vereenvoudigde model inschakelen gecontroleerd, gerepliceerde laboratoriumexperimenten plant-microbe interacties voor het genereren van inzichten die verder kunnen worden getest in het veld10,11, onderzoeken 12. Dit concept is gebaseerd op traditionele benaderingen met behulp van planten gekweekt in bodem gevulde potten of agar platen in kassen of starterscentra13. Hoewel dit zal waarschijnlijk blijven de meest gebruikte benaderingen, ze missen het vermogen om nauwkeurig te controleren en manipuleren van de plant groei omgevingen. Voor deze doeleinden, rhizoboxes en rhizotrons vertegenwoordigen een grote verbetering in het vermogen om te studeren onder-grond processen14,15, en eerste protocollen werden gepubliceerd voor het analyseren van de rhizosfeer metabolieten in bodem16. Meer recentelijk, opdat hoge doorvoer analyse, geavanceerde microfluidic apparaten13,17 als Plant Chip18,19, RootArray20RootChip21, geweest ontwikkeld als efficiënte tools voor plant fenotypering met de ruimtelijke resolutie micrometer-schaal te controleren van de vroege groeistadia van de kleine model fabriek Arabidopsis thaliana in vloeibare stroom medium. Onlangs, een twee-laag imaging platform werd beschreven waarmee root haar beeldvorming van Arabidopsis thaliana met een microfluidic platform22stadium zaailing.
Gedetailleerde protocollen voor de bouw van gecontroleerde laboratorium apparaten (EcoFABs) hier voorwaarde, voor het bestuderen van de plant-microbe interacties en Toon dat ze kunnen worden gebruikt om te studeren diverse planten met inbegrip van Arabidopsis thaliana, kortsteel distachyon23, het ecologisch belangrijk wild oat Avena Barbata (BG), en het gewas van bio-energie Panicum miliaceum (switchgrass). EcoFAB is een steriele plant groei platform dat twee primaire componenten omvat: de EcoFAB apparaat en steriele plant middelgrote transparante container. Het apparaat uit een Polydimethylsiloxaan (PDMS bestaat) productieproces waarbij gieten PDMS EcoFAB lagen van een 3D gedrukte kunststof mal en verlijmen PDMS lagen in Microscoop dia's met behulp van methoden eerder gemeld24,25 . De gedetailleerde procedures EcoFAB de werkstroom, zoals apparaat-fabricage, sterilisatie, kieming van het zaad, zaailing transplantatie, microbe inoculatie/cocultivation, bereiding van de monsters en analyse, worden beschreven in dit protocol (Figuur 1). Verdere wijzigingen van de Basiswerkstroom zijn beschreven, met inbegrip van de installatie van de computer gecontroleerd groeien ledverlichting en het gebruik van vaste substraten. Het gebruik van beeldvormende technieken om te onderzoeken wortel morfologie verandert, microbiële kolonisatie van de wortels, en massa spectroscopische beeldvorming van exsudaat van de wortel worden beschreven. Wij verwachten dat het ontwerp van het eenvoudige, goedkope gebaseerd op de gemakkelijk beschikbare materialen, evenals de gedetailleerde protocollen gepresenteerde, het EcoFAB platform zal veranderen in een gemeenschap resource, standaardiseren laboratoriumonderzoek plant-microbiome.

<table><tbody><tr><td>3D printed custom mold</td><td>LBNL</td><td></td><td>STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Air duster spray</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>any compressed gas duster should work</td></tr><tr><td>15 gauge blunt needle</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe with Luer-Lok Tip</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3&rdquo;x2&rdquo; microscope glass slide</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box</td><td>Amazon</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4&rdquo; x 3 &frac14;&rdquo; microscope glass slide</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box</td><td>Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>3D printed custom clamp</td><td>LBNL</td><td></td><td>STL files available from Trent Northen's lab</td></tr><tr><td>Sterile hood</td><td>AirClean Systems</td><td>AC600 Series PCR Workstations</td><td></td></tr><tr><td>PTFE syringe tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base</td><td>Phytotechnologies Laboratories</td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base</td><td>Phytotechnologies Laboratories</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-24 Col-4 Columbia wild type</td><td></td></tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>Standard Bd-21 line</td><td>Available from John Vogel's lab</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td><td>Alamo switchgrass</td><td></td></tr><tr><td>Micropore tape</td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grade methanol</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVAC concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant&trade; SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Liquid chromotography system</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1290 LC system</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade; Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMS chip and custom MALDI plate</td><td>LBNL</td><td></td><td>For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>MALDI mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>Nano-coated LED grow light strip</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>LED World Lighting</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>TC420 controller</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>Silicone LED clips</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>Hot glue gun</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>Female-to-bare LED connector cable</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>Female-to-male LED connector extension cable</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>20AWG 2-wire cable</td><td>LED World Lighting</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415 Splicing Connector</td><td>LED World Lighting</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

ecosysteem fabricage (ecofab) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de plant-microbe interacties

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Heilzame plant-microbe interacties bieden een duurzame biologische oplossing met de potentie om lage-input voedsel en bio-energie productie stimuleren. Een beter mechanistische inzicht in deze complexe plant-microbe interacties zal doorslaggevend zijn voor de verbetering van de plantaardige productie zoals zo goed presterende basic ecologische studies behandelende bodem-plant-microbe interacties. Hier, wordt een gedetailleerde beschrijving voor de fabricage van het ecosysteem gepresenteerd, met behulp van algemeen beschikbare 3D afdrukken technologieën, maken van gecontroleerde laboratorium habitats (EcoFABs) voor mechanistisch onderzoek naar plant-microbe interacties binnen specifieke milieu voorwaarden. Twee maten van EcoFABs worden die voor het onderzoek van microbiële interacties met verschillende soorten van planten geschikt zijn, met inbegrip van Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonen Panicum miliaceumbeschreven. Deze apparaten doorstroomtest toestaan voor gecontroleerde manipulatie en bemonstering van de wortel microbiomes, wortel chemie evenals imaging van wortel morfologie en microbiële lokalisatie. Dit protocol omvat de details voor het handhaven van de steriele omstandigheden binnen EcoFABs en montagesystemen onafhankelijke LED licht op EcoFABs. Gedetailleerde methoden voor toevoeging van verschillende vormen van media, met inbegrip van vuil, zand, en vloeibare groei media gekoppeld aan de karakterisatie van deze systemen met behulp van imaging en metabolomica worden beschreven. Samen, deze systemen inschakelen dynamisch en gedetailleerde onderzoek van de plant en plant-microbial consortia met inbegrip van de manipulatie van microbiome samenstelling (inclusief mutanten), de monitoring van de plantengroei, wortel morfologie, afgescheiden samenstelling, en microbiële lokalisatie onder gecontroleerde milieu omstandigheden. Wij verwachten dat deze gedetailleerde protocollen als een belangrijk uitgangspunt voor andere onderzoekers dienen zal, idealiter helpen maken van gestandaardiseerde experimentele systemen voor het onderzoeken van de plant-microbe interacties.

Elke EcoFAB-systeem omvat een EcoFAB-apparaat en een plant transparant plastic container formaat. Een EcoFAB apparaat heeft een reservoir van de plant, een root groei kamer een 1.6 mm stroom inlaat en een uitlaatklep van 1,6 mm voor standaard EcoFAB apparaat (figuur 2D & Figuur 3 H) of een 10 mm uitlaat voor wide-outlet EcoFAB apparaat (figuur 2F & figuur 3I ). Het reservoir van de plant is ontworpen in een trapezium vorm die een top opening van 6 mm en 3 mm onderste opening heeft, en dit ontwerp vermindert de kans op stroom lekken tijdens vloeibare injectie en zorgt er ook voor genoeg ruimte voor de plantengroei. De wortel groei kamer keurt een ovale vorm met 2 mm diepte worden uitgerust met veel model planten wortelsystemen, zoals aangegeven in figuur 2C en E. Zowel inlaat en uitlaat kanalen van een standaard EcoFAB-apparaat kunnen worden aangesloten met PTFE-buis dus nutriënten oplossingen in de wortel groei kamer stromen kunnen zonder het openen van de container EcoFAB. De wide-outlet EcoFAB apparaat sterk vermindert de stromingsweerstand van het stopcontact en wordt bij voorkeur gebruikt bij het kweken van planten met dikke wortel systemen of periodiek verzamelen wortel exsudaat nadat complexe wortel systemen zijn ontleend aan planten.
Het gieten mallen voor het fabriceren van PDMS lagen van EcoFAB apparaten worden gemaakt in een ontwerpsoftware en vervolgens 3D afgedrukt in starre ondoorzichtige fotopolymeren delen bevinden, zoals blijkt uit Figuur 2 en Figuur 3. Planten binnen EcoFABs is direct waarneembaar met een microscoop met behulp van een lange werk afstand, zorgen voor dat de steriele groeien milieu (figuur 8A, Aanvullende bestand 1). EcoFAB apparaten met planten kunnen ook passen op een hoge-resolutie Microscoop podium, waardoor hogere resolutie beeldvorming van plant-microbe interacties (figuur 8B, Aanvullende bestand 2). Steriliteit wordt niet gehandhaafd in deze omgeving, en met een hoge resolutie beeldvorming is dus alleen geschikt voor eindpunt metingen.
EcoFABs zijn ontworpen om systematische bestudering van planten, zoals hun morfologie, stofwisseling en microbiële gemeenschappen op hun verschillende groeifasen over hun levenscyclus mogelijk te maken. Hier, werden EcoFABs onderzocht als een algemene platform te bestuderen van een verscheidenheid van plantensoorten. Figuur 8C -E Toon 7 - dagen oude Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonen Panicum miliaceum groeien in EcoFABs. Alle drie de productievestigingen bleken te groeien in de EcoFAB goed voor meer dan één maand. Zowel de dicot, Arabidopsis thaliana en de monocot, bleken Brachypodium distachyon te leven tot aan de etappes van hun voortplanting in de EcoFABs.
De omkeerbare afdichtingssysteem maakt het gebruik van vaste substraten (bv., bodem) binnen de EcoFABs (stap 2.2). Deze omkeerbare afdichten benadering kunt laden van vaste substraten in wortel groei kamers en ook kunt sample collectie van bepaalde regio's van de wortel rhizospheres. Figuur 8F -H is een groep van 14 - dagen oude Brachypodium distachyon groeien in hydrocultuur medium, evenals zand en grond aangevuld met hydrocultuur medium (zand) en water (bodem) weergeven. De dunne solide substraat laag in wortel groei kamers kunt licht door te dringen via voor microscopische beeldvorming van het wortelstelsel.
Root morfologie is gedefinieerd als ruimtelijke configuratie en distributie van een wortelgestel van de plant en is goedgekeurd als een essentiële fysiologie reactie op uiteenlopende groei omgevingen, zoals een nutriënt of water beschikbaarheid32,33, 34. EcoFABs biedt een handige aanpak van het bestuderen van de morfologie van de plant na verloop van tijd of onder verschillende omstandigheden van de nutriënten. Figuur 9A-F weergeven een voorbeeld van het gebruik van EcoFABs voor het bijhouden van de wortel morphologies van Brachypodium distachyon in de eerste drie weken. Een zaailing Brachypodium distachyon overgeplaatst in het EcoFAB-apparaat, en de root-structuur werd opgenomen door een camera in een BIO-RAD gel imager. Beeld processing programma, zoals afbeelding J, python en matlab, kan verder worden toegepast om te kwantificeren van de veranderingen van de wortel morphologies na verloop van tijd of in verschillende middellange omgevingen. De kwantificering van totale wortel gebied in de loop van drie weken toonde een geleidelijke verhoging van het vroege stadium (< 1 week) gevolgd door een lineaire groeitrend volgen tot het einde van drie weken, zoals weergegeven in figuur 9G.
Een primaire motivatie voor de bouw van de EcoFAB is te onderzoeken plant-microbe interacties. Zoals beschreven in stap 5.4, worden micro-organismen overgebracht naar de wortel groei kamers van EcoFAB apparaten via het inlaat kanaal. Figuur 10 laat zien, een EcoFAB met Pseudomonas simea (voorheenfluorescens) WCS417 (WCS417), een groei van de planten bevordering van rhizobacteria met chemiluminescentie etiketten, werd toegevoegd in het wortelstelsel van de planten met een concentratie van 106 cellen per plant. Het signaal van de WCS417 werd ontdekt met een gel imager, die een verschillende ruimtelijke verdeling van WCS417 microben in wortel groei chambers aangegeven. In beide MS opgietvloeistof die met en zonder het zand solide substraat, WCS417 microben de oppervlakken van het hele wortelstelsel gekoloniseerd met microben geconcentreerd rond de wortel tip gebieden, mogelijk als gevolg van de actieve nutriënt productie van wortel tips (figuur 10G & H)35. Aan de andere kant, de microben van WCS417 in bodem substraat opgebouwd rond de plant reservoir regio in plaats van wortel tips (Figuur 10ik). Zoals de microben zijn toegevoegd via het stopcontact-kanaal, de microben waren ook in staat om te bewegen in het substraat van de bodem, maar deed niet ophopen in de hoofdmap, zoals waargenomen in vloeistof met of zonder zand. Dit kan erop wijzen dat de bodem een voldoende voedingsstoffen bron is, en de microben gemigreerd naar het reservoir van de plant voor optimale ademhaling voorwaarden.
Om te studeren metaboliet profilering van exsudaat van de wortel van de plant als metaboliet opname en vrijwaart van plant-microbe interacties, de oplossingen van de afgescheiden van de wortel groei kamers was verzameld over de verschillende groeistadia van planten in de EcoFABs. Zoals beschreven in stap 6, worden afgescheiden monsters vervolgens uitgepakt voor LC-MS-analyse. Met deze methode een scala van metabolieten uitstralen door de plant en verbruikt door de microben werd gedetecteerd en de verwante metaboliet profilering van exsudaat met en zonder microben kolonisatie van de wortel wordt momenteel onderzocht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figuur 1: het EcoFAB werkstroom. Planten zijn ontkiemd op plaat, en overgedragen aan de gesteriliseerde EcoFAB, microben kunnen worden toegevoegd. Niet-destructieve bemonstering: exsudaat van de wortel kunnen worden bemonsterd beeld en morfologie van de wortel kan worden gevisualiseerd. Destructieve bemonstering kunt analyse van microbe, wortel en schieten parameters in detail.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figuur 2: de onderdelen van 3D afgedrukt mallen voor EcoFAB apparaat fabrikatie. (A) boven- en schuin uitzicht op een casting-frame. (B) boven- en schuin uitzicht op een invoegen. (C) boven en schuin uitzicht op basis van de standaard schimmel. (E) boven- en gekanteld weergaven voor een wide-outlet schimmel base. (D, F) Geassembleerde mallen voor het fabriceren van standaard en wide-outlet EcoFAB apparaten, respectievelijk. De ovale afmetingen zijn 51 x 34 mm voor kleine EcoFAB schimmel en 76 x 62 mm voor grote EcoFAB schimmel. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figuur 3: EcoFAB apparaat fabricage. (A) gieten het mengsel van elastomeer basis en genezen agent in de mal. (B) Verwarming de mal met mengsel bij 85 ° C gedurende 4 h. (C) het inzetstuk verwijderen van de schimmel. (D) het scheiden van het PDMS van het gieten frame. (E) duwen de mal base uit het frame gieten. (F) het gebruikmaken van een mes te scheiden van het PDMS van de mal langs de randen. (G) peeling de PDMS laag langzaam uit de mal base. (H) Poking gaten voor zowel de inlaat en de uitlaat kanalen van de standaard PDMS laag. (I) prikken een gat voor het inlaat kanaal van de wide-outlet PDMS laag. (J) de PDMS laag (gemaakt van een 15:1-elastomeer basis om te genezen van agent mengsel) een microscoopglaasje gespoeld en overgebracht naar een plasma reiniger voor hechting. De klemmen van de (K) gebruiken om de PDMS laag (gemaakt van een 5:1 elastomeer base om te genezen van agent mengsel) op een microscoopglaasje. (L) op te drukken de PDMS laag (gemaakt van een 30: 1 uit elastomeer base om te genezen van agent mengsel) direct op een microscoopglaasje. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figuur 4: het ontwerp van aangepaste klemmen. (A) boven- en schuin uitzicht op een top Klemplaat. (B) boven- en schuin uitzicht op een bodem Klemplaat. (C) boven en schuin uitzicht op geassembleerde klem met vier sets van hex cap schroeven. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figuur 5: installeren van LED verlichting groeien. (A) markering uit de locaties voor 9 LED clips in een spiraal rond de container EcoFAB. (B) LED clips toegevoegd aan de container EcoFAB. (C) threading een LED-strip via deze clips. (D) verbinden met de LED-strip een controller wired met een 24V-voeding. (E) het schema van draad verbindingen naar de domeincontroller. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figuur 6: zaailingen overgeplaatst naar EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon planten gekweekt voor 2 dagen op een 0.5 MS plaat. (B) de wortel kamer te vullen met plant groeimedium. (C) met behulp van een pincet schuif voorzichtig de hoofdmap in het reservoir van de plant. (D) het afdichten van de EcoFAB container met schoon tape, na toevoeging van 3 mL water aan de onderkant van de container. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figuur 7: NIMS beeldvorming van plant wortels in EcoFABs. (A) een Brachypodium distachyon groeien in een steriele EcoFAB. (B) bevestigen de PDMS laag met de plant op een chip van de NIMS voor 20 min. (C) werken met koperen tape te koppelen van de NIMS chip op een aangepaste MALDI-bord, en het laden in een massaspectrometer MALDI. (D-G) een 7 - dagen oude en een 20 - dagen oude Brachypodium distachyon plant gebruikt voor NIMS imaging (D, E) en de bijbehorende beelden van de NIMS (F, G). De overheersende ionen waren gemarkeerd in rood, groen en blauw. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figuur 8: de algemene toepassingen van EcoFABs. (A) direct vastleggen wortelgroei van Brachypodium distachyon in een EcoFAB met een lange werk afstand Microscoop setup. (B) direct observeren wortel-microbe interacties met een hoge resolutie Microscoop setup. Panicum miliaceum (E) op 0.5 MS hydrocultuur medium (F-H) 14 - dagen oude Brachypodium distachyon gegroeid in 0.5 MS hydrocultuur (F), in zand (G) en de bodem (H), (C-E) 7 - dagen oude Arabidopsis thaliana (C) en Brachypodium distachyon (D) het substraat wordt geleverd met 0.5 MS medium en water, respectievelijk. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figuur 9: met behulp van EcoFABs te bestuderen van de morfologie van de root. (A-F) Root ontwikkeling van Brachypodium distachyon groeien in EcoFABs gevuld met 0.5 MS medium tijdens de eerste drie weken: (A) 2 dagen, (B) 4 dagen, (C) 7 dagen, (D) 11 dagen, (E) 14 dagen, (F) 21 dagen van de groei. (G) de gemiddelde wortel oppervlakten werden geraamd door ImageJ software. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figuur 10: met behulp van EcoFABs te bestuderen van wortel-microbe interacties. (A, B, C) Een groep van 15 - dagen oude Brachypodium distachyon koloniseren met Pseudomonas fluorescens WCS417 in verschillende vormen van media-MS vloeibare oplossing, zand en grond substraten. (D, E, F) Helder veld foto's van hun wortelstelsel. (G, H, I) De overeenkomstige chemiluminescentie beelden van deze wortelstelsel na 14 dagen co teelt. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende bestand 1. Met behulp van EcoFAB te vangen wortelgroei. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 2. Met behulp van EcoFAB te vangen wortel-microben interacties. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor ecosysteem fabrikatie van apparaten (EcoFABs) waarmee de studies van planten en plant-microbe interacties in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.

Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Het algemene doel van dit protocol is om gestandaardiseerde benaderingen te definiëren voor de constructie van vereenvoudigde modelplant-ecosystemen, EcoFAB's genaamd, die gecontroleerde, gerepliceerde laboratoriumexperimenten mogelijk maken om plant-microbe-interacties te onderzoeken die verder getest kunnen worden in het veld. Deze methode kan worden gebruikt om plant-microbe-interacties te bestuderen binnen gecontroleerde omgevingen, waardoor we gedetailleerde mechanistische inzichten kunnen krijgen in de functies van microbiomen om ze te kunnen benutten voor duurzame landbouw. We hielpen bij het ontwerpen van deze eerste Eco-FAB, die een verscheidenheid aan beschikbare 3D-printtechnologieën gebruikt en om de plantengroeikamers te steriliseren die zowel niet-storende hoge resolutie beelden als chemische analyse mogelijk maken.Het hier ontwikkelde Eco-FAB-apparaat is goed geschikt voor de analyse van plant-microbe-interacties omdat het de analyse van wortelmorfologie en massaspectroscopische beeldvorming omvat. Na de constructie van Eco-FAB-malen, met behulp van 3D-printen volgens het tekstprotocol, in een wegwerpbare liter container, meng 40 milliliter siloxaan elastomeerbasis met verschillende volumes van verhardingsmiddel, afhankelijk van het experiment. Plaats de container minimaal 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen uit het elastomeermengsel te verwijderen.Verwijder vervolgens het mengsel en giet het in de geassembleerde 3D-geprinte kunststof mal. Om een uniforme PDMS-laag te genereren, moeten luchtbellen zorgvuldig worden verwijderd. Gebruik perslucht om eventuele luchtresten weg te blazen nadat het mengsel in de mal is overgebracht.Houd de mal op een verwarmingsblok van 85 graden Celsius gedurende vier uur. Laat de mal vijf minuten afkoelen. Trek vervolgens voorzichtig de inleg uit de mal en gebruik een utilitymes om de PDMS langzaam van het gietframe te scheiden.Druk de malbasis met PDMS omhoog uit het gietframe. Gebruik vervolgens een mes of andere gereedschappen om de PDMS-laag voorzichtig van de malbasis te scheiden aan de randen en trek hem langzaam van het maloppervlak. Maak met een 15 gauge stompe naald een inlaatkanaal op de PDMS-lagen door gaten van 1,6 millimeter in dat deel te maken.Gebruik vervolgens een schaar om de randen van de PDMS-lagen bij te knippen. Gebruik methanol om de hechtingszijde van de PDMS-laag bij een microscoopglasplaat van 7,6 bij vijf centimeter te spoelen en blaas ze droog met perslucht of een ultrapuur stikstofpistool. Plaats de microscoopglasplaat en PDMS-laag in een plasmareiniger met hun hechtingszijden naar boven.Sluit de kamer en de gasontluchtingsklep. Zet vervolgens de vacuüm aan en pomp de kamer een minuut lang leeg. Zet de plasmagenerator in en schakel de radiofrequentie of RF-niveau gedurende een minuut naar hoog.Schakel vervolgens zowel de vacuümpomp als de plasmakracht uit en laat de kamer ontluchten naar de atmosfeer. Haal de microscoopglasplaat en PDMS-laag uit de plasmakamer en druk snel alle vier de randen van de PDMS-laag met gelijkmatige druk op de plaat. Zorg ervoor dat het centrale ovale gebied, dat de wortelkamer is, de plaat niet raakt.Spuit de Eco-FAB-apparaten met ultrapuur water. Plaats een Eco-FAB-apparaat in een Eco-FAB-container en voeg 70% ethanol toe tot het apparaat ondergedompeld is. Sluit vervolgens het deksel van de container en schud het voorzichtig om alle oppervlakken binnenin met ethanol te bevochtigen, zorg ervoor dat de wortelgroeikamer van het Eco-FAB-apparaat gevuld is met ethanol, met zeer weinig of geen luchtbellen.Na incubatie van de apparaten gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, giet de 70% ethanol er af en vervang het door 100% ethanol. Incubeer vervolgens de apparaten gedurende vijf minuten. Na de incubatie, giet de ethanol af en laat de gesteriliseerde Eco-FAB 16 uur in een Laminaire Stroomkast drogen.Als beschikbaar, steriliseer het systeem door de UV-lamp in de kast gedurende een uur aan te zetten. Om zaadsterilisatie en kieming uit te voeren, week de zaden gedurende twee minuten in 70% ethanol. Vervolgens, met een pipet, verwijder het ethanol en gebruik steriel water om de zaden drie keer te spoelen.Week vervolgens de zaden gedurende vijf minuten in een 10% bleekmiddeloplossing. Verwijder vervolgens de bleekvloeistof en gebruik steriel water om de zaden drie keer grondig te wassen. Na de wasbeurten, voeg steriel water toe aan de zaden en incubeer de buis gedurende zeven dagen bij vier graden Celsius.Verspreid de zaden gelijkmatig op 0,5 Murashige en Skoog, of MS-medium, met 0,6% vitagel. En verzegel de platen met micropore tape. Laat vervolgens de planten groeien tot een wortellengte van ongeveer vijf milliliter.Om de zaailingen in Eco-FAB's over te brengen, gebruik een steriele spuit of micropipet en steriel water, spoel de wortelkamer van een Eco-FAB-apparaat drie keer door en vul vervolgens de wortelkamer met het groeimedium van belang, zoals 0,5 MS-medium. Plaats nu voorzichtig een enkele zaailing in het plantenreservoir van het Eco-FAB-apparaat. Het is belangrijk dat de zaailingen voorzichtig van plaat naar Eco-FAB worden overgebracht, zodat de wortels niet breken.Voeg drie milliliter steriel water toe aan de container, vermijd het Eco-FAB-apparaat. Dit zal de luchtvochtigheid verhogen en de verdamping van het medium uit de wortelkamer verminderen. Sluit vervolgens de container en gebruik micropore tape om het deksel te verzegelen.Plaats de Eco-FAB in een plantenincubator, of gebruik het Eco-FAB-verlichtingssysteem in een omgeving met gecontroleerde temperatuur die geschikt is voor de groei van de betreffende plant. Stel vervolgens de kamer in op 24 graden Celsius. Voer ten slotte metabolietprofilering en massaspectrometrie uit, volgens het tekstprotocol.Deze figuren tonen zeven dagen oude Aaabidopsis thaliana, brachypodium distachyon en panicum virgatum die in Eco-FAB's groeien. Zowel de dicot als de monocot bleken in

ecosystem-fabrication-ecofab-protocols-for-construction-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Microfluïdische apparaten kunnen worden gebruikt om complexe natuurlijke processen in real-time en op het juiste fysieke schalen te visualiseren. We hebben een eenvoudige microfluïdische apparaat dat de belangrijkste functies van de natuurlijke poreuze media nabootst voor het bestuderen van de groei en het transport van bacteriën in de ondergrond.

Venster op een Microworld: Eenvoudig Microfluïdische Systemen voor het bestuderen van microbiële transport in poreuze media

Source: Nathoo, N., et al. A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a hydroponic co-cultivation system for studying plant–bacteria interactions under sterile conditions. Plant seedlings are transferred into a sterile, acidic growth medium, incubated, and inspected for contamination before inoculation with Agrobacterium. The activated bacteria attach to plant...

A Co-Cultivation System to Study the Molecular Responses of Plant Hosts and Interacting Bacteria

De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van factoren, waaronder milieu-architectuur, lidmaatschap, eigenschappen en interacties. Dit protocol beschrijft een synthetische microfabriek die gelijktijdig wordt bijgehouden van duizenden gemeenschappen in femtoliterputten, waar sleutelfactoren zoals nisgrootte en bevalling kunnen worden benaderd.

Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.

Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Een snelle en gestandaardiseerde procedure voor het opzetten van synergetische multispecies biofilmgemeenschappen uit verschillende rhizosfeerbodems wordt hier gepresenteerd. Het is een uniek protocol dat is ontworpen om de complexe bodemmicrobiota van de rhizosfeer te onderzoeken en te simuleren.

Een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer

Hier presenteren we een studie die is opgezet in de iDiv Ecotron, terrestrische mesokosmoskamers met gecontroleerde omgevingscondities boven en onder de grond, om de onafhankelijke en interactieve effecten van plantgeschiedenis en bodemgeschiedenis op het functioneren van ecosystemen van graslandgemeenschappen langs een plantendiversiteitsgradiënt te bestuderen.

JenaTron - Een experimentele benadering om de effecten van plantgeschiedenis en bodemgeschiedenis op het functioneren van graslandecosystemen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de assemblage van mini-bioreactorarrays die moeten worden gebruikt voor continue stroomcultuur van complexe fecale gemeenschappen onder anaërobe omstandigheden. We bespreken ook de methoden voor assemblage, inoculatie en bemonstering van de reactoren voor verdere analyse.

Bioreactorassemblage voor continue cultuur van complexe fecale gemeenschappen

De Minibioreactor Array (MBRA) is een high-throughput, aanpasbaar continuous-flow cultuursysteem dat de teelt van complexe microbiële gemeenschappen mogelijk maakt, ter ondersteuning van parallelle experimenten om de dynamiek van het microbioom, therapeutische interacties en microbiële reacties op omgevingsfactoren te bestuderen.

Bijgewerkt protocol voor de assemblage en het gebruik van de Minibioreactor Array (MBRA)

Leer gestandaardiseerde EcoFAB-protocollen voor het bouwen van laboratoriumecosystemen om plant-microbe-interacties te bestuderen. Deze methode biedt mechanistische inzichten in microbioomfuncties voor duurzame landbouw.

Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties (Video) | JoVE Journal

Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties

Meer video's verkennen