Name: Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer satellietcellen identificeren in skeletspierweefsel met immunofluorescentie en Pax7-antilichamen. Deze methode maakt onderzoek naar spierstamcellen in hun fysiologische omgeving mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de NIAMS licht Imaging sectie voor het verstrekken van de microscopen en technische hulp. De MF20 en Pax7 antilichamen zijn verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank onder auspiciën van de NICHD ontwikkeld en onderhouden door de afdeling biologische wetenschappen, de Universiteit van Iowa, Iowa City. Dit werk werd gesteund door de intramurale onderzoek programma van NIAMS van de National Institutes of Health.

In dit protocol, de anterior hind-limb spieren van volwassen muizen (2-6 maanden), tibialis anterior (TA) en extensor digitorum longus (EDL), werkten als een voorbeeld voor het uitvoeren van de immunofluorescentie kleuring op hun SCs. Alle stappen behandeling van muizen en spier weefsel dissecties zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van NIAMS/NIH.
1. het ontleden van de TA/EDL spier van de muis Hind-Limb
<ol><li>De muis in een CO2 gevulde euthanasie kamer onder de richtlijnen van de ACUC van de NIH euthanaseren. Cervicale dislocatie uitvoeren indien nodig.</li>
	<li>Zet de muis gezicht-up op een dissectie pad (liggende). Spuiten van 70% ethanol op de huid van de buik. Een 1-2 cm opening horizontaal op het midden van de muis buikvel knipt en daarna deskin de muis door te trekken van de opening naar de voeten van de muis. Ene kant van de muis hind-limb bloot.</li>
	<li>Twee scherpe pincet gebruiken: een te houden van de pezen die de TA/EDL aan de enkel hechten, en gebruik van de andere account te breken en de fascia die betrekking hebben op de TA/EDL schuintrekken. Zodra de fascia wordt gepeld uit, gebruik het scherpe uiteinde van de verlostang om los van de TA/EDL van de tibia bot door het uitvoeren van de tip onder de TA/EDL spier te.</li>
	<li>De pezen van de enkel met een schaar afgesneden terwijl nog het houden van hen met de pincet. Trim de spier met een schaar langs de longitudinale lijn van de TA/EDL van de enkel tot de knie terwijl het opheffen van de TA/EDL vanaf de zijkant van de enkel met de pincet. Snijd de pezen van de knie-kant als u wilt loskoppelen van de hele TA/EDL van het scheenbeen.</li>
</ol>2. Cryo-insluiting van de TA/EDL-spier
<ol><li>Bereiden van een vloeibare stikstof bad in een container, bijv., een vloeibare stikstof Dewar kolf. Giet methylbutane in een kleine plastic bekerglas (ongeveer 20 mL) aan halfvol. Dan zet het bekerglas in het bad van de vloeibare stikstof om het te bevriezen. Na een paar minuten, controleren dat de methylbutane is bevroren. Opmerking: De vloeibare stikstof kan worden vervangen door een emmer van droogijs, maar de bevriezing tijd is langzamer.</li>
	<li>Leg de ontleed TA/EDL op het vlakke oppervlak van de zuiger van een kleine kunststof spuit. De TA/EDL met een paar druppels van optimale snijden temperatuur (O.C.T.) samengestelde (het bevriezing medium) volledig te dekken.</li>
	<li>Neem het bekerglas methylbutane uit de vloeibare stikstof bad en ontdooien van het oppervlak met een warm voorwerp (bv., het handvat van schaar). TA/EDL wordt snel in de gesmolten methylbutane aan module-freeze het weefsel duik de O.C.T. gedekt op de plunjer.</li>
	<li>Loskoppelen van de ingesloten weefsel van de zuiger met een tang, en zet het in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Plaats de buis in vloeibare stikstof te slaan tijdens het verwerken van meer monsters. Opmerking: Het ingesloten weefsel kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor de lange termijn (2 jaar) of -20 ° C voor korte termijn (6 maanden).</li>
</ol>3. de cryostaat segmenteren
<ol><li>Voeg een druppel in het midden van een monsterhouder van een cryostaat samengestelde O.C.T.. Wacht totdat de O.C.T. compound is bijna gestold. Snel stok de ingesloten TA/EDL naar de O.C.T. compound, loodrecht met de enkel-zijde omlaag en de knie-kant omhoog.</li>
	<li>Monteren van de monsterhouder op een cryostaat, knippen het weefsel met 10 µm interval en de cryo-delen op vorst bedekt dia's met verzamelen over 4-8 secties op één dia.</li>
	<li>Droog de secties bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 uur om te overnachten. Opmerking: Hoewel de secties in de vriezer voor overnachting of langer drogen aanvaardbaar is, zal het onvermijdelijk de autofluorescence verhogen. Voor de beste resultaten, droog de secties voor 0.5 h, gaat u verder met de fixatie en kleuring stappen onmiddellijk.</li>
	<li>Verzamelen van de dia's in een dia doos en hen onmiddellijk te gebruiken, of de dia's bij-80 ° C of -20 ° C voor later gebruik opslaan.</li>
</ol>4. bereiding van reagentia immunofluorescentie kleuring
<ol><li>
Bereiden van buffers:
	<ol>
<li>Bereiden van 2 L 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) van 10 x PBS.</li>
		<li>Bereiden van 40 mL 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS van 16% PFA.</li>
		<li>Bereiden van 2 L van PBST: 1 x PBS met 0,1% Triton-100.</li>
		<li>50 mL PBST-B: PBST met 2% bovien serumalbumine (BSA) voor te bereiden.</li>
		<li>Bereiden PBST-B-G: PBST met 2% BSA en 5% normaal geit Serum 10 mL.</li>
		<li>Bereiden 1 mL van oplossing blokkeren. Verdunde AffiniPure Fab Fragment geit-antimuis IgG (H + L) (1:10) in PBST-B.</li>
		<li>200 mL 1 x citraat buffer voor te bereiden. Opmerking: De omvang van de bovenstaande oplossingen zijn voldoende voor ten minste 5 dia's. Volumes moeten worden aangepast volgens het aantal dia's en de grootte van de dia-containers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiden van antilichaam vlekken:
	<ol>
<li>Primaire antilichamen (werken concentratie): 1,2 mL voor primair antilichaam mix voorbereiden door verder verdunnen Pax7 muis monoklonaal antilichaam (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin konijn polyclonal antilichaam (0.5-2 µg/mL) + MF20 muis monoklonaal antilichaam (IgG2b) (0,5-2,5 µg / mL) in PBST-B-G. Opmerking: MF20 muis monoklonaal antilichaam (IgG2b) is optioneel.</li>
		<li>Secundaire antilichamen (werken concentratie): 1,2 mL secundair antilichaam mix voorbereiden door verdunning van de geit-antimuis IgG1 Kruis-geadsorbeerde secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 (0.5-2 µg/mL) + geit anti-konijn IgG (H + L) zeer cross-geadsorbeerde secundair antilichaam, Alexa Fluor Plus 555 (0.5-2 µg/mL) + geit-antimuis IgG2b Kruis-geadsorbeerde secundair antilichaam, Alexa Fluor 647 (0.5-2 µg/mL) in PBST-B-G. Opmerking: De Alexa Fluor 647 is optioneel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immunofluorescentie kleuring stappen
<ol><li>
Hydrateren en herstellen van de cryo-delen met PFA.
	<ol>
<li>Een paar van de TA/EDL cryo-sectie dia's uit het vak dia verwijderen. Warm de dia's in de lade van een dia-bedrijf bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Een vloeibare blocker pen (PAP pen) gebruiken om een gebied waarin alle cryo-secties op de dia te tekenen. Deze cirkel wordt voorkomen dat de oplossingen die stroomt van de dia wegslepen.</li>
		<li>Neem de lade naar een laboratorium zuurkast. Voeg 300-500 µL van 4% PFA op de dia binnen de omcirkelde gebied om op te lossen van de secties bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen uit de PFA met 1 x PBS minstens 3 x 5 min in een dia-container. Let op: PFA is giftig en een gevaarlijke afvalstoffen; het moet met zorg bediend en verwijderd in een gevaarlijk afval container.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigeen ophalen
	<ol>
<li>Vul een andere dia container met 200 mL ammoniumcitraat buffer.</li>
		<li>Breng de dia's in de container. De container met de dia's overbrengen in een snelkookpan de dia's in de hoge druk modus gedurende 10 minuten koken.</li>
		<li>De container met het aftappen van water voor 10 min. overdracht alle dia's naar een nieuwe container met PBST (200 mL) afkoelen, spoel de dia's met PBST voor minstens 3 x 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blokkeren
	<ol>
<li>Water doordrenkte kimwipes toevoegen aan het Dienblad van de dia's te maken van een vochtige omgeving om te voorkomen dat het drogen van de dia's te houden.</li>
		<li>Verplaats de dia's terug naar de lade, en 200 µL van het blokkeren van de oplossing op elke dia toe te voegen. Dek het dienblad met een GLB en laat de blokkering ontwikkelen voor 30 min. Opmerking: Pax7 antilichaam is een monoclonal antilichaam van muis, dus er is aspecifieke binding van muis IgG in muis spierweefsels waarmee hoge achtergrond. Met behulp van de AffiniPure Fab Fragment geit-antimuis IgG (H + L) blokkeert de muis-over-mouse aspecifieke binding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primaire antilichamen van toepassing.
	<ol>
<li>Spoel de dia's met PBST eenmaal in de dia-container. Verplaats de dia's terug naar de kleuring lade.</li>
		<li>200 µL van primair antilichaam mix toepassen op elke dia, betrekking hebben op het dienblad met een GLB en laat de reactie ontwikkelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of bij 4 ° C voor overnachting. Opmerking: De overnachting reactie bij 4 ° C geeft het beste resultaat, hoewel de ontwikkeling van de reactie bij kamertemperatuur bevredigende resultaten oplevert. Het antilichaam myosin MF20 kan worden toegevoegd in de mix voor het uitvoeren van een triple (Pax7, Laminin, MF20) labeling. MF20 vlekken gedifferentieerde spiervezels. Deze stap dient ook als een blokkerende stap met PBST-B-G om potentiële aspecifieke bindende van secundaire antilichamen (geit antilichamen) in de volgende stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toepassing van secundaire antilichamen.
	<ol>
<li>Wassen uit de primaire antilichamen met PBST bij kamertemperatuur minstens 3 x 5 min.</li>
		<li>200 µL van secundair antilichaam mix toevoegen aan elke dia, en laat de reactie te ontwikkelen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. Opmerking: Gebruik voor Pax7 + Laminin, geit-antimuis IgG1 Alexa 488 en geit anti-konijn Alexa 555. Toevoegen voor Pax7 + Laminin + MF20, geit-antimuis IgG2b Alexa 647 in de mix.</li>
		<li>Wassen uit de secundaire antilichamen met PBST minstens 3 x 5min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) contra vlek en montage
	<ol>
<li>DAPI (1:20, 000) verdund in PBST in de dia container, bijvoorbeeld10 µL van de DAPI in 200 mL PBST.</li>
		<li>Vlek van de dia's in de DAPI container voor 3 min.</li>
		<li>Wassen de DAPI met PBST voor minstens 5 x 5 min.</li>
		<li>Monteer de dia's met montage medium. Betrekking hebben op de dia's met coverslips. Let op: DAPI is giftig en gevaarlijk; het moet met zorg behandeld en verwijderd in de fles van gevaarlijke afvalstoffen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. fluorescent microscopie
Opmerking: Het immunefluorescentie kleuring protocol gemeld boven kan SCs visualisatie met ofwel een breed-gebied TL of confocal microscoop. Het kan zijn aanvankelijk uitdagend om te identificeren van SCs. Hier zijn een paar aanbevolen stappen die van hulp worden kunnen.
<ol><li>Gebruik de DAPI kanaal en lage vergroting doelstellingen te visualiseren van de secties op de dia's.</li>
	<li>Schakel in de vergroting van laag naar hoog. Om te zien hoe de SCs, is minimaal 20 X doelstelling vereist).</li>
	<li>Gebruik de dubbele filter kubus voor 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) te observeren van zowel Pax7 als Laminin signalen tegelijkertijd te identificeren van SCs. Onder deze instelling heeft het signaal van de Pax7 kleuring een beter contrast met de achtergrondgeluiden.</li>
	<li>Het kanaal van FITC DAPI correct identificeren SCs snel worden afgewisseld. Alle SCs moet Pax7/DAPI-positief.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het bovenstaande protocol was gebaseerd op een methode van Pax7/MF20 kleuring op zebrafish skeletspieren12. De oplossingen gebruikt en het blokkeren van stappen zijn identiek of soortgelijk. De antilichamen die gebruikt zijn identiek. De aangepaste stappen waren gebaseerd op de kenmerken van de muis spierweefsel en SCs. Eerst, Laminin antilichaam werd toegevoegd in de mix om te helpen bij het visualiseren en bevestigen van de positie van SCs. Het was bijzonder nuttig om te tellen van het aantal SC...

Skeletspieren is samengesteld uit multinucleaire spiercellen, genaamd myotubes, georganiseerd in de myofibers, die kracht en bewegingen door contractie genereren. Meest skeletspieren, met uitzondering van sommige craniofaciale spieren, zijn afgeleid van een tijdelijke embryonale structuur genaamd een Somiet1. Myogenic voorlopercellen delamineren uit de epitheliale Somiet tot myoblasts. Myoblasts verder onderscheiden in myocytes die samensmelten tot myotubes multi genucleëerde myofibers vormen. Het hierboven beschreven proces heet myogenesis en wordt gekenmerkt door stoffelijk-gereglementeerde controle op de genexpressie. Myogenic precursoren express Pax3 en Pax7, terwijl myoblasts express MyoD en/of Myf5 en myocytes express myogenin en myosins2,3. Spiergroei is een proces waarin myofibers groter worden door meer myonuclei op te nemen in bestaande vezels (hyperplasie) en door een toename van de spiervezel grootte (hypertrofie)4. Tijdens de spiergroei is er een duurzame bron van myogenic cellen, die cel van de stam eigenschappen hebben dat ze kunnen onderscheiden en zelf vernieuwen. Deze cellen zijn cellen van de satelliet op basis van hun fysieke locatie tussen het sarcolemma (celmembraan van de myofiber) en de basale lamina5genoemd. SCs krachtig bijdragen aan spiergroei in de juveniele fase (de eerste 2-3 weken van de postnatale muizen), maar geven in rust volwassen spier6geworden. Opmerkelijk is, kunnen zij zitten re-geactiveerd in reactie op spier verwondingen en differentiëren in nieuwe spiercellen te herstellen van de beschadigde spier7.
De cel van de stam-eigenschappen maken de studie van SCs relevant zijn voor zowel de fundamentele spier biologie en de therapieën van spier ziekten8. Dientengevolge, kan het een gebied van intens onderzoek in de afgelopen decennia is geweest. Een enorme vooruitgang is geboekt in de ontrafeling van de genetica en de epigenetica van SCs9,10. Die betrokken zijn bij het opsporen en identificeren van SCs in situ technieken werden ontwikkeld en geoptimaliseerd langs de manier11. Immunefluorescentie kleuring kan de identificatie van SCs door het gebruik van specifieke antilichamen, met inbegrip van die voor Pax7. Echter, de schaarste en de kleine grootte van de SCs gecombineerd met een sterke auto-fluorescentie van volwassen skelet spierweefsel maken de visualisatie uitdagend. Hier beschrijven we een immunefluorescentie kleuring protocol geoptimaliseerd voor muis spierweefsel voor Pax7 en op basis van een bestaande methode voor zebrafish spier12. Bovendien is een Laminin antilichaam gemarkeerd met een aparte fluorophore aangewend om te identificeren van de basale lamina waaronder de SCs zich bevinden. Dit protocol maakt consequent de visualisatie van Pax7-positieve SCs en myogenic precursoren onder alle geteste fysiologische omstandigheden en ontwikkelingsstadia.

<table><tbody><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Citrate Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 mono-clonale muis antilichaam (IgG1) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin polyklonaal konijn antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 mono-clonale muis antilichaam (IgG2b) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-Muis IgG1 gekruist geabsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-Muis IgG2b gekruist geabsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Gekruist Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1860 cryostaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000 breedveldfluorescentiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR breedveldfluorescentiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 confocale microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 confocale microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuisinart elektronische snelkookpan</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met pax7 en laminin antilichamen

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescentie is een effectieve methode die helpt bij het identificeren van verschillende celtypes op weefselsecties. Om de gewenste celpopulatie te bestuderen, worden antilichamen tegen specifieke cel markeringen op weefselsecties toegepast. In volwassen skeletspieren zijn satelliet cellen (gcv) de cellen van de stam die aan spier reparatie en regeneratie bijdragen. Daarom is het belangrijk om te visualiseren en traceren van de satelliet-celpopulatie onder verschillende fysiologische omstandigheden. Rusten skeletspieren, SCs zich bevinden tussen de basale lamina en myofiber plasmamembraan. Een veelgebruikte marker voor het identificeren van SCs op de myofibers of in de cultuur van de cel is de gekoppelde vak eiwit Pax7. In dit artikel wordt een geoptimaliseerde Pax7 immunofluorescentie protocol betreffende skeletspieren secties gepresenteerd die aspecifieke kleuring en achtergrond minimaliseert. Een ander antilichaam dat een proteïne (laminin) van de basale lamina herkent is ook toegevoegd om te helpen bij het identificeren van SCs. vergelijkbaar protocollen kunnen ook worden gebruikt voor het uitvoeren van dubbele of driedubbele labelen met Pax7 en antilichamen voor extra eiwitten van belang.

Na de bovenstaande stappen, SCs met succes kunnen worden gevisualiseerd in volwassen rust spier secties onder een fluorescente microscoop (Figuur 1). Hoewel de volwassen spierweefsel sterke auto-fluorescentie in bepaald soort vezels heeft, de heldere Alexa serie kleurstoffen de achtergrondgeluiden kunnen overwinnen en het signaal opvalt (figuur 1A, B; pijlpunten). De twee-foton confocal microscopie vangt een rela...

De nauwkeurige identificatie van satelliet cellen is essentieel voor de studie van hun functies onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol ter identificatie van de satelliet cellen op volwassen skeletspieren secties door immunofluorescentie gebaseerde kleuring.

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Het algemene doel van dit protocol is om volwassen skeletspiersatelietcellen te identificeren via immunofluorescence. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden met betrekking tot het aantal en de verdeling van spierstamcellen in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat men spierstamcellen in hun fysiologische omgeving kan identificeren met slechts beperkte manipulatie.De procedure wordt gedemonstreerd door Faiza Naz, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen, bereid een vloeibare stikstofbad voor door vloeibare stikstof in een Dewar-kolf te gieten. Giet vervolgens 10 milliliter methylbutaan in een 20-milliliter plastic beker en breng de beker over in het vloeibare stikstofbad.Leg de gedissekteerde tibialis anterior-spier op het platte oppervlak van de zuiger van een kleine plastic spuit. Bedek vervolgens de gedissekteerde spier met een paar druppels Optimal Cutting Temperature compound of O.C.T.Verwijder de beker met methylbutaan uit het vloeibare stikstofbad en ontdooi het oppervlak met behulp van de handvatten van een stel schaar. Dompel snel het met O.C.T.bedekte weefsel in het gesmolten methylbutaan om het snel te bevriezen.Gebruik vervolgens een pincet om het ingebedde weefsel los te maken van de zuiger en breng het over in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Bewaar vervolgens het microcentrifugebuisje in de vloeibare stikstof. Om te beginnen met cryostaat-sneden, voegt u een druppel O.C.T.compound toe op het midden van de houder van een cryostaat en laat het gedeeltelijk stollen.Steek vervolgens het ingebedde weefsel in het O.C.T.compound met de enkelzijde naar beneden en de kniezijde naar boven. Monteer vervolgens de houder van het specimen op de cryostaat en snijd het weefsel in intervallen van 10 micrometer. Verzamel vier tot acht cryosecties op elke bevroren schuif.Laat de secties drie uur op kamertemperatuur drogen, verzamel vervolgens de schuiven in een schuivendoos en bewaar ze op min 80 graden Celsius. Verwijder vervolgens een schuif uit de schuivendoos en warm deze op tot kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een vloeistof-blokkeerpen om een gebied rond de cryosecties te markeren om te voorkomen dat vloeistoffen van de zijkant afvloeien.In een afzuigkap voegt u 300 tot 500 microliter 4% paraformaldehyde toe aan het gemarkeerde gebied. Incubeer de schuif op kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de secties te fixeren. Spoel vervolgens het paraformaldehyde van de schuif af met PBS in een schuivencontainer.Om met antigeenretrieval te beginnen, vult u een schuivencontainer met 200 milliliter citraatbuffer en brengt u de schuif over naar de container. Breng vervolgens de schuivencontainer over naar een stoomoven op hoge druk gedurende 10 minuten. De stap voor antigeenretrieval is optioneel als de secties gedurende 30 minuten op kamertemperatuur worden gedroogd en onmiddellijk worden doorgegaan.Dan is de antigeenretrieval stap niet nodig. Maar als de secties gedurende meer dan drie uur op kamertemperatuur worden gedroogd en vervolgens op min 80 graden Celsius worden bewaard, is de antigeenretrieval stap vereist. Koel vervolgens de schuivencontainer gedurende 10 minuten onder stromend water af.Breng vervolgens de schuif over naar een nieuwe container met 200 milliliter PBST en spoel met PBST. Voeg waterdoorweekte laboratoriumdoekjes toe aan de lade, markeer vervolgens de gespoelde schuif opnieuw met een PAP-pen en plaats deze in de lade. Voeg 200 microliter blokkeeroplossing toe aan de schuif.Dek vervolgens de lade af en incubeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De blokkeerstap is erg belangrijk omdat de gebruikte Pax7-antilichaam een monoklonaal muis-antilichaam is. De mouse-on-mouse blokkeerstap vermindert de niet-specifieke bindingen.Spoel vervolgens de schuif met PBST in de schuivencontainer en breng deze terug in de lade. Voeg 200 microliter primaire antilichaammix toe aan de schuif en incubeer op kamertemperatuur gedurende een uur. Spoel vervolgens de schuif af met PBST, voeg vervolgens 200 microliter secundair antilichaammix toe en incubeer in het donker op kamertemperatuur gedurende een uur.Na de incubatieperiode spoelt u de schuif af met PBST. Verdun DAPI in een schuivencontainer en incubeer de schuif in de container gedurende drie minuten. Spoel vervolgens de DAPI af met PBST gedurende vijf minuten.Monteer ten slotte de schuif met montagemiddel en breng een dekglas aan. In deze studie worden satelietcellen met succes gevisualiseerd in secties van volwassen rustende spier onder een fluorescerende microscoop. De achtergrondruis die gewoonlijk wordt gezien bij volwassen spierweefsel en bepaalde soorten vezels, wordt verminderd door het gebruik van mouse-on-mouse blokkering.De specifieke immunokleuring signalen worden verbeterd door secundaire antilichamen te gebruiken die zijn geconjugeerd met heldere Alexa-kleurstoffen. Een twee-foton confocale microscoop legt een scherper beeld vast in vergelijking met de breedveldfluorescentiemicroscoop. Hetzelfde protocol kan ook worden toegepast op spierweefsel van juveniele muizen, muisembryo's en beschadigd volwassen spierweefsel.Zowel juveniel als embryonaal spierweefsel toont meer geactiveerde satelietcellen of Pax7 myogene voorlopers met relatief grotere kernen. Daarom is het gemakkelijker om de satelietcellen van jongere muizen te visualiseren dan die van volwassen muizen. In het beschadigde spierweefsel zijn meer geactiveerde Pax7-positieve cellen zichtbaar.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vijf uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het geluid dat afkomstig is van autofluorescentie en niet-specifieke mouse-on-mouse immunobinden niet volledig kan worden

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

In vitro cultuur systemen onmisbaar voor ons begrip van gewervelde myogenese bewezen. Er moet echter nog veel te leren over nonmammalian skeletspieren ontwikkeling en groei, met name in de basale taxa. Een efficiënte en robuuste protocol voor isolatie van de volwassen stamcellen van dit weefsel, de myogene voorlopercellen (MTR), en met behoud van hun zelf-vernieuwing, proliferatie en differentiatie in een primaire kweek instelling maakt de identificatie van geconserveerde en afwijkende...

Voorbereiding van de Primaire Myogene Precursor Cell / myoblast Culturen van Basal gewervelde Geslachten

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Dit protocol beschrijft de isolatie van satelliet-cellen uit branchiomeric hoofd spieren van een 9 weken oude ratten. De spieren komen uit verschillende kieuwbogen. Vervolgens worden de satelliet cellen gekweekt op een plek bekleding millimeter grootte hun differentiatie te bestuderen. Deze aanpak voorkomt de uitbreiding en de passage van satelliet-cellen.

Isolatie en karakterisering van Satellite Cellen van Rat Head Branchiomeric Spieren

Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

We beschrijven een in vivo methode om het functionele verlies van een specifiek gen in satelliet cellen te onderzoeken met behulp van een combinatie van cardiotoxine gemedieerde verwonding van de skeletspieren en de injectie van een zelfvoorzienend siRNA.

Analyse van de Satellietcel functie tijdens de skeletspieren regeneratie door Cardiotoxine letsel en injectie van Self-leveren siRNA in vivo

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Skeletspieren bestaan uit meerdere celtypen, waaronder residente stamcellen, elk met een speciale bijdrage aan de homeostase en regeneratie van spieren. Hier worden de 2D-kweek van spierstamcellen en de spiercelniche in een ex vivo setting beschreven die veel van de fysiologische, in vivo en omgevingskenmerken behoudt.

Niet-gefractioneerde bulkkweek van skeletspieren van muizen om niche- en stamcelrust te recapituleren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Leer satellietcellen identificeren in skeletspierweefsel met immunofluorescentie en Pax7-antilichamen. Deze methode maakt onderzoek naar spierstamcellen in hun fysiologische omgeving mogelijk.

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Meer video's verkennen