Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven

Het algemene doel van deze procedure is om het citrus greening-pathogeen Candidatus liberibacter spp. nauwkeurig te detecteren in citrusbladweefsel. Deze methode stelt citrusboeren en onderzoekers in staat om snel en nauwkeurig de aanwezigheid van het pathogeen te identificeren dat verantwoordelijk is voor citrus greening.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Ian Palmer, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Deze methode is efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Bovendien kan het worden uitgevoerd met een minimum aan laboratoriumervaring en apparatuur.

Gebruik eerst schone schaar om een hele verse blad uit een citrusboom te snijden en plaats deze in een schone plastic sandwichzak. Koel vervolgens een vijzel en stamper af door een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe te voegen. Gebruik vervolgens de schaar om kleine stukjes van het bladweefsel te snijden, ongeveer een vierkante inch in grootte.

Plaats de bladstukken in de vijzel om ze onmiddellijk te bevriezen. Begin snel met het malen van het bladweefsel met de vijzel, totdat de vloeibare stikstof is verdampt en er een fijn groen poeder overblijft. Koel vervolgens een metalen spatel in vloeibare stikstof gedurende 10 tot 15 seconden.

Gebruik vervolgens de koude spatel om het gemalen weefsel uit de vijzel in een 1,5ML microcentrifugebuis te scheppen. Gebruik een 1000ML pipet om 600ML van nucleïnezuur oplossing toe te voegen aan het monster. Vervolgens het monster gedurende één tot drie seconden voor de vortex te zetten.

Incubeer de buis gedurende 15 minuten in een waterbad op 65 graden Celsius. Zodra de incubatietijd voorbij is, gebruik een 10ML pipet om 3ML RNA-oplossing toe te voegen aan het lysate om RNA te verwijderen. Meng vervolgens de inhoud van de buis door hem twee tot vijf keer om te draaien.

Incubeer gedurende 15 minuten in een kast-incubator op 37 graden Celsius. Voeg na 15 minuten 200ML van eiwitprecipitatie-oplossing toe aan het monster. Vorm de buis op hoge snelheid gedurende 20 seconden.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende drie minuten bij 13000G. Tijdens het centrifugeren voeg je 600ML isopropanol toe, gehouden op kamertemperatuur, aan een nieuwe 1,5ML microcentrifugebuis. Nadat de centrifugering voorbij is, verwijder je voorzichtig het supernatant uit de centrifugeerbuis naar de buis met isopropanol.

Gooi het pellet weg. Draai de buis om zodat het DNA zichtbaar is als een draadachtige streng. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende een minuut bij 13000G op kamertemperatuur.

Decanteer het supernatant na centrifugatie. Voeg vervolgens 600ML van 70% ethanol toe aan het pellet. Draai de buis meerdere keren om het pellet te wassen.

Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 13000G. Nadat de centrifugering voorbij is, zuig voorzichtig het supernatant af. Draai vervolgens de buis met de dop open op een absorberend papier om 15 minuten te laten drogen.

Eenmaal gedroogd voeg je 100ML van DNA-rehydratatieoplossing toe aan het pellet. Incubeer de DNA-suspensie gedurende een uur in een waterbad op 65 graden Celsius. Tik periodiek op de buis terwijl je mixt.

Voeg 1ML van gezuiverd water toe in een microcuvet. Lees het water als blanco op de spectrofotometer. Voeg vervolgens 1ML van het monster toe in de microcuvet.

Plaats de microcuvet op de spectrofotometer en verkrijg de DNA-concentratie. Stel de PCR-reactie samen door alle reagentia en 100 nanogram van genomisch DNA toe te voegen in een 50ML PCR-buis. Meng de reagentia door voorzichtig te schudden met de buis, gevolgd door een snelle centrifugatie.

Plaats de PCR-buis in de thermocyclus en voer het programma uit. Om de agarosegel voor te bereiden, weeg 0,4 gram agarosepoeder. Voeg vervolgens het agarosepoeder toe aan een 200ML Erlenmeyer kolf en pas het volume aan tot 50ML met 1X TAE-buffer.

Microwave de agarosemixtuur op hoog niveau gedurende ongeveer 1,5 minuten. Schud elke 30 seconden totdat de agarose volledig is opgelost. Voeg vervolgens 2,5ML van 10 milligram per milliliter etidiumbromide toe aan de vloeibare agarose.

Schud vervolgens de kolf om het etidiumbromide te mengen en giet snel de vloeibare agarosegel in een vlakke gelvorm. Plaats onmiddellijk een standaard 12-tands gelkam. Laat de gel ongeveer 20 minuten afkoelen op kamertemperatuur en verwijder vervolgens de gelkam.

Plaats nu de gestolde gel in de elektroforese-eenheid gevuld met 1X TAE-buffer. Laad het totale geamplificeerde DNA-monster en 5ML van DNA later in aparte putjes op de gel. Start de elektroforese-eenheid, op een constante 90 volt gedurende 35 minuten.

Verwijder vervolgens de gel uit de elektroforese-eenheid. Plaats vervolgens de gel op een UV-transilluminator. Leg de foto's van de gelbandpatronen vast in de transilluminator bij 302 nanometer.

Om de vergroeningsbacterie te identificeren, worden de PCR-geamplificeerde genomische DNA's verkregen uit zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde monsters geëlektroforeteerd. In de gel geven deze banden die overeenkomen met 500 basenparen aan dat er een specifiek gebied van de Las16S ribosomale DNA in de CL asiatica-bacterie aanwezig is. Deze banden die overeenkomen met 700 basenparen geven de aanwezigheid van LAA2/LAJ5 aan, en insert aanwezig in de 16S ribosomale beta-operon DNA-sequentie in de bacterie.

Deze verschillende banden op 400 basenparen geven de amplificatie van alleen het citrus F-box-gen aan, wat verwijst naar de interne amplificatiecontrole. Om onze resultaten geldig te achten, is de aanwezigheid van deze band vereist. Aan de andere kant geeft de aanwezigheid van alleen een band op 400 basenparen, maar het ontbreken van de andere banden op 50