Name: Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Ontdek methoden voor de vorming van covalente DNA-adducten door enzymatisch geactiveerde carcinogenen en geneesmiddelen in vitro. Deze techniek helpt onderzoekers de carcinogene potentie van chemische stoffen te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door Tsjechische Science Foundation (GACR, grant 17-12816S).

De auteur heeft niets te onthullen.

In deze paper wordt aangetoond een breed toegankelijke methode om te studeren van de potentie van chemische stoffen als bioactivated metabole tussenproducten, resulterend in de generatie van covalente DNA adducten. Dit is een cruciaal probleem, omdat de evaluatie van de potentie van milieu chemicaliën of drugs van hun enzymatische activatie te metabolieten genereren covalente DNA adducten is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. De wijziging van DNA door kankerverwekkende stoffen be...

Het metabolisme van xenobiotica (milieu chemicaliën of drugs) vindt plaats in twee fasen1. Fasen I en II willen maken van de oorspronkelijk hydrofobe (niet oplosbare) stoffen meer hydrofiele (in water oplosbaar), waardoor ze gemakkelijk excretable zijn via urine, ontlasting of zweet. Fase I (functionalization) Reacties omvatten oxidatie, vermindering, en hydroxylering gekatalyseerd door enzymen zoals cytochroom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (dwz., cyclooxygenase, COX), aldo-keto-reductases (AKRs), en microsomale Flavin-bevattende monooxygenases (FMO). Fase I bevat ook vermindering reacties, gemedieerd door een scala aan reductases dat wil zeggen, microsomale NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytosolische NAD (P) quinone oxidoreductasen (NQO1), xanthine oxidase (XO) en aldehyde oxidase (AO)1 . In de tweede fase (conjugatie), de functionele groepen die gekoppeld waren in fase zijn ik gewend conjugaat kleine polaire moleculen verder verhogen de polariteit. Voorbeelden van enzymen beschouwd om deel te nemen in de reactie van fase II omvatten sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases zoals catechol -O- methyltransferase (COMT), glutathione S- transferasen (GSTs), en uridine difosfaat glucuronosyltransferases (UGTs)1. De indeling van de enzymen in fase I of II is, echter, niet stijf, en sommige enzymen aantoonbaar kunnen worden gegroepeerd in beide categorieën.
P450 enzymen (EG 1.14.14.1) zijn de Heem met eiwitten aanwezig in verschillende organismen, die deelnemen aan de biotransformatie van veel chemische stoffen, hun conversie3,4te katalyseren. De P450 enzymen katalyseren hydroxylatie van vele verschillende ondergronden, met een reactie waar één atoom van dioxygen is ingevoerd in de molecule van xenobiotica, terwijl het tweede atoom zuurstof is teruggebracht tot vorm water door de reactie die twee elektronen [de vergelijking (1 vereist )]3,4:
RH + O2 NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)
P450 enzymen gelokaliseerd in het membraan van het endoplasmatisch reticulum van zoogdiercellen (microsomale P450-systemen) zijn leden van de multi monooxygenase-systeem, waarin verder NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytochroom b5 , het substraat voor het enzym genoemd als NADH: cytochroom b5 reductase. Een algemeen aanvaarde theorie veronderstelt dat de donor van de twee elektronen die nodig zijn voor de P450 het NADPH/POR-systeem is. Niettemin kan cytochroom b5 ook fungeren als een donor van elektronen voor P450, namelijk als donor van het elektron verminderen van P450 tijdens tweede verlaging van haar reactie-cyclus, waar het fungeert samen met NADH: cytochroom b5 reductase2,3,4.
Zoogdieren gebruiken verschillende P450 enzymen (bijvoorbeeld de enzymen van gezinnen 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 en 27) voor de synthese van waardevolle endogene stoffen, zoals steroïden, en ze gebruiken voor katabolisme van natuurproducten2,3 . De andere CYP zoogdieren enzymen, zoals menselijke CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 en 3A4, metaboliseren exogene chemicaliën die worden gebruikt als geneesmiddel. 5 , 6 de belangrijkste enzymen katalyseren metabolisme van drugs zijn CYPs van de onderfamilie 3A, vooral CYP3A4. De conversies van xenobiotica, zoals pro-kankerverwekkende stoffen en pro-toxische stoffen, zijn gemedieerd door menselijke CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 en 3A42,5. De meeste van deze CYPs zijn aanwezig in de lever (behalve CYP1A1 en 1B1). De CYPs zijn echter eveneens uitgedrukt in verscheidene extrahepatic organen. Dergelijke P450s zou van grote betekenis, voornamelijk wanneer nemen ze in bioactivation metabolisme van chemische stoffen (drugs) aan reactieve intermediairen in deze organen7. Verschillende P450s worden veroorzaakt door de diverse verbindingen die hun substraten, maar dit niet noodzakelijkerwijs het geval is.
Vele P450 enzymen spelen een rol in de (drug) chemische toxiciteit. Zij kunnen de xenobiotica omzetten niet alleen in hun metabolieten van detoxificatie, maar ook activeren hen reactieve soorten, waarvoor wijzigen van endogene macromoleculen die bovendien verschillende biologische eigenschappen, meestal veroorzaakt door hun toxiciteit vertonen. DNA, lipiden en eiwitten mogelijk de doelstellingen voor hun wijziging door reactieve elektrofielen en radicalen gegenereerd op basis van geactiveerde chemicaliën. In het geval van DNA, oplossen van verschillende belangrijke gene reacties en hun mechanismen zijn al bekend2,3,4,5.
De veranderingen in DNA kunnen resulteren in een afname van de cel groei controle, en dit verschijnsel wordt beschouwd als de overheersende factor die leidt tot de ontwikkeling van kankerverwekkende processen. De generatie van covalente DNA adducten met chemische stoffen die kankerverwekkend vermogen wordt beoordeeld als een van de belangrijkste stappen in de initiatie fase van kankerverwekkende8,9,10,11 processen. Het bleek dat de relaties tussen de vorming van DNA adducten en tumorvorming optreden, terwijl een daling in de hoeveelheid DNA adducten is verantwoordelijk voor chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. de vorming van kankerverwekkende stof/drug-afgeleid DNA adducten is afhankelijk van individuele basissen van DNA, en wordt beïnvloed door de volgorde van deze basen in DNA. De reparatie van DNA adducten zijn afhankelijk van hun locatie (op de getranscribeerde of niet-getranscribeerd bundel van DNA) en soorten gemodificeerde nucleotide sequences8,11,12,15, 16.
In dit artikel beschrijven we procedures met behulp van het enzym-gekatalyseerde conversie van chemische stoffen (drugs) te onderzoeken hun potentie te worden geactiveerd in metabolieten die gemodificeerd DNA (genereren van DNA adducten). Covalente binding van DNA, de teststof moet meestal worden geactiveerd door oxidatieve of reductieve reacties, afhankelijk van individuele geneesmiddelen. Oxidatieve of reductieve activering van geteste chemische stoffen wordt gemedieerd door een P450-afhankelijke enzymatische systeem aanwezig in de microsomale subcellular fractie of door reductie met reductases presenteren zowel in microsomes (POR, NADH: cytochroom b5 reductase, P450 enzymen) en cellulaire cytosolische subcellular breuken (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reactieve metabolieten daarna binden aan DNA vorming DNA adducten. Omdat zowel oxiderende en reducerende reacties belangrijk zijn voor het activeren van deze reactieve soorten verschillende drugs, worden de experimentele procedures met de enzymatische oxidatie/verwijderingssysteem beschreven. Bovendien, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van deze DNA adducten in detail worden beschreven.
Twee onafhankelijke procedures om te bepalen of de teststof, geactiveerd door enzymatische systems, is gebonden aan DNA worden aanbevolen: de 32P-postlabeling techniek en met behulp van radioactief gelabelde stof (bijv., 3H of 14 C). Voor de eerste wordt piloot, screening van de 32P-postlabeling bepaling aanbevolen. De bepaling van het DNA-gehalte in oplossingen, juist geëvalueerd, moet voorafgaan aan beide methoden.
De 32P-postlabeling techniek maakt gebruik van de enzymatische hydrolyse van DNA gewijzigd door niet-radioactieve chemische producten (carcinogeen/drug) 3´-phosphodeoxynucleosides, extra fosforylatie met radioactief fosfor (32P) bij de 5´- OH adducten positie, en de scheiding van chemische-deoxynucleotide van normale (ongewijzigde) deoxynucleotides door chromatografie17 (Figuur 1). DNA gewijzigd door een chemische verbinding is gehydrolyseerd door een mengsel van endonuclease en micrococcal nuclease exonuclease, bekend als fosfodiësterase milt. Het mengsel van gehydrolyseerde DNA dat beide normaal (ongewijzigd) bevat en bewerkt deoxyribonucleoside 3´-monophosphates is gereageerd met [γ -32P] ATP in het bijzijn van de vervoerder (niet-radioactieve) ATP en T4-polynucleotide kinase bij pH 9,5 naar formulier 5´- 32P-label 3´, 5´-bisphosphates ("standaard" procedure in Figuur 1). De gebruikte alkalische pH is geschikt voor het minimaliseren van de enzymactiviteit van T4-polynucleotide kinase aan dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates op positie 3´. Scheiding en resolutie van 32P-geëtiketteerden adducten van gelabelde deoxynucleotides die niet zijn gewijzigd door chemische stoffen wordt uitgevoerd door meerdere richtingen anion-uitwisseling Dunnelaagchromatografie (TLC) op polyethyleneimine (PEI) cellulose (Figuur 2 ). In de eerste en tweede elutie stappen (in de richting van D1 en D2), worden gelabelde normale (ongewijzigde) deoxynucleotides evenals [32P] fosfaat geëlueerd vanaf het begin van de plaat van de TLC-PEI-gemengd met cellulose met behulp van water oplossingen van elektrolyt op een kort stukje chromatografische papier toegepast op de bovenkant van de TLC-plaat, dat het deoxynucleotides gebonden chemicaliënhoudend exposeren hydrofobe eigenschappen (carcinogeen/drug-adducten) gehandhaafd aan het begin van PEI-gemengd met cellulose plaat blijven worden bovendien opgelost met verschillende oplosmiddel systemen in D3 en D4 richtingen (Figuur 2). Lokalisatie van adducten wordt uitgevoerd met behulp van autoradiografie scherm verbeterd; de gescheiden adducten die worden herkend als donkere herkenbare plekken op X-ray films. De gebieden van spots zijn weggesneden uit de plaat en gebruikt te kwantificeren van de radioactiviteit door vloeibare scintillatietelling of Cerenkov tellen. Een opslag fosfor imaging methode die aangepast is voor kaart en kwantificeren van DNA adducten op chromatogrammen gedetecteerd door de 32P-postlabeling assay wordt nu ook gebruikt. 18 the Instant Imager machine wordt vaak gebruikt voor dergelijke detectie en kwantificering van DNA adducten. Deze methode biedt meer dan 10 - keer hogere gevoeligheid voor het opsporen van 32P dan de techniek van het scherm verbeterd autoradiografie19.
Hoeveelheid DNA adducten als waarden van relatieve labeling (RAL) adduct, berekend met behulp van de vergelijking (2) als volgt worden bepaald:
CPM. in adduct deoxynucleotides RAL =---(2) specifieke activiteit van 32P-ATP (in cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides
De waarden van de RAL's zijn de verhouding tussen de tarieven van de graaf van deoxynucleotides geadduceerd over graaf tarieven van totaal [geadduceerd en normale (ongewijzigde) deoxynucleotides]2120,deoxynucleotides. Echter, deze berekening is gebaseerd op gelijke etikettering efficiëntie van adducten en normale deoxynucleotides22. De klassieke ("standaard") procedure van de 32P-postlabeling techniek is geschikt voor verschillende DNA adducten (omvangrijk en/of niet-omvangrijk adducten), de gevoeligheid is echter niet bevredigend te detecteren adducten gevonden in lage bedragen in DNA. Met deze procedure, is het bedrag van een adduct in 107 ongewijzigd deoxynucleotides in DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) aantoonbaar.
Een aantal wijzigingen van deze klassieke 32P-postlabeling procedure hebben gebruikt te verheffen van de gevoeligheid van de techniek. Maximaal 10 tot 100 keer hogere gevoeligheid van bepaling van adducten door 32P-labeling is geboekt met behulp van beperkende niveaus van [γ -32P] ATP (de intensivering procedure). 23 , 24 een verdere procedure die dat een toename van de gevoeligheid van de 32P-postlabeling-methode maakt gebruik van een incubatie verteerd DNA bevatten adducten met nuclease P1 (van Penicillium citrinum)21 (Figuur 1). Dit enzym verkiest te ongewijzigde deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate, overwegende dat de deoxynucleotides met afhankelijke chemicaliën (geadduceerd nucleotiden) in wezen niet de substraten van dit enzym zijn. Daarom gedefosforyleerd deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (d.w.z., deoxyribonucleosides) zijn niet phosphorylated door T4-polynucleotide kinase door [32P] fosfaat uit γ -32P] ATP. Echter, sommige van nucleotiden waar chemicaliën zijn gebonden (geadduceerd deoxynucleotides), zoals arylamine adducten vervangen bij C8 van deoxyguanosine, kan bedephosphorylated door dit enzym. In tegenstelling, de meeste andere adducten (b.v.adducten vervangen op N2 voor deoxyguanosine) zijn niet gedefosforyleerd door nuclease P1. Deze wijziging van 32P-postlabeling maakt deze methode aanzienlijk gevoeliger, verhogen van de gevoeligheid van meer dan drie ordes van grootte. Bovendien, deze versie van 32P-postlabeling biedt een methode waar hogere hoeveelheden DNA (5-10 µg) en een overmaat aan vervoerder-vrije [γ - 32P] ATP kan worden gebruikt.
Een andere methode te verrijken de adducten, beschreven door Gupta25, maakt gebruik van de fysisch-chemische eigenschappen van de omvangrijke deoxynucleotide adducten, die kan worden gewonnen in n-butanol in aanwezigheid van een fase transfer agent tetrabutylammoniumwaterstofsulfaat chloride (TBA) (Figuur 1) vóór [32P] fosfaat labeling, overwegende dat ongewijzigde deoxynucleotides slecht worden geëxtraheerd door dit organisch oplosmiddel. Echter, minder hydrofobe adducten, bestaande voor voorbeeld van deoxynucleotides gemodificeerde met niet-aromatische omvangrijk wordt of kleine alkyl residuen, zijn niet effectief gewonnen met n-butanol. Vandaar, zijn zij in wezen niet op te sporen wanneer zijn geanalyseerd door deze wijziging van de 32P-postlabeling methode.
Zowel de eerder genoemde versie van 32P-postlabeling verhoging van de gevoeligheid en de kwantificering van DNA adducten enorm (tot drie ordes van grootte), zijnde kundig voor speurder een adduct per 109,10 normale nucleotiden (0.3 - 3 amol/µg DNA). Deze twee methoden worden aanbevolen voor het testen van de chemicaliën voor hun efficiëntie covalent binden aan DNA en daarom worden ze beschreven in dit werk in details.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Roth</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td><td>Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>Kalfsthymus DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-fosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-fosfaatdehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomes</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke lever microsomen</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypyrimidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Di-ethylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease van Staphylococcus aureus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Spleen fosfodiësterase van kalfsspleen, Type II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease P1 van Penicillium citrinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammoniumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-polynucleotidekinase</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI-geïmpregneerde cellulose TLC platen</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitrobenzantron</td><td>bereid (gesynthetiseerd) zoals weergegeven in ref. 40</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorming van covalente dna adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en drugs in vitro en hun vastberadenheid door 32p-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Covalente DNA adducten gevormd door chemicaliën of drugs met kankerverwekkend vermogen worden beoordeeld als een van de belangrijkste factoren in de initiatie fase van kankerverwekkende processen. Deze covalente binding, die wordt beschouwd als de oorzaak van tumorvorming, wordt nu geëvalueerd als een centrale dogma van chemische carcinogenese. Hier worden de methoden beschreven die de reacties gekatalyseerd door cytochroom P450 en extra biotransformatie enzymen te onderzoeken van de potentie van chemicaliën of drugs voor hun activatie naar metabolieten vormen deze DNA adducten. Procedures worden gepresenteerd met een beschrijving van het isolement van cellulaire breuken bezitten biotransformatie enzymen (microsomale en cytosolische monsters met cytochromes P450 of andere biotransformatie enzymen, dat wil zeggen, Peroxidasen, NADPH: cytochroom P450 oxidoreductasen, NAD (P) quinone oxidoreductasen of xanthine oxidase). Bovendien worden de methoden beschreven die kunnen worden gebruikt voor de metabole activering van geanalyseerde chemische stoffen door deze enzymen, alsmede die voor isolatie van DNA. Verder, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van de chemische stof/drug-afgeleid DNA adducten, d.w.z., verschillende wijzigingen van de 32P-postlabeling techniek en werkgelegenheid van de radioactieve gelabelde geanalyseerd van chemische stoffen, zijn in detail weergegeven.

Met behulp van de protocollen die hier beschreven voor het gebruik van enzym-gekatalyseerde activering (dat wil zeggen, P450 peroxidase, reductase) te onderzoeken van de potentie van chemische stoffen (kankerverwekkende stoffen/drugs) om te worden gemetaboliseerd tussenproducten resulterend in hun covalente binden aan DNA (generatie van DNA adducten), we waren in staat om op te lossen (i) een nieuw mechanisme van de farmacologische werking van de ellipticine van antikanker agent ...

Evaluatie van de potentie van milieu chemische stoffen en drugs, enzymatisch worden bioactivated op tussenproducten genereren covalente DNA adducten, is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. Methoden worden beschreven voor samengestelde activering aan formulier die DNA, evenals de technieken voor de detectie en kwantificering adducten.

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Het algemene doel van dit protocol is de beschrijving van methoden die gebruik maken van de reacties gekatalyiseerd door cytochroom p450 en aanvullende biotransformatie-enzymen om de potentie van chemicaliën of geneesmiddelen voor hun activering tot metabolieten die covalente DNA-adducten vormen, te onderzoeken. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen op het gebied van de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan te beantwoorden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het u een type methode laat zien om de potentie van omgevingschemicaliën of geneesmiddelen om covalente DNA-adducten te vormen, die de initiatie van kankerontwikkeling vertegenwoordigen, te evalueren.De implicaties van de techniek die de carcinogene potentie van chemicaliën bepaalt. De omgevingspotentie, toxicanten en geneesmiddelen bepalen ook relatief eenvoudige methoden voor de vorming van covalente DNA-adducten gevormd door dergelijke verbindingen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de initiatie van de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan, kan deze ook worden toegepast in andere wetenschappelijke vakgebieden.Zoals studies van moleculaire mechanismen, van DNA-schade en orale s

formation-covalent-dna-adducts-enzymatically-activated-carcinogens

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Tonen we de montage en de toepassing van een moleculaire schaal apparaat aangedreven door een topoisomerase eiwit. Het construct is een bio-moleculaire sensor die twee belangrijke soorten van DNA breuken in weefselcoupes labels door het aanbrengen van twee verschillende fluoroforen om hun doel.

In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

Radicaal gebaseerde biomimetische chemie werd toegepast op opbouw libraries nodig biomarkerontwikkeling.

Free Radicals in Chemical Biology: van chemische gedrag tot Biomarker Development

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Het doel van dit protocol is te kwantificeren van het herstel van gedefinieerde DNA-proteïne crosslinks op plasmide DNA. Lesioned plasmiden zijn transfected in ontvangende zoogdieren cellijnen en laag-moleculair gewicht geoogst op meerdere tijd punten na transfectie. DNA repair kinetiek worden gekwantificeerd aan de hand van strand-specifieke primer uitbreiding gevolgd door qPCR.

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Ontdek methoden voor de vorming van covalente DNA-adducten door enzymatisch geactiveerde carcinogenen en geneesmiddelen in vitro. Deze techniek helpt onderzoekers de carcinogene potentie van chemische stoffen te beoordelen.

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling (Video) | JoVE Journal

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door ³²P-postlabeling

Meer video's verkennen