Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling
20 maart 2018
Evaluatie van de potentie van milieu chemische stoffen en drugs, enzymatisch worden bioactivated op tussenproducten genereren covalente DNA adducten, is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. Methoden worden beschreven voor samengestelde activering aan formulier die DNA, evenals de technieken voor de detectie en kwantificering adducten.
Het algemene doel van dit protocol is de beschrijving van methoden die gebruik maken van de reacties gekatalyiseerd door cytochroom p450 en aanvullende biotransformatie-enzymen om de potentie van chemicaliën of geneesmiddelen voor hun activering tot metabolieten die covalente DNA-adducten vormen, te onderzoeken. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen op het gebied van de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan te beantwoorden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het u een type methode laat zien om de potentie van omgevingschemicaliën of geneesmiddelen om covalente DNA-adducten te vormen, die de initiatie van kankerontwikkeling vertegenwoordigen, te evalueren.
De implicaties van de techniek die de carcinogene potentie van chemicaliën bepaalt. De omgevingspotentie, toxicanten en geneesmiddelen bepalen ook relatief eenvoudige methoden voor de vorming van covalente DNA-adducten gevormd door dergelijke verbindingen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de initiatie van de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan, kan deze ook worden toegepast in andere wetenschappelijke vakgebieden.
Zoals studies van moleculaire mechanismen, van DNA-schade en orale studies over enzymatische activering en de toxicatie van chemicaliën. Ik hoorde voor het eerst het idee voor deze methode toen ik processen onderzocht die betrokken waren bij de initiatiefase van chemische carcinogenese. Bereid eerst het incubatiemengsel voor door alle verbindingen en enzymsystemen toe te voegen tot een eindvolume van 0,75 milliliter bij vier graden Celsius.
Dit is om de carcinogeen met het DNA te incuberen in aanwezigheid van cytochroom p450. Voeg vervolgens microsomen of zuiver recombinant p450 in supersome toe aan het mengsel. Voeg vervolgens 7,5 microliter 0,1 millimolair ellipticine-geneesmiddel opgelost in DMSO en 42,5 microliter water toe om het eindvolume op 0,75 milliliter aan te passen.
Meng vervolgens de componenten door de buis gedurende vijf seconden te vortexen. Direct daarna, incubeer de buis gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius met het deksel open. Meng vervolgens fenol of fenol-chloroform in een verhouding van een op een met het incubatiemengsel in een Eppendorf-buis.
Dit zal de eiwitverontreiniging van het DNA in het incubatiemengsel verwijderen. Roer vervolgens het mengsel om een emulsie te vormen. Draai vervolgens het mengsel drie minuten bij een omgevingstemperatuur van 1600 keer g.
Zodra de centrifugatie voorbij is, gebruik een pipet om de bovenste waterfase over te brengen naar een nieuwe polypropyleenbuis. Gooi vervolgens de eiwitinterface samen met de organische fase weg. Meng vervolgens de waterfase met een equivalent volume fenol en chloroform in een verhouding van een op een.
Herhaal vervolgens de centrifugatie. Voeg vervolgens gelijke volumes chloroform toe aan de verzamelde waterfase en centrifugeer opnieuw. Bezinken vervolgens het DNA uit de waterige fase door twee volumes koude ethanol aan te voegen, gehandhaafd op min 20 graden Celsius.
Meng vervolgens de oplossing goed. Om de DNA-adducten te labelen, meng de bicine-bufferoplossing met radioactief gelabelde ATP-oplossing om de DNA-adducten te labelen. Voeg het labelmengsel toe aan NP1-oplossing of butanolverrijkingsmengsel.
Laat het mengsel 30 minuten op kamertemperatuur staan. Breng vervolgens ongeveer 20 microliter van het hele monster aan op de PEI-cellulose TLC-plaat. Nadat het monster op de PEI-cellulose TLC-plaat is aangebracht, laat de plaat zich ontwikkelen in D1-richting om de adducten op te ruimen.
Zodra de plaat is opgedroogd, laat de plaat zich ontwikkelen in D3- en D4-richting. Om zich in D3 te ontwikkelen, gebruik lithiumformiaatbuffer bij pH 3,5 met ureum. Voor D4-ontwikkeling, gebruik Tris-HCl-buffer met lithiumchloride en ureum.
Om eventuele problemen bij het ontwikkelen in D4-richting te voorkomen, ontwikkel de platen ook in D5-richting. Ten eerste wordt de P32-postlabelingtechniek gebruikt om de efficiëntie van microsomale p450-gemedieerde biogeactiveerde ellipticine bij het vormen van DNA-adducten te bestuderen. Resultaten tonen de vorming van covalente DNA-adducten in de deoxyguanosine van de kalfsthymus-DNA in de aanwezigheid van zowel rat als humane levermicrosomen aan; er worden echter geen adducten gevormd in de controlegroep.
Vervolgens wordt het potentieel van het peroxidasenzym-afhankelijke geactiveerde ellipticine bestudeerd. De afbeelding toont de vorming van covalente DNA-adducten in kalfsthymus-DNA in aanwezigheid van mierikswortelperoxidase, boviene lactoperoxidase en humane myeloperoxidase. In feite worden DNA-adducten ook gevormd uit de lever-DNA wanneer de ratten worden behandeld met 40 milligram per kilogram lichaamsgewicht ellipticine in vivo.
Interessant is dat het humane cytochroom p450-enzym CYP3A4 ook een sterk potentieel vertoont om ellipticine efficiënt te oxideren tot metabolieten zoals 12-hydroxyellipticine en 13-hydroxyellipticine. Deze metabolieten kunnen gemakkelijk aan het DNA binden om de adducten te vormen. Vervolgens worden nuclease P1 en n-butanolverrijkingsmethoden gebruikt om de vorming van DNA-adducten bij activering van 3-nitrobenzantron met cytosolische reductase zoals NQ01 uit rat en mens te bestuderen.
De resultaten tonen de vorming van maximaal vijf DNA-adducten van de kalfsthymus-DNA verkregen uit de rat, humane levercytosol en ook muizenlever. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de stabiliteit van de gebruikte enzymatische systemen te onthouden.
De enzymactiviteit kan afnemen als deze niet op ijs wordt bewaard. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van biochemie, de biochemie van chemische carcinogenese om de aard van het fenomeen van de initiatiefasen van kankerontwikkeling in organismen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de potentie van omgevingschemicaliën of geneesmiddelen kunt evalueren om enzymatisch geactiveerd te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft methoden voor het evalueren van de potentie van milieuchemische stoffen en geneesmiddelen die enzymatisch biogeactiveerd kunnen worden om covalente DNA-adducten te vormen, welke cruciaal zijn bij de ontwikkeling van kanker. De beschreven technieken maken de detectie en kwantificering van deze DNA-adducten mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in hun carcinogene potentieel.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Kankeronderzoek
- Toxicologie
- Biochemie
Achtergrond
- Covalente DNA-adducten worden gevormd wanneer reactieve metabolieten zich aan DNA binden.
- Het begrijpen van de activering van chemicaliën is essentieel voor het beoordelen van hun carcinogene risico.
- Cytochroom P450-enzymen spelen een belangrijke rol bij de biotransformatie van deze verbindingen.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse wetenschappelijke vakgebieden buiten het kankeronderzoek.
Doel van de studie
- Om de potentie van milieuchemicaliën en geneesmiddelen bij de vorming van DNA-adducten te evalueren.
- Om een methode te bieden voor het beoordelen van de initiatie van kankerontwikkeling.
- Om de implicaties van chemische activatie bij de behandeling van kanker te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van cytochroom P450 en andere biotransformatie-enzymen.
- Activering van verbindingen om reactieve tussenproducten te genereren.
- Detectie- en kwantificatietechnieken voor DNA-adducten.
- Toepassing van relatief eenvoudige methoden voor adductvorming.
Belangrijkste resultaten
- De effectiviteit van de methoden bij het evalueren van chemische potentie werd aangetoond.
- Er werd inzicht geboden in de mechanismen van carcinogenese.
- De relevantie van deze methoden voor kankeronderzoek en -behandeling werd benadrukt.
- Potentiële toepassingen in andere wetenschappelijke domeinen werden aangetoond.
Conclusies
- De beschreven methoden zijn waardevol voor het beoordelen van het carcinogene potentieel van milieuchemische stoffen.
- Inzicht in de vorming van DNA-adducten is cruciaal voor strategieën ter preventie van kanker.
- Dit protocol kan bijdragen aan de ontwikkeling van veiligere geneesmiddelen en chemicaliën.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de industrie
Het kwantificeren van de vorming van covalente DNA-adducten door enzymatisch geactiveerde carcinogenen en geneesmiddelen is essentieel voor validatie van targets in een vroeg stadium en mechanistische risicoanalyse in oncologie- en toxicologie-pipelines. Deze benadering maakt een voorspellende beoordeling van genotoxische risico's mogelijk, wat bijdraagt aan portfolio-triage en risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling. De integratie van deze assays in discovery-workflows verhoogt het vertrouwen in de selectie van verbindingen en informeert translationele strategieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van chemisch en door geneesmiddelen geïnduceerde mechanismen van DNA-schade mogelijk.
- Ondersteunt de functionele validatie van metabole activeringsroutes die relevant zijn voor carcinogenese.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door bioactivering te koppelen aan genotoxische uitkomsten.
- Biedt voorspellend vertrouwen voor de prioritering van verbindingen in oncologie- en veiligheidsportefeuilles.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde in vitro-systemen vast voor het beoordelen van DNA-adductvorming over diverse verbindingenbibliotheken.
- Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten via 32P-postlabeling voor een robuuste standaardisatie van de assay.
- Maakt schaalbare screening van metabole activatie- en DNA-reactiviteitsprofielen mogelijk.
- Ondersteunt downstream-integratie met high-throughput genotoxiciteits- en veiligheidsassays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro DNA-adductgegevens uit met de ontwikkeling van in vivo biomarkers voor translationele continuïteit.
- Informeert de preklinische risicobeoordeling door metabole activeringsroutes over verschillende soorten in kaart te brengen.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers voor vroege detectie van genotoxische effecten.
- Vermindert risico's bij de selectie van kandidaten door mechanistische bevindingen te koppelen aan preklinische eindpunten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinische veiligheidsbeoordeling door een mechanistisch verband te leggen tussen het metabolisme van verbindingen en DNA-schade.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing van metabole activatie en DNA-adductvorming mogelijk als vroege stappen voor risicoreductie.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het vergelijken van genotoxiciteitsprofielen van verbindingen.
- Analytics: Biedt gevoelige detectie en kwantificering van DNA-adducten om datagestuurde beslissingen te onderbouwen.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers en continuïteit van in vitro naar in vivo modellen.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd platform dat aanpasbaar is voor diverse klassen verbindingen en biologische systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie en het mechanistische begrip van genotoxiciteit.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, standaardisatie en schaalbaarheid van assays voor cross-functionele teams.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en vermindert uitval in een laat stadium door onvoorzien genotoxisch risico.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van veiligere, effectievere kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in enzymologie, radiolabeling en DNA-adductanalyse.
- Vereist toegang tot cytochroom P450-systemen, biotransformatie-enzymen en infrastructuur voor de omgang met radiochemische stoffen.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare datageneratie.
- Aanpasbaar aan diverse modelsystemen, maar gevoelig voor enzymstabiliteit en bewaaromstandigheden.
- Omvat het hanteren van gevaarlijke en radioactieve materialen, waarvoor strikte veiligheidsprotocollen vereist zijn.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
2:01
Incubation of Carcinogen and Drugs with DNA in the Presence of Enzymatic Systems
3:04
Isolation of the DNA from the Incubate
4:30
32P-postlabeling for Detection of DNA Adduct Formation
5:04
TLC Separation of Adducted Deoxyoligonucleotides
5:43
Results: Study of the Potency of Metabolically Active Ellipticine Drug in Generating Covalent DNA Adducts
7:33
Conclusion
