Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname
4 april 2018
Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.
Het algemene doel van deze nieuwe workflow is om de bezetting of stoichiometrie van post-translationele modificaties van eiwitten op specifieke acetylatieplaatsen te bepalen.Deze nieuwe massaspectrometrische workflow biedt een hoger niveau van precisie bij de kwantificering.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de omkeerbare regulatie van eiwitten door post-translationele modificatie, zoals lysine-acetylatie of succinylering. Sites die het meest gemodificeerd zijn en mogelijk de eiwitfunctie veranderen.Het grote voordeel van deze techniek is dat de stoichiometrie op siteniveau van lysine-acetylering en succinylering nauwkeurig wordt bepaald en dat de methode de stoichiometrie kan bepalen van peptiden met meerdere lysineresiduen.Deze techniek is zeer relevant omdat ze de stoichiometrie van acetylering en succinylering of de verhouding tussen gemodificeerd en ongemodificeerd meet in plaats van een dimensieloze relatieve verandering in abundantie te meten.Ik kreeg het idee voor deze methode toen ik me realiseerde dat het gebruik van data-onafhankelijke acquisities en MS2-gebaseerde kwantificering voor stoichiometrie-analyse de meetnauwkeurigheid aanzienlijk zou verbeteren.Bereid drie replica's voor van 100
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe massaspectrometrische workflow voor het kwantificeren van posttranslationele eiwitmodificaties, specifiek acetylering en succinylering. De methode verbetert de meetnauwkeurigheid door de site-specifieke bezettingsgraad of stoichiometrie van deze modificaties te bepalen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Massaspectrometrie
- Proteomics
Achtergrond
- Posttranslationele modificaties spelen een cruciale rol in de eiwitfunctie.
- Inzicht in acetylering en succinylering is essentieel voor het bestuderen van reversibele eiwitregulatie.
- Traditionele methoden kunnen tekortschieten in de precisie bij het kwantificeren van deze modificaties.
- Deze studie heeft als doel de nauwkeurigheid van stoichiometrische metingen te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een workflow te ontwikkelen voor nauwkeurige kwantificering van eiwitacetylering en succinylering.
- Om te identificeren welke lysine-posities het meest gemodificeerd zijn en wat hun impact is op de eiwitfunctie.
- Om een methode te bieden die peptiden met meerdere lysine-residuen kan analyseren.
Gebruikte methoden
- Ratiometrische analyse van endogene modificaties.
- Kwantitatieve chemische acylering met behulp van anhydriden met stabiele isotopenmarkering.
- Data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie.
- Bereiding van meerdere replica's voor nauwkeurigheid.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een precieze bepaling van de stoichiometrie op siteniveau mogelijk.
- Het onthult de proportie gemodificeerde versus ongemodificeerde lysineresten.
- Hogere meetnauwkeurigheid in vergelijking met traditionele methoden.
- Identificeert belangrijke acetylering- en succinyleringsites die de eiwitfunctie beïnvloeden.
Conclusies
- Deze workflow verbetert de kwantificering van eiwitmodificaties aanzienlijk.
- Het biedt inzicht in de regulatie van de eiwitfunctie via acetylering en succinylering.
- De techniek is toepasbaar op een breed scala aan proteomische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Nauwkeurige kwantificering van de stoichiometrie van site-specifieke lysine-acetylering en -succinylering maakt een precieze beoordeling van de bezettingsgraad van post-translationele modificaties mogelijk, wat essentieel is voor het begrijpen van de reversibele eiwitregulatie in pathways van geneesmiddeltargets. Deze methode biedt een onbevooroordeelde, proteoombrede meting van modificatieniveaus en ondersteunt targetvalidatie door biologisch relevante acyleringsplaatsen te onderscheiden van achtergrondruis. Door stoichiometrische gegevens te leveren in plaats van veranderingen in relatieve abundantie, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid bij mechanistische risicoanalyse tijdens de vroege ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de bezettingsgraad van acetylering en succinylering op specifieke lysine-residuen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door nauwkeurige meting van de stoichiometrie van modificaties, waardoor de functionele impact op de eiwitactiviteit wordt verduidelijkt.
- Predictieve waarde: Verbetert het vertrouwen in het target door te identificeren welke gemodificeerde sites waarschijnlijk de functie zullen veranderen, wat helpt bij de triage van de portfolio.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Assay-gereedheid: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door acyleringsbezettinggegevens op siteniveau te leveren.
- Kwantitatieve output: Maakt gebruik van fragmention-piekoppervlakten uit DIA-MS om een nauwkeurige, interferentierijke kwantificering mogelijk te maken die geschikt is voor assay-standaardisatie.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de screening-gereedheid via reproduceerbare, multiplex-compatibele proteomische analyse van acetylering en succinylering.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt profielschetsen van modificaties in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door het identificeren van ziekterelateerde acyleringsplaatsen.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde door de stoichiometrie te bepalen vanuit peptiden met meerdere lysineresiduen, waardoor site-specifieke resolutie mogelijk wordt.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door aan het licht te brengen welke lysinemodificaties functioneel significant zijn versus stochastisch.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot lead-identificatie, en levert stoichiometrische gegevens over acetylering en succinylering die bijdragen aan het mechanistische begrip en de effecten van verbindingen op de eiwitfunctie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de kwantificering van site-specifieke modificatiebezetting als reactie op perturbaties.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde, kwantitatieve meting van modificatieniveaus in proteomische monsters.
- Analytiek: Levert nauwkeurige stoichiometrie-metingen via DIA-MS fragment-ion kwantificering, wat een accurate vergelijking van modificatiestaten mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door acyleringsplaatsen met een hoge bezetting te identificeren die kunnen dienen als biomarkers of mechanistische read-outs.
- Enterprise hergebruik: Fungeert als een herbruikbare proteomische capaciteit voor consistente PTM-profilering over projecten en doelwitklassen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende betrouwbaarheid door nauwkeurige stoichiometrie op siteniveau van acetylering en succinylering, waardoor mechanistische ambiguïteit bij target-validatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via DIA-MS en Skyline-gebaseerde kwantificering, waardoor technische variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het identificeren van functioneel relevante modificatiesites met een hoge bezettingsgraad, wat het biologische risico in een laat stadium verlaagt.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functioneel bewijs gestuurd door modificaties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in proteomics op basis van massaspectrometrie en technieken voor PTM-verrijking.
- Afhankelijkheid van DIA-capabele instrumentatie en het genereren van spectrale bibliotheken voor een nauwkeurige kwantificering van fragmentionen.
- Vereist standaardisatie van monstervoorbereiding en chemische acyleringsprotocollen over teams heen voor reproduceerbaarheid.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de workflow op diverse modelsystemen of weefseltypes.
- Omvat praktische beperkingen met betrekking tot de detecteerbaarheid van peptiden en de toegankelijkheid van lysineresiduen in complexe mengsels.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
