Name: Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een betrouwbare PCR-methode voor de detectie van Candidatus liberibacter spp. in citrusbladweefsel. Deze techniek ondersteunt boeren en onderzoekers bij het snel identificeren van het veroorzaker van citrusvergroening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Conceptualisering, H.C. en Z. v. F.; Onderzoek, H. C., J. C en Z. Q. F; Middelen, Z. v. F.; Schrijven - originele ontwerp, I. A. P.; Schrijven – Review & bewerken, I. A. P., J. C. H. C., S. L. T. en Z. v. F.; Visualisatie, H. C.; Toezicht, Z. v. F.; Financiering van de overname, Z. Q. F en F. v. L.
Project ondersteund door een South Carolina verbetering leraar kwaliteit hogeronderwijs staat subsidie getiteld verbetering van middelste rangen Science Teachers kennis van de processen van de Plant, structuren en functies door middel van betrokkenheid in wetenschappen plantenonderzoek (Plant Science)
Fondsen die zijn toegekend door de Verenigde Staten ministerie van onderwijs (CFDA nummer 84.367B)
De auteurs bedank Dr. Nian Wang van de Universiteit van Florida voor het verstrekken van genomic DNA-monsters besmet uit Citrus sinensis Valencia.

1. Isoleer Genomic DNA uit weefsel van de Plant met behulp van een Genomic extractie Kit
<ol><li>Citrus blad weefsel verkrijgen door te snijden een hele vers blad van een citrus boom met behulp van schone schaar, en plaats het blad in een schone plastic sandwich zak. Opmerking: De zak met het weefsel blad moet worden geplaatst in een koelkast 4 ° C of op ijs in een geïsoleerde container zo spoedig mogelijk na het verzamelen te voorkomen van bederf.</li>
	<li>Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof om te relaxen een mortier en een stamper. Terwijl ze zijn koelen, gebruik schaar te knippen uit een klein stukje blad weefsel, ongeveer 1 vierkante inch in grootte. Plaats het gesneden weefsel in de mortel direct om het te bevriezen. Voeg meer vloeibare stikstof, indien nodig. Opmerking: Geïsoleerde handschoenen moeten altijd gedragen worden tijdens het verwerken van vloeibare stikstof.</li>
	<li>Snel de plant weefsel vermalen tot een fijn poeder met behulp van de mortel. Blijven slijpen totdat de vloeibare stikstof volledig verdampt, en een fijn groene poeder blijft.</li>
	<li>Kort een metalen spatel in vloeibare stikstof voor 10-15 s chill en schep de grond weefsel binnen de mortel in een 1,5 mL microcentrifuge buis, met behulp van de spatel.</li>
	<li>Voeg 600 µL van kernen Lysis van de oplossing (Zie Tabel van materialen) met behulp van een 1000 µL Pipetteer en vortex het monster voor 1-3 s, vervolgens broeden in een waterbad van 65 ° C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>3 µL van RNase oplossing aan de lysate met behulp van een pipet 10µL toevoegen, omkeren van de buis 2 - 5 keer te mengen, Incubeer bij 37 ° C in een kabinet incubator voor 15 min. Opmerking: Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verdergaat.</li>
	<li>200 µL van eiwit neerslag oplossing, vortex op hoge snelheid voor 20 s en centrifuge voor 3 min op 13.000 x g vormen een stevige pellet toevoegen. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, 600 µL van kamertemperatuur isopropanol aan een verse 1,5 mL microcentrifuge buis toevoegen.</li>
	<li>Met behulp van een pipet 1000 µL, verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof uit het gecentrifugeerde monster, over te dragen aan de microcentrifuge-tube van verse 1,5 mL met isopropanol. De pellet kan nu worden verwijderd. Opmerking: Vermijd verontreiniging van het supernatans dat met eiwit door het verlaten van een minuscule hoeveelheid supernatant boven de pellet.</li>
	<li>Omkeren van de buis, tot het DNA zichtbaar als een massa van de draad-achtige strengen wordt en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren, 600 µL van 70% ethanol toevoegen aan de pellet, omkeren van de buis meerdere malen te wassen van het DNA, en centrifugeer bij 13.000 x g voor 1 min.</li>
	<li>Zorgvuldig gecombineerd de ethanol, waardoor de losse DNA pellet, open en omkeren van de buis, rustend op absorberend papier. Lucht droog bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Voeg 100 µL van DNA rehydratie oplossing aan de gedroogde DNA pellet en Incubeer het DNA in een waterbad van 65 ° C gedurende 1 uur, tijdens het mixen periodiek door te tikken op de buis.</li>
	<li>Plaats 1 µL van het gezuiverde water op een microcuvette, en plaatst u deze in een spectrofotometer moet worden gebruikt als een leeg. Bereken de concentratie van DNA aanwezig door 1 µL van het monster op de microcuvette te plaatsen en invoegen in de spectrofotometer. DNA-concentratie (ng/µL) kan worden berekend als (een260- een320) × verdunning factor × 50 ng/µL. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster kan worden achtergelaten bij 4 ° C.</li>
</ol>2. uitvoeren van PCR op Genomic DNA-monsters
<ol><li>Combineren van 10 µL 2 x PCR Master Mix (Zie tabel van materialen), 1 µL voorste primer (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (Zie tabel 2 voor primer sequenties), 100 ng van genomic DNA uit het monster geëxtraheerd en gezuiverd water (maximaal 20 µL eindvolume) een 50 µL PCR buis, flick te mengen, en kort centrifuge.</li>
	<li>De PCR-buis invoegen de thermocycler en dienovereenkomstig worden uitgevoerd (Zie tabel 1). Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Indien nodig slaan monster bij 4 ° C, nadat de reactie voltooid is.</li>
</ol>3. het versterkte DNA in een Agarose Gel electrophorese
<ol><li>Weeg 0.4 g agarose poeder en samen met 1 x TAE buffer toevoegen aan een schoon 200 mL conische kolf, vullen van maximaal 50 mL.</li>
	<li>Magnetron op hoog voor 1.5 min, schudden elke 30 s, tot agarose is volledig opgelost. Opmerking: Geïsoleerde handschoenen moeten gedragen worden tijdens het verwerken van vloeibare agarose Voorkom brandwonden.</li>
	<li>2.5 µL van 10 mg/mL ethidiumbromide toevoegen aan de vloeibare agarose hermetisch en schud om te mixen, dan giet het vloeibare agarose gel in een mal niveau gel. Snel invoegen standaard 12-tooth gel kammen na het gieten.</li>
	<li>Laat de gel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur afkoelen, dan verwijderen van de gel kammen, en plaats de gel in een niveau gel doos gevuld met 1 x TAE buffer.</li>
	<li>Met behulp van een micropipet, laad het totale versterkte DNA-monsters in putten. Voeg toe 5 µL van DNA ladder (Zie Tabel van materialen) in een aparte put uit uw monsters.</li>
	<li>Electrophorese de monsters gedurende 35 min. bij een constant 90 V, dan verwijderen van de gel en plaats in een UV-transilluminator.</li>
	<li>Fotograferen en analyseren van de gel "banding" patroon tijdens het gebruik van UV transillumination op 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu en Zheng Qing-Fu verklaren geen belangenconflicten.

Het is van cruciaal belang dat alle maatregelen worden gevolgd als u precies wilt bereiken van optimale proefomstandigheden. Hele blad weefsel werd gebruikt tijdens deze demonstratie; het protocol kan echter worden gewijzigd theoretisch tot elk soort weefsel van de plant. Eerder, hebben de onderzoekers genomic DNA geëxtraheerd uit blad ader weefsel, in plaats van hele blad weefsel, en bereikt soortgelijke resultaten11. Indien de band die overeenkomt met de citrus FBOX -gen niet verschijnt...

Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, heeft geleid tot een aanzienlijk verlies van citrusbomen. Één vertegenwoordiger geval is Florida, waar de ziekte is voorspelde een 70% daling in de productie van Florida oranje dozen van 244 miljoen dozen in het seizoen 1997-1998 te bezorgen 70 miljoen dozen vanaf het seizoen 2016-20171. Meer dan 90% van citrusbomen in Florida zijn geïnfecteerde2, en geschat wordt dat de Florida citrus industrie ongeveer een miljard dollar per jaar als gevolg van citrus ziekten verliest, waarin citrus "vergroening" een belangrijke rol-3 speelt. Citrus groener wordt verspreid voornamelijk door de invasieve Aziatische citrus psyllid Diaphorina citri, maar kan ook worden verspreid door enting van geïnfecteerd weefsel. De ziekte veroorzaakt geelverkleuring van de aderen, asymmetrische geel blad patroon, voortijdig naald-of bladverlies, takje zullen verdwijnen, root verval en dood van de plant. Belangrijk is dat veroorzaakt de ziekte de citrus plant produceren bloemen buiten het seizoen, die zelden fruit produceren. Het fruit dat wordt geproduceerd door geïnfecteerde citrus planten zijn onvolwassen, groen en bittere proeven4.
Het doel van deze methode is om nauwkeurig en precies identificeren de motile bacterie Candidatus liberibacter spp., de verwekker van citrus vergroening, wonen in het floëem van besmette citrusbomen5. Genomic DNA wordt geëxtraheerd uit het hele blad weefsel, waarin de levende bacteriën. Deze uitgepakte genomic DNA wordt gebruikt als een sjabloon voor conventionele PCR, waar oligonucleotides aanvulling op van de bacterie 16S rDNA volgorde worden gebruikt om te versterken deze volgorde. Oligonucleotides complementair aan een citrus FBOX -gen worden gebruikt als een versterking van de interne controle. We kozen voor deze methode, omdat het heeft bewezen succesvol te zijn in vorige onderzoek6.
Deze methode heeft het duidelijk voordeel dat ze kunnen worden uitgevoerd in een normaal uitgeruste biochemie-lab, eenvoudig en relatief goedkoop. Daarnaast blijft de PCR de nauwkeurigste en meest nauwkeurige methode voor het opsporen van deze pathogenen, als gevolg van de moeilijkheid van het kweken van deze ziekteverwekker7, en het pathogene agens van vermogen om te overleven en te reproduceren voor jaren binnen een asymptomatische host8. Veel verschillende specialiteit PCR testen zijn gebruikt om met succes het detecteren van deze pathogene agens oplevert; conventionele PCR blijft echter de eenvoudigste bepaling voor de accurate en specifieke detectie, vooral binnen de asymptomatische hosts8.

<table><tbody><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Bron van Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitatie en DNA Rehydratie oplossingen</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro met bedieningspaneel</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Microgolfoven</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 tafeltop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 digitale waterbad</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Metalen spatel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Morser en stamper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 10 μL tips</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 200 μL tips</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 1250 μL tips</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Variabel Volume Pipettor Kit</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>μcuvet</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Stapelbaar gietbakje en kammen</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic voeding</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospectrometer basic</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR buizen</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge buizen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Water, PCR kwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

specifieke en nauwkeurige detectie van de citrus vergroening pathogen candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele pcr op citrus blad weefselsteekproeven

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, is een destructieve citrus ziekte teistert citrus bedrijven wereldwijd. Deze ziekte veroorzaakt asymmetrische geel blad patroon, ader vergeling, naald-of bladverlies, root verval en uiteindelijk de dood van de citrus plant. Wanneer septisch, de citrus planten groei hebben onvolgroeide en produceren bloemen buiten het seizoen. Deze bloemen opbrengst zelden fruit, en die kleine, bittere, onregelmatig gevormde citrusvruchten die opbrengst zijn niet wenselijk. Deze ziekte wordt verspreid door de Aziatische citrus psyllid, Diaphorina citri, en door het enten van geïnfecteerde citrus weefsel. Het pathogene agens heeft een lange en variabele incubatietijd binnen de citrus plant — soms jaren voordat de symptomen verschijnen. Pogingen om deze pathogenen in vitro cultuur zijn mislukt, mogelijk vanwege de lage en ongelijke concentratie van het pathogene agens binnen citrus weefsel besmet, of omdat het moeilijk is om te repliceren de milieu dat bevorderlijk is voor groei van voorwaarden het pathogene agens oplevert. Het is erg moeilijk om de ziekte identificeren voordat het heeft verspreid, als gevolg van de lange incubatietijd en onderzoekers onvermogen om de cultuur van het pathogene agens oplevert. Dientengevolge, blijkt de ziekte alleen na plotseling citrus akkerbouwer de gehele oogst te vernietigen. Hier gepresenteerd is een methode voor de detectie van het nauwkeurig en specifiek voor de citrus vergroening pathogen, Candidatus liberibacter spp. met behulp van een genomic DNA-extractie kit en PCR. Deze methode is eenvoudig, efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik op elke citrus weefsel; het is echter mogelijk beperkt door de hoeveelheid pathogen in het weefsel aanwezig. Echter zal deze methode toelaten citrus boeren eerder identificeren van besmette citrus planten, en beteugelen van de verspreiding van deze destructieve ziekte voordat het verder kan verspreiden.

Een positief resultaat levert een duidelijke band overeenkomt met 500 bp voor Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, en/of een duidelijke band overeenkomt met 700 bp voor Laa2/Laj5, een insert in de 16S ribosomal β operon9. De versterking van de interne controle band moet ook worden opgegeven bij 400 bp. Deze band komt overeen met de versterking van de citrus FBOX gene10<...

Citrus "vergroening" is een bijzonder destructieve ziekte die citrusvruchten wereldwijd. Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode om met behulp van PCR en genomic DNA-extractie van citrus blad weefsel voor de nauwkeurige en precieze identificatie van het pathogeen citrus vergroening, Candidatus liberibacter spp.

Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Het algemene doel van deze procedure is om het citrus greening-pathogeen Candidatus liberibacter spp. nauwkeurig te detecteren in citrusbladweefsel. Deze methode stelt citrusboeren en onderzoekers in staat om snel en nauwkeurig de aanwezigheid van het pathogeen te identificeren dat verantwoordelijk is voor citrus greening.De procedure zal worden gedemonstreerd door Ian Palmer, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Deze methode is efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Bovendien kan het worden uitgevoerd met een minimum aan laboratoriumervaring en apparatuur.Gebruik eerst schone schaar om een hele verse blad uit een citrusboom te snijden en plaats deze in een schone plastic sandwichzak. Koel vervolgens een vijzel en stamper af door een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe te voegen. Gebruik vervolgens de schaar om kleine stukjes van het bladweefsel te snijden, ongeveer een vierkante inch in grootte.Plaats de bladstukken in de vijzel om ze onmiddellijk te bevriezen. Begin snel met het malen van het bladweefsel met de vijzel, totdat de vloeibare stikstof is verdampt en er een fijn groen poeder overblijft. Koel vervolgens een metalen spatel in vloeibare stikstof gedurende 10 tot 15 seconden.Gebruik vervolgens de koude spatel om het gemalen weefsel uit de vijzel in een 1,5ML microcentrifugebuis te scheppen. Gebruik een 1000ML pipet om 600ML van nucleïnezuur oplossing toe te voegen aan het monster. Vervolgens het monster gedurende één tot drie seconden voor de vortex te zetten.Incubeer de buis gedurende 15 minuten in een waterbad op 65 graden Celsius. Zodra de incubatietijd voorbij is, gebruik een 10ML pipet om 3ML RNA-oplossing toe te voegen aan het lysate om RNA te verwijderen. Meng vervolgens de inhoud van de buis door hem twee tot vijf keer om te draaien.Incubeer gedurende 15 minuten in een kast-incubator op 37 graden Celsius. Voeg na 15 minuten 200ML van eiwitprecipitatie-oplossing toe aan het monster. Vorm de buis op hoge snelheid gedurende 20 seconden.Centrifugeer vervolgens het monster gedurende drie minuten bij 13000G. Tijdens het centrifugeren voeg je 600ML isopropanol toe, gehouden op kamertemperatuur, aan een nieuwe 1,5ML microcentrifugebuis. Nadat de centrifugering voorbij is, verwijder je voorzichtig het supernatant uit de centrifugeerbuis naar de buis met isopropanol.Gooi het pellet weg. Draai de buis om zodat het DNA zichtbaar is als een draadachtige streng. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende een minuut bij 13000G op kamertemperatuur.Decanteer het supernatant na centrifugatie. Voeg vervolgens 600ML van 70% ethanol toe aan het pellet. Draai de buis meerdere keren om het pellet te wassen.Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 13000G. Nadat de centrifugering voorbij is, zuig voorzichtig het supernatant af. Draai vervolgens de buis met de dop open op een absorberend papier om 15 minuten te laten drogen.Eenmaal gedroogd voeg je 100ML van DNA-rehydratatieoplossing toe aan het pellet. Incubeer de DNA-suspensie gedurende een uur in een waterbad op 65 graden Celsius. Tik periodiek op de buis terwijl je mixt.Voeg 1ML van gezuiverd water toe in een microcuvet. Lees het water als blanco op de spectrofotometer. Voeg vervolgens 1ML van het monster toe in de microcuvet.Plaats de microcuvet op de spectrofotometer en verkrijg de DNA-concentratie. Stel de PCR-reactie samen door alle reagentia en 100 nanogram van genomisch DNA toe te voegen in een 50ML PCR-buis. Meng de reagentia door voorzichtig te schudden met de buis, gevolgd door een snelle centrifugatie.Plaats de PCR-buis in de thermocyclus en voer het programma uit. Om de agarosegel voor te bereiden, weeg 0,4 gram agarosepoeder. Voeg vervolgens het agarosepoeder toe aan een 200ML Erlenmeyer kolf en pas het volume aan tot 50ML met 1X TAE-buffer.Microwave de agarosemixtuur op hoog niveau gedurende ongeveer 1,5 minuten. Schud elke 30 seconden totdat de agarose volledig is opgelost. Voeg vervolgens 2,5ML van 10 milligram per milliliter etidiumbromide toe aan de vloeibare agarose.Schud vervolgens de kolf om het etidiumbromide te mengen en giet snel de vloeibare agarosegel in een vlakke gelvorm. Plaats onmiddellijk een standaard 12-tands gelkam. Laat de gel ongeveer 20 minuten afkoelen op kamertemperatuur en verwijder vervolgens de gelkam.Plaats nu de gestolde gel in de elektroforese-eenheid gevuld met 1X TAE-buffer. Laad het totale geamplificeerde DNA-monster en 5ML van DNA later in aparte putjes op de gel. Start de elektroforese-eenheid, op een constante 90 volt gedurende 35 minuten.Verwijder vervolgens de gel uit de elektroforese-eenheid. Plaats vervolgens de gel op een UV-transilluminator. Leg de foto's van de gelbandpatronen vast in de transilluminator bij 302 nanometer.Om de vergroeningsbacterie te identificeren, worden de PCR-geamplificeerde genomische DNA's verkregen uit zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde monsters geëlektroforeteerd. In de gel geven deze banden die overeenkomen met 500 basenparen aan dat er een specifiek gebied van de Las16S ribosomale DNA in de CL asiatica-bacterie aanwezig is. Deze banden die overeenkomen met 700 basenparen geven de aanwezigheid van LAA2/LAJ5 aan, en insert aanwezig in de 16S ribosomale beta-operon DNA-sequentie in de bacterie.Deze verschillende banden op 400 basenparen geven de amplificatie van alleen het citrus F-box-gen aan, wat verwijst naar de interne amplificatiecontrole. Om onze resultaten geldig te achten, is de aanwezigheid van deze band vereist. Aan de andere kant geeft de aanwezigheid van alleen een band op 400 basenparen, maar het ontbreken van de andere banden op 50

specific-accurate-detection-citrus-greening-pathogen-candidatus

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Source: Gulla, S., et al. Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (2019).This protocol extracts genomic DNA from Yersinia ruckeri by suspending isolated colonies in ultrapure water and applying heat to lyse the cells. Centrifugation separates the DNA-containing supernatant from cell debris, yielding template DNA suitable for PCR-based genotyping and epidemiological analysis.

Extraction of Genomic DNA from Plant Leaf Tissue Infected with Pathogenic Bacteria

Source: Chen, H., et al. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the extraction of total genomic DNA from citrus leaf tissue infected with a pathogenic bacterium. The protocol enables reliable DNA recovery for downstream PCR-based detection of the phloem-limited pathogen.

Extraction of Total DNA from Leaves for Detection of Bacterial Infection

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Genestelde PCR is een eenvoudig, gevoelige en specifieke techniek die kan worden toegepast op de teek die DNA geëxtraheerd om sonde voor Borrelia burgdorferi, de verwekker van de ziekte van Lyme. De eerste PCR experiment maakt gebruik van gen-specifieke primers voor het genereren van lange waarbij, die vervolgens worden sjablonen voor een latere reactie met behulp van interne inleidingen.

Opsporen van de ziekte van Lyme-spirocheet, Borrelia Burgdorferi, in teken met behulp van genestelde PCR

Deze paper meldt het protocol voor een snelle identificatie assay voor Bemisia tabaci gebaseerd op lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) technologie. Het protocol vereist minimale laboratorium opleiding en kan, daarom, ter plaatse op de punten van binnenkomst voor de plant invoer zoals zeehavens en luchthavens worden uitgevoerd.

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

We ontwikkelden een methode om Phytophthora capsici zoospores in waterbronnen te detecteren met behulp van een filter papier DNA-extractie methode in combinatie met een lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test die kan worden geanalyseerd in het veld of in het lab.

Detectie van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van loop-gemedieerde isothermale versterking

In dit werk werd een snelle, gevoelige en draagbare detectiemethode voor Candidatus Liberibacter asiaticus ontwikkeld op basis van recombinasepolymeraseversterking in combinatie met CRISPR-Cas12a.

In het veld inzetbare Candidatus Liberibacter asiaticus detectie met behulp van recombinase polymerase amplificatie in combinatie met CRISPR-Cas12a

We hebben een instrument ontworpen, gefabriceerd en gevalideerd dat snel floëemrijke schors citrusknophoutweefsels verwerkt. In vergelijking met de huidige methoden heeft de budwood tissue extractor (AHO) de monsterdoorvoer verhoogd en de vereiste arbeids- en apparatuurkosten verlaagd.

Automatisering van citrus budwood verwerking voor downstream pathogene detectie door middel van instrument engineering

Dit manuscript beschrijft een nieuw direct planteninfuusapparaat voor het screenen van de effectiviteit van moleculen tegen de bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) of zijn insectenvector (Diaphorina citri, Kuwayama) die, in combinatie, geassocieerd zijn met Huanglongbing citrusziekte.

Direct infuusapparaat voor molecuulafgifte in planten

In dit protocol wordt een gecombineerde recombinasepolymeraseamplificatie CRISPR/Cas12a-assay geïllustreerd voor de detectie van de invasieve plantpathogeen Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Gecombineerde recombinasepolymeraseamplificatie CRISPR/Cas12a-test voor het detecteren van Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle procedure voor het detecteren van DNA van bijenpathogenen, zoals Lotmaria passim en Nosema ceranae, met behulp van een amplificatie-ready cellysis, recombinasepolymeraseamplificatie en CRISPR/Cas12a-assays.

On-site DNA-detectie van trypanosomatide parasieten en Nosema ceranae door middel van alkalische lysis gekoppeld aan RPA/CRISPR/Cas12a-systeem

Leer een betrouwbare PCR-methode voor de detectie van Candidatus liberibacter spp. in citrusbladweefsel. Deze techniek ondersteunt boeren en onderzoekers bij het snel identificeren van het veroorzaker van citrusvergroening.

Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven (Video) | JoVE Journal

Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven

Meer video's verkennen