Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren
10 maart 2018
Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).
Het algemene doel van de cel-gebaseerde Assay is het identificeren van moleculen die zich binden aan een G-proteïnegekoppelde receptor. Gebaseerd op hun vermogen om te concurreren met een fluorescerend-gelabelde ligand voor binding aan de receptor. Competitieve bindingstest kan de ontdekking van G-proteïnegekoppelde receptorgeneesmiddelen ondersteunen.
Zoals we zullen demonstreren met dit protocol voor de chemokine receptor, CXC4. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat levende cellen worden gebruikt om receptieve binding te analyseren in plaats van geheugenvoorbereidingen. En dat het gebruik van radioactiviteitslabel-sondes wordt vermeden.
Hoewel deze methode aanvankelijk is opgezet om binding aan de chemokine receptor CXCR4 te bestuderen, kan deze ook worden ontwikkeld voor andere GPCR waarvoor fluorescerend-gelabelde liganden bestaan. Om te beginnen, doseert u 100 microliter oplossing van de verbinding in een heldere 96-wels platte bodem plaat, volgens een vooraf gedefinieerde experimentele lay-out. Voeg 50 microliter celsuspensie uit een reagent reservoir toe aan de 96-wels plaat met behulp van een multi-kanaals pipet.
Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na incubatie, voeg 50 microliter van fluorescerend-gelabelde 100 nanogram per milliliter CXCL12 toe uit een soortgelijk reagent reservoir aan de wels van de 96-wels plaat. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
Centrifugeer vervolgens de 96-wels plaat gedurende vijf minuten bij 400 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant van de gepelletiseerde cellen door de plaat om te draaien. Droog de plaat op een tissue.
Voeg 200 microliter verse SA-buffer uit een reagent reservoir toe aan de wels met behulp van een multi-kanaals pipet. Centrifugeer de plaat onmiddellijk opnieuw gedurende vijf minuten bij 400 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur. Verwijder opnieuw het supernatant door de plaat om te draaien en droog het vervolgens op een tissue.
Suspenseer tenslotte het cel-pellet voorzichtig opnieuw in 200 microliter 1% paraformaldehyde opgelost in PBS. Deze stap zal de cellen fixeren. Om de monsters te analyseren door middel van flowcytometrie, start u het apparaat en opent u de bijbehorende software.
Selecteer de cellulaire parameters die in een dot block-indeling worden weergegeven, zoals voorwaartse scatter oppervlakte, zijwaartse scatter oppervlakte en in een histogramweergave, de fluoro vier detectiekanaal. Kies een monster. Bijvoorbeeld een negatief controlemonster, om gating van een gedefinieerde homogene celpopulatie uit te voeren op basis van de voorwaartse scatter en zijwaartse scatter parameters.
Pas de instellingen aan voor het laden van de cellen in het flowcytometrie apparaat. Selecteer drie mixen voor injectie. Selecteer automatische injectie van 100 microliter gefixeerde cellen en gebruik een monsterstroomsnelheid van 1,5 microliter per seconde.
Voer het monster uit door gegevens te selecteren. De voorwaartse scatter en zijwaartse scatter parameters voor dit monster, evenals de fluoro vier detectie zullen nu op het scherm verschijnen. Selecteer nu het software gating-gereedschap.
Op basis van de voorwaartse scatter en zijwaartse scatter dot plot visualisatie, predefinieer een homogene en levensvatbare celpopulatie door gating. Selecteer om 20.000 gebeurtenissen per monster te analyseren. Dit betekent dat voor elk monster, 20.000 cellen die binnen een vooraf gedefinieerde gate vallen, uiteindelijk zullen worden geanalyseerd.
De gegevensverwerving zal doorgaan totdat dit aantal gebeurtenissen is bereikt. Start de uitvoering door eerst de te analyseren wels te selecteren. Selecteer vervolgens wels uitvoeren.
Het flowcytometrie apparaat zal nu deze monsters één voor één analyseren door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor elk monster te registreren. Dit komt overeen met het gemiddelde fluorescente signaal van de 20.000 cellen die binnen de vooraf gedefinieerde gate vallen. Voer ten slotte de gegevensanalyse uit zoals beschreven in het protocol.
Na pre-incubatie van jurkat cellen met hoge concentraties van AMD3100, onbevestigd en specifiek CXCR4 antagonist. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit die binding van gelabeld CXCL12 weerspiegelt, is bijna volledig verminderd tot achtergrondniveaus. Dit demonstreert de zeer specifieke binding van CXCL12 aan CXCR4 uitgedrukt op jurkat cellen.
Verbindingen die niet in staat zijn om met gelabeld CXCL12 te concurreren voor binding aan de CXCR4 receptor, zoals de CCR5 antagonist Maraviroc, zullen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit niet beïnvloeden. In tegenstelling daarmee zullen hoog actieve verbindingen dit op dosisafhankelijke wijze doen. Na het bekijken van de video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een competitieve receptieve bindingstest uitvoert met behulp van levende cellen en flowcytometrie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde cellulaire bindingsassay die erop gericht is verbindingen te identificeren die de binding van CXCL12 aan CXCR4 remmen. De methode maakt gebruik van levende cellen om receptorbinding te analyseren, waardoor het gebruik van radioactieve labels wordt vermeden.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Cellulaire bindingsassays
- G-proteïnegekoppelde receptoren
- Geneesmiddelenonderzoek
Achtergrond
- CXCL12 is een chemokine die bindt aan CXCR4, een G-proteïnegekoppelde receptor.
- Het identificeren van remmers van deze binding kan helpen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen.
- Traditionele methoden maken vaak gebruik van radioactiviteit, wat deze assay probeert te vermijden.
- Het gebruik van levende cellen biedt een nauwkeurigere weergave van biologische interacties.
Doel van de studie
- Om een screeningtool te ontwikkelen voor het identificeren van verbindingen die de binding van CXCL12 aan CXCR4 remmen.
- Om de voordelen aan te tonen van het gebruik van levende cellen in bindingsassays.
- Om inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen voor G-proteïnegekoppelde receptoren te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Flowcytometrie voor het analyseren van cellulaire binding.
- Gebruik van fluorescentiegelabelde liganden om bindingscompetitie te beoordelen.
- Levende-celassays om receptorinteracties te evalueren.
- Vermijden van radioactieve labeling in de experimentele opzet.
Belangrijkste resultaten
- De assay identificeert met succes verbindingen die de binding van CXCL12 remmen.
- Analyse van levende cellen levert relevantere gegevens op vergeleken met traditionele methoden.
- De methode is effectief voor het screenen van potentiële geneesmiddelkandidaten.
- De resultaten ondersteunen de haalbaarheid van het gebruik van deze assay bij de ontdekking van geneesmiddelen.
Conclusies
- De op flowcytometrie gebaseerde assay is een waardevol instrument voor het identificeren van CXCR4-remmers.
- Het gebruik van levende cellen verbetert de nauwkeurigheid van bindingsstudies.
- Het vermijden van radioactiviteit vereenvoudigt het experimentele proces.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze op flowcytometrie gebaseerde competitieve bindingsassay stelt biopharma-teams in staat om kleine moleculen te identificeren die CXCL12-CXCR4-interacties verstoren, een belangrijk doelwit in pijplijnen voor oncologie en inflammatoire ziekten. Door gebruik te maken van levende cellen en fluorescerende liganden, vermijdt deze methode radioactiviteit terwijl er fysiologisch relevante bindingsgegevens worden geleverd. Het ondersteunt targetvalidatie in een vroeg stadium en de identificatie van lead-verbindingen door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten te leveren voor de prioritering van verbindingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door directe effecten van verbindingen op de receptor-ligandbinding in een natuurlijke cellulaire context te meten.
- Operationele waarde: Biedt een functionele readout die de risico's van CXCR4 als doelwit vermindert door mechanistische bevestiging van de activiteit van de verbinding.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren met dosisafhankelijke inhibitieprofielen die wijzen op target engagement.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over bindingsinhibitie via de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, waardoor structurele activiteitsrelatie-analyse mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Aanpasbaar aan het 96-wells plaatformaat, wat de doorvoer voor screeningscampagnes verhoogt terwijl de consistentie van de assay behouden blijft.
- Herbruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd platform dat toepasbaar is op andere GPCR's wanneer fluorescente liganden beschikbaar zijn, waardoor de inspanning voor herontwikkeling wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van levende Jurkat-cellen om fysiologische receptorexpressie en bindingsdynamiek te weerspiegelen, waardoor de translationele relevantie wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Genereert gegevens die compatibel zijn met downstream preklinische evaluatie door target-specifieke effecten van verbindingen te bevestigen.
- Risicobeperking: Vermindert fout-positieven door specifieke CXCR4-remmers te onderscheiden van aspecifieke verbindingen (bijv. Maraviroc vertoont geen effect).
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en levert bindingsgegevens die de hit-to-lead-progressie informeren. Het vult fenotypische screening aan door mechanistische diepgang toe te voegen aan de karakterisering van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door de door verbindingen veroorzaakte verstoring van de binding van CXCL12 aan CXCR4 in levende cellen te kwantificeren.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde incubatie-, was- en fixatiestappen die compatibel zijn met flowcytometrie-uitlezingen.
- Analytics: Levert de gemiddelde fluorescentie-intensiteit als kwantitatieve output voor het vergelijken van de potentie en effectiviteit van verbindingen over verschillende doses.
- Translational Research: Maakt gebruik van een ziekterelevante cellijn (Jurkat) die CXCR4 tot expressie brengt, waardoor bindingsgegevens worden gekoppeld aan de potentiële therapeutische impact bij kanker en ontsteking.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een modulair bindingsplatform dat overdraagbaar is naar andere GPCR-targets, waardoor de ROI op de investering in assayontwikkeling wordt gemaximaliseerd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de target-interactie door specifieke, verdringbare binding van CXCL12 aan CXCR4 aan te tonen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde celbehandeling, incubatietijden en protocollen voor flowcytometrie-gating.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door verbindingen die geen target-specifieke activiteit vertonen vroeg in de ontdekkingsfase te filteren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door verbindingen met duidelijke dosisafhankelijke inhibitieprofielen te identificeren.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in het bedienen van flowcytometrie, compensatie en gating-strategieën voor levensvatbare celpopulaties.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers die in staat zijn fluorescente signalen in het juiste kanaal te detecteren (bijv. FITC of equivalent).
- Maakt standaardisatie van de celpreparatie, verbindingenverdunning en incubatiecondities tussen screeningbatches noodzakelijk.
- Aanpassing aan andere GPCR's vereist de ontwikkeling of aanschaf van fluorescentielabelled liganden die specifiek zijn voor de doelreceptor.
- Praktische beperkingen omvatten de duur van de assay (~90 minuten plus analysetijd) en de noodzaak voor optimalisatie van de ligandconcentratie om robuuste signaal-ruisverhoudingen te garanderen.
