Name: Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer een flowcytometrie-gebaseerde bindingassay om verbindingen te identificeren die CXCL12-binding aan CXCR4 verstoren. Deze methode gebruikt levende cellen zonder radioactiviteit voor nauwkeurige G-eiwitgekoppelde receptoronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank Eric Fonteyn voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de KU Leuven (verlenen neen. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, neen verlenen. G.485.08) en de Fondation chalets Vaduz.

1. onderhoud van celkweek
Opmerking: Alle stappen beschreven onder 1 en 2 worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flow kabinet.
<ol><li>Het groeien van cellen in T75 cultuur kolven op 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Opmerking: In deze test, Jurkat cellen (dat wil zeggen, menselijke leukemische T-lymfocyten cellen die endogeen express CXCR417) worden gebruikt. Uitdrukking van CXCR4 bij het celoppervlak moet worden geëvalueerd in de gehele cel kweken door middel van cytometry van de stroom. Een beschrijving van de stroom cytometry procedure en reagentia te bepalen receptor expressie niveaus op het celoppervlak is, echter niet binnen de werkingssfeer van dit protocol, maar is beschreven eerder17.</li>
	<li>Laat Jurkat cellen groeien in suspensie totdat ze 80-85% confluency. Voordat het passaging van de cellen in een maatkolf van de roman, wil alle reagentia tot kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Voeg 20 mL verse volledige groeimedium (RPMI-1640 medium, 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM glutamine) aan een roman T75 cultuur maatkolf.</li>
	<li>Voeg 5 mL celsuspensie van Jurkat uit de oorspronkelijke T75 kolf (met 25 mL celsuspensie) naar de roman T75 cultuur kolf. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator.</li>
</ol>2. bereiding van CXCL12, Assay Buffer en Jurkat cellen voor de competitie bindend Assay.
<ol><li>Bereid een stockoplossing van CXCL12AF647 (20 µg/mL; Zie tabel van materialen en reagentia) door de ontbinding van het gelyofiliseerd reagens (opgeslagen bij-80 ° C, in het donker) in ultrazuiver water aangevuld met 0,01% (volume/volume) van Polysorbaat 20. Opslaan Eenpersoonsgebruik aliquots van deze stamoplossing bij-80 ° C, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Assay buffer te bereiden door toevoeging van 40 mL HEPES (1 M, 20 mM definitieve concentratie) op 200 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS, 10 x, zonder fenol rood en natriumbicarbonaat, 1 x eindconcentratie). Toevoegen ultrazuiver water tot een eindvolume van 2 L. toevoegen 4 g (gewicht/volume 0,2%) bovien serumalbumine (BSA) te verkrijgen, en los van de BSA via magnetische roeren. Tot slot breng de pH op 7.4 (NaOH hiervoor gebruiken) en filtreer de oplossing door middel van 0,2 µm poriën (Zie tabel van materialen en reagentia) met behulp van een vacuüm variëteit. Opmerking: Deze buffer test zal worden gebruikt in alle verdere stappen van het protocol.</li>
	<li>Tellen van het aantal en de levensvatbaarheid van de cellen. Hiervoor, neemt een monster van de celsuspensie en Verdun het in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Opmerking: We gebruiken routinematig een geautomatiseerde cel levensvatbaarheid analyzer (Zie tabel van materialen en reagentia) geschikt voor het tellen van cel schorsingen in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar. Verdun voor het tellen van de cel, 0,5 mL celsuspensie in 1,5 mL PBS (andere verdunningen, bijvoorbeeld 0,1 mL in 1.9 mL PBS, zijn ook mogelijk). Het gebruik van deze methode, die is gebaseerd op de trypan methode voor de uitsluiting van de blauwe kleurstof, geweest eerder26beschreven. Verschillende andere apparaten zijn commercieel verkrijgbaar voor het tellen van celaantal en levensvatbaarheid die even goed zou moeten werken.</li>
	<li>Het gewenste aantal cellen (dat wil zeggen, ~ 24 x 106 cellen uit te voeren van de bepaling met één volledige 96-wells-plaat) verzamelen in een steriele 50 mL-buis door middel van centrifugeren (Zie tabel van materialen en reagentia voor het soort centrifuge gebruikt) bij 400 x g gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Giet voorzichtig af de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. Toevoegen van verse assay buffer (bijvoorbeeld 20 mL) en resuspendeer de cellen door pipetteren zachtjes op en neer.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen opnieuw bij 400 x g gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Giet weer af het supernatant en resuspendeer de pellet cel in verse assay buffer te verkrijgen van een dichtheid van 5 x 106 cellen/mL.</li>
</ol>3. concurrentie bindende Assay
Opmerking: De daadwerkelijke mededinging bindende bepaling wordt uitgevoerd bij RT en niet-steriele omstandigheden kan worden uitgevoerd.
<ol><li>Verdun de verbindingen onderzochte in assay buffer (zie 2.2) te verkrijgen van de gewenste concentratie. Ofwel bereiden een vaste concentratie van compound voor eerste screening (bijvoorbeeld 10 µM eindconcentratie) of, als alternatief, een seriële verdunningsreeks van concentraties voor meer karakterisering van de verbindingen gedetailleerde (bijvoorbeeld een 1/3, 1/4 of 1 / 5 verdunningsreeks basisgewicht van 1 µM, eindconcentratie). Houd in gedachten dat de samengestelde oplossing uiteindelijk 2 x verdund in de analyse worden zal; Daarom bereiden een 2 x geconcentreerde oplossing.</li>
	<li>Breng 100 µL van samengestelde oplossing (2 x geconcentreerd) in een duidelijke 96-Wells ronde bodemplaat (Zie tabel van materialen en reagentia) volgens een vooraf gedefinieerde experimentele lay-out (bijvoorbeeld Figuur 1 c). Opmerking: In dit stadium, positieve en negatieve controlemonsters zijn opgenomen in de bepaling. In de negatieve controlemonsterwordt 100 µL van assay buffer toegevoegd in plaats van samengestelde aan de putjes van de 96-wells-plaat. Voor de positieve controlemonster, wordt assay buffer ook toegevoegd tijdens deze stap. Zie ook Figuur 1 c voor een typische experimentele lay-out waarin een verdunningsreeks van diverse verbindingen wordt getest.</li>
	<li>50 µL celsuspensie toevoegen (zie 2.7; 0,25 x 106 cellen) uit een reservoir reagens in de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer de plaat gedurende 15 min. op RT in het donker.</li>
	<li>Voeg 50 µL van fluorescently geëtiketteerde CXCL12 (d.w.z., 100 ng/mL CXCL12AF647 in assay buffer, 4 x geconcentreerd, 25 ng/mL eindconcentratie) uit een soortgelijke reagens reservoir aan de putjes van de 96-wells-plaat. Incubeer gedurende 30 min op RT in het donker. Opmerking: Voor de negatieve controlemonsters, toevoegen assay buffer in plaats daarvan. Vandaar komt het fluorescent signaal gedetecteerd in de negatieve controlemonsters overeen met de autofluorescent achtergrond signaal (figuur 1A). Voor de positieve controlemonsters, voeg 50 µL per putje van CXCL12AF647. De positieve controlemonsters levert de maximale fluorescentie signaal gedetecteerd, aangezien geen potentiële remming door pre-incubatie met verbindingen werd opgenomen (figuur 1A).</li>
	<li>De 96-wells-plaat bij 400 x g gedurende 5 min op RT. Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de Ingehuld cellen door flipping via de plaat centrifugeren. De plaat op een tissue droog.</li>
	<li>200 µL van verse assay buffer uit een reservoir reagens toevoegen aan de putjes met behulp van een meerkanaalspipet. Onmiddellijk overgaan.</li>
	<li>De plaat weer voor 5 min bij 400 x g bij RT. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door flipping via de plaat centrifugeren en weer droog het op weefsel.</li>
	<li>Zachtjes resuspendeer de pellet cel in 200 µL van 1% paraformaldehyde opgelost in PBS. Deze stap zal het bevestigen van de cellen.</li>
	<li>Het vervolg van het protocol onmiddellijk met de kwantificering van de fluorescentie door stroom cytometry.</li>
</ol>4. analyse van de monsters door stroom cytometry
CXCL12AF647 gekleurd en gefixeerd cellen zijn nu klaar om te worden geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Verschillende soorten flow cytometers kunnen worden gebruikt, maar ze moeten worden uitgerust met de juiste laser (dat wil zeggen, een rode laser, excitatie bereik ~ 630 nm) voor excitatie en geschikte filters voor de detectie van de fluorophore (emissie filters ~ 660 nm). Zij moeten geschikt voor het verwerken van monsters in de indeling van een 96-wells-plaat. Voorbeelden van geschikte stroom cytometry apparaten worden gegeven in de tabel van materialen en reagentia.
<ol><li>Start het apparaat en open de bijbehorende software (Zie tabel van materialen en reagentia).</li>
	<li>Selecteer de volgende cellulaire parameters voor worden gevisualiseerd in een dot vlek formaat: scatter (FSC), kant scatter (SSC) en het fluorophore (CXCL12AF647) detectie kanaal toekomen. Opmerking: Met de parameter FSC cellen worden gediscrimineerd op basis van hun omvang, aangezien de gedetecteerde lichte absorptie evenredig aan de diameter van de cel is. De WS-parameter, meting van de verstrooiing van licht in een hoek van 90°, informatie over de granulariteit van de cellen.</li>
	<li>Kies één monster (bijvoorbeeld een negatieve controlemonster) uit te voeren gating een gedefinieerde homogene celpopulatie op basis van de parameters van de FSC en WS.<ol>
<li>Automatische injectie van ~ 100 µL van gefixeerd cellen selecteren door deze negatieve controlemonster in de cytometer van de stroom. Selecteer de optie "mengen", vóór injectie en gebruik een bemonsteringsstroom van 1,5 µL/s.</li>
		<li>In dit voorbeeld uitvoeren door het selecteren van "Ophaal Data." De parameters van het FSC en WS voor dit voorbeeld wordt nu weergegeven op het scherm.</li>
		<li>Selecteer de software gating gereedschap. Op basis van de FSC en SSC dot vlek visualisatie, vooraf definiëren een homogene en levensvatbare celpopulatie gating. Maak een vorm (met behulp van de software gating gereedschap) dat de homogeen verspreid enkele cellen ("events") op basis van deze twee dimensies bevat om dit te doen. Opmerking: De gating procedure wil definiëren een homogene en levensvatbare celpopulatie die zal worden gebruikt voor verdere analyse. Gating berust op de veronderstelling dat de meerderheid van levensvatbare cellen een homogene celpopulatie op basis van de FSC en SSC parameters zal vormen. Door het uitvoeren van deze stap, kunnen cellulaire puin, dode cellen, en cel aggregaten grotendeels worden uitgesloten van verdere analyse. Een illustratie van het gating proces is gegeven in figuur 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer voor het analyseren van 20.000 "gebeurtenissen" (dat wil zeggen, individuele cellen) per monster. Opmerking: Dit betekent dat voor elk monster, 20.000 cellen die binnen de vooraf gedefinieerde poort vallen uiteindelijk zal worden geanalyseerd. Data-acquisitie voor elk monster wordt voortgezet totdat dit aantal gebeurtenissen is geanalyseerd.</li>
	<li>Start de run ("recordgegevens selecteren"). Het apparaat van stroom cytometry zal nu alle monsters één-door-één analyseren door het opnemen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elk monster. Deze MFI komt overeen met het gemiddelde fluorescent signaal overeenkomt met de 20.000 cellen die binnen de vooraf gedefinieerde poort vallen.</li>
</ol>5. de gegevensanalyse
Gebruik de MFI verkregen voor elk monster alle verdere berekeningen uit te voeren. Analyse van de stroom cytometry gegevens kan worden uitgevoerd door verschillende commercieel beschikbare softwarepakketten (Zie tabel van materialen en reagentia).
<ol><li>Om te bepalen van het percentage remming van het fluorescerende bindende-signaal, als gevolg van samengestelde pre-incubatie, gelden de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq1.jpg"> Waar: MFIExp = de MFI van de experimentele (= stof-behandeld) monster MFIPC de MFI van de positieve controle = MFINC de MFI van de negatieve controle =</li>
	<li>De IC50 om waarde te bepalen van een stof (dat wil zeggen, de concentratie van de stof die de fluorescerende bindende signaal met 50% kan verminderen), gelden de volgende formule: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq2.jpg"> Waar: Logconc.2 = het logboek van een concentratie van de stof die in minder dan 50 resulteert % inhibitie van het verschil tussen de waarde van de MFI's van de PC en NC Logconc.1 = het logboek van een concentratie van de stof die in meer dan 50 resulteert % inhibitie van het verschil tussen de waarde van de MFI's van de PC en NC Opmerking: Als alternatief, in geval van zeer actieve verbindingen, een dosis-responscurve die betrekking hebben op verschillende logboeken van omvang kan worden gegenereerd op basis van de MFI die overeenkomt met elke geteste concentratie van stof. Door het toepassen van niet-lineaire regressie curve-fitting met behulp van de juiste software (Zie tabel van materialen en reagentia), IC50 waarden kunnen vervolgens worden afgeleid uit de gegenereerde bochten. Een voorbeeld van deze benadering vanuit de analyse is afgebeeld in Figuur 3.</li>
</ol>

<ol><li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis%2C+paralogon+groups%2C+and+fingerprints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li>
<li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G-proteins%3A+A+short+history%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li>
<li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li>
<li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+G+protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12040175">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li>
<li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+kinases%3A+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li>
<li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-arrestins%3A+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12209124">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+druggable+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li>
<li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors%3A+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li>
<li>Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li>
<li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR%2Ffusin+and+blocks+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li>
<li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li>
<li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+CXCR4%2FCXCL12+axis+in+oncology%3A+No+place+to+hide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li>
<li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization%2C+HIV+infection%2C+ischemic+diseases%2C+and+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li>
<li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li>
<li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057(2017).</li>
<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMD3100+story%3A+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+%28Mozobil%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li>
<li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4-based+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+CXCR4%2FCXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li>
<li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20460522">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li>
<li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts%3A+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li>
<li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12%2FCXCR4+cellular+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li>
<li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery%3A+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+analysis+using+trypan+blue%3A+manual+and+automated+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li>
<li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc%3A+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li>
<li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+activity+with+AMD11070%2C+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li>
<li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+SDF-1%2FCXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li>
<li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival%2C+cell+adhesion%2C+and+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li>
<li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li>
<li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li>
<li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vergeleken met andere soorten bindende analyses (dat wil zeggen, verzadiging bindende en kinetische bindende experimenten), zijn competitie bindende analyses zeer geschikt voor screeningonderzoek. Inderdaad, zij toestaan dat evaluatie van grote hoeveelheden van labelloze verbindingen, bijvoorbeeld kleine molecules, door hun vermogen om te interfereren met de binding van een vast bedrag van een gelabelde receptor-ligand te scoren. Stoffen die zich aan andere receptor sites dan de gelabelde ligand binden kunnen bl...

G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) zijn cel-oppervlakte-eiwitten die kunnen worden geactiveerd door extracellulaire liganden (bijvoorbeeld peptiden, eiwit hormonen, aminen),1waardoor het reguleren van veel fysiologische en ontwikkelingsdoelen verwerkt. Wanneer een agonist haar GPCR bindende zak neemt, de geïnduceerde conformationele verandering in de receptor proteïne bevordert de binding van intracellulaire receptor-associated heterotrimeric G eiwitten, bestaande uit Gα- BBP en Gβγ subeenheden. De latere uitwisseling van GTP BBP over de Gα subeenheid resultaten in de dissociatie van de G eiwit subeenheden (Gα-GTP en Gβγ), dat op zijn beurt, verder stroomafwaarts leiden zal signaling pathways2,3. Wanneer de Gα-GTP wordt gehydrolyseerd, opnieuw vereniging van de G-α- BBP en Gβγ subeenheden zal converteren het G-eiwit terug naar haar rust staat3,4. Verschillende soorten G eiwitten bestaan (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), die zijn gecategoriseerd op basis van volgorde gelijkenis met de Gα subeenheid5. Alle van deze G-proteïnen veroorzaken gedefinieerde intracellulaire signaalroutes die ten grondslag liggen aan de biologische reactie receptor activering. Na receptor activering phosphorylate GPCR kinases (GRKs) de intracellulaire staart van GPCRs, aldus de interactie met β-arrestins te bevorderen. Dit proces leidt tot de beëindiging van de G-proteïne signalering, receptor desensibilisatie en internalisering6. Β-arrestins zijn ook onderdeel van multi moleculaire complexen dat onafhankelijk is van de G-proteïne signalering7trigger signalering cascades.
GPCRs behoren tot de meest gevalideerde moleculaire targets voor therapeutische interventie, zoals gedereguleerde GPCR-bemiddelde signalering, bijvoorbeeld als gevolg van de winst-van-functie mutaties in de receptor gen of een overexpressie van receptor, draagt bij tot de etiologie van veel ziekten bij de mens8. Daarom, GPCRs vormen een van de meest belangrijke klassen van drug targets onderzocht door de farmaceutische industrie8,9,10. Een opmerkelijk voorbeeld van een klinisch relevante GPCR is de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4), die kan worden geactiveerd door een enige natuurlijke ligand, de CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)-11. Als gevolg van zijn gevestigde rol als een belangrijke co receptor voor humaan immunodeficiëntie virus 1 (HIV-1) ingang en infectie in cluster van differentiatie 4 (CD4) positieve T-lymfocyten12, CXCR4 eerst als een antiviraal geneesmiddel doel onderzocht werd. CXCL12-CXCR4 interactie in het beenmerg verder regelt het bewaren en homing van stuurpen en voorlopercellen cellen13. Ook, gezien haar betrokkenheid in de vele aspecten van kanker biologie (bijvoorbeeld tumor overleving van de cel, metastase, tumor-gerelateerde angiogenese)14 en verschillende andere ziekten bij de mens (bijvoorbeeld ontstekingsziekten)15, CXCR4 significant belang verhoogd als een veelbelovende doelwit voor drugontdekking. AMD3100, een klein molecuul dat zich specifiek richt op CXCR4, aanvankelijk als een anti-HIV drug kandidaat-16 werd ontdekt en is nog steeds een van de meest potente CXCR4 antagonisten beschreven tot en met datum17. Zijn ontwikkeling als een antivirale medicijn echter was niet voortgezet18. Dit molecuul wordt momenteel gebruikt als een stamcel mobilisatie agent tijdens de behandeling van multiple myeloom en lymfoom patiënten18. Verschillende andere chemisch ongerelateerde kleine moleculen en biologics die CXCR4 functie met verschillende sterkte remmen zijn beschreven19.
Receptor bindende methoden zijn waardevolle hulpmiddelen in farmacologie, die het mogelijk maken de identificatie van stoffen (bijvoorbeeld kleine moleculen) die rechtstreeks interageren met de GPCR van belang. Om bindende studies, is er geen behoefte aan voorafgaande kennis over de intracellulaire signalering eigenschappen of functionaliteit van een bepaalde GPCR. Hoewel dit kan worden beschouwd als een voordeel, betekent het dat verbindingen voor welke receptor bindend kan worden aangetoond verder worden gekenmerkt moeten door de evaluatie van hun potentiële agonistic of antagonistische activiteit. Deze activiteit kan worden geëvalueerd met behulp van farmacologische of biologische tests aan de GPCR bestudeerde gerelateerde. Afhankelijk van hun activiteit profiel, receptor bindende moleculen kunnen vervolgens potentieel te evolueren om roman loodverbindingen voor onderzoek in de pre-klinische en klinische studies. Moleculen die zich specifiek aan een receptor met hoge affiniteit binden kunnen ook dienen als steigers voor het genereren van therapeutische of diagnostische hulpmiddelen, bijvoorbeeld door hen voor noninvasive in vivo imaging van tumor cellen20, radiolabeling of als potentieel voertuigen voor gerichte levering van therapeutics21. In geval van CXCR4, is in vivo imaging van tumorcellen al aangetoond met behulp van Muismodellen waarin gelabelde CXCR4-targeting moleculen toegestaan de visualisatie van menselijke kanker xenografts20,22,23 .
In dit verslag beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een competitie bindende assay waarmee de identificatie van kleine moleculen en biologics die direct agonist (CXCL12) bindend aan CXCR4 storen. Het fundamentele principe van de test is de concurrentie tussen een vast bedrag van fluorescently geëtiketteerde ligand (CXCL12AF647, Zie tabel van materialen en reagentia) en ongelabelde compounds voor binding aan de receptor eiwitten17, 24. het specifieke fluorescent signaal van gelabelde ligand gebonden aan afzonderlijke cellen uiten CXCR4 wordt vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. Dit fluorescent signaal zal worden verminderd wanneer labelloze kleine moleculen de interactie tussen CXCL12AF647 en CXCR4 verstoren. De bepaling maakt gebruik van niet-gemanipuleerd levende cellen die endogeen CXCR4 uitdrukken (dat wil zeggen, Jurkat cellen). Vandaar, geen voorbereiding celmembraan is vereist, waardoor de assay gemakkelijke, snelle en compatibel met grotere gegevensdoorvoer. Omdat een fluorescently geëtiketteerde ligand wordt gebruikt, de radioactiviteit wordt vermeden.
Want CXCL12 de natuurlijke agonist voor CXCR4 is, zijn klein molecuul verbindingen die met de binding van de CXCL12AF647 in de bepaling interfereren waarschijnlijk om te interageren met de orthosteric receptor bindende site (dat wil zeggen, de bindende site door de natuurlijke bezet agonist). Moleculen die met receptor bandplaatsen topografisch onderscheiden van de orthosteric binding site interageren zou blijven onopgemerkt, als ze niet bindend van CXCL12 beïnvloeden. Bijvoorbeeld, wordt positieve en negatieve allosteric modulatoren, een belangrijke en opkomende categorie van GPCR gericht op moleculen op allosteric bindende sites25, mogelijk niet opgehaald met deze test. Bovendien of de verbindingen met deze bindende bepaling functie als receptorantagonisten of geïdentificeerd als agonisten niet kan worden afgeleid. Onderzoek van de geïdentificeerde verbindingen in extra farmacologische of functionele receptor-gerelateerde tests zal dus worden vereist. Deze testen kunnen bevatten (een combinatie van) cellulaire fluorescentie - of luminescentie gebaseerde tests voor de opsporing van tweede boodschappers (b.v., Ca2 +, cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP)), fenotypische of biologische tests en β-arrestin de testen van de rekrutering, de keuze daarvan hangt af van de specifieke signalering eigenschappen van de GPCR bestudeerde. Vandaar, de concurrerende bindende bepaling hierin voornamelijk beschreven fungeert als een eerste screening test die worden aangevuld met andere cel-gebaseerde testen moet om een diepgaande karakterisering van verbindingen met de receptor bindende potentie.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton Dickinson</td><td>Niet van toepassing</td><td>Flow cytometry apparaat</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSArray</td><td>Becton Dickinson</td><td>Niet van toepassing</td><td>Flow cytometry apparaat</td></tr><tr><td>BD FACSArray System Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>softwarepakket gebruikt voor niet-lineaire regressieanalyse in Figuur 2 en Figuur 3</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo is nu een volledige dochteronderneming van BD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL</td><td>Beckman Coulter</td><td>Niet van toepassing</td><td>celviabiliteitsanalyzer</td></tr><tr><td>Sigma 3-18 KS</td><td>Sigma</td><td>Niet van toepassing</td><td>centrifuge</td></tr><tr><td>AMD3100</td><td>Sigma</td><td>A5602-5mg</td><td>specifieke CXCR4-antagonist</td></tr><tr><td>Maraviroc</td><td>Pfizer</td><td></td><td>antiretroviraal medicijn, CCR5-antagonist, verkrijgbaar voor onderzoek bij Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td></tr><tr><td>h-SDF1a (AF647)</td><td>ALMAC</td><td>CAF-11-B-01</td><td>fluorescent gelabeld CXCL12, CXCL12AF647</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), calcium, magnesium, geen fenolrood</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14065-049</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat cellen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagens reservoir PP</td><td>Sigma</td><td>BR703411</td><td></td></tr><tr><td>Rapid flow filter: 0.2 &micro;m aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin microtiterplaat, 96-well, U bodem, helder</td><td>Thermo Scientific</td><td>611U96</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuurflacon (T75)</td><td>Corning</td><td>353024</td><td></td></tr></tbody></table>

een stroom cytometry gebaseerde assay te identificeren van verbindingen die binding van fluorescently-geëtiketteerden cxc chemokine ligand 12 aan cxc chemokine receptor 4 verstoren

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Farmacologische richten van G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) is van groot belang voor de gezondheid van de mens, zoals disfunctionele GPCR-bemiddelde signalering draagt bij aan de progressie van veel ziekten. Het ligand/receptor paar CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) heeft belangrijke klinische belang, bijvoorbeeld als een potentieel doelwit voor de behandeling van kanker en ontstekingsziekten. Kleine moleculen, alsmede therapeutische antilichamen die specifiek gericht CXCR4 en remmen van de receptor functie worden daarom beschouwd als waardevolle farmacologische hulpmiddelen. Hier, wordt een stroom cytometry gebaseerde cellulaire assay waarmee identificatie van verbindingen (bijvoorbeeld kleine moleculen) die CXCL12 binding aan CXCR4 trekt, beschreven. De bepaling is in wezen afhankelijk van de competitie voor receptor bindend tussen een vast bedrag van fluorescently geëtiketteerde CXCL12, de natuurlijke chemokine agonist voor CXCR4 en labelloze verbindingen. Vandaar, is het ongewenst gebruik van radioactief gelabelde sondes vermeden in deze test. Bovendien, worden levende cellen gebruikt als de bron van receptor (CXCR4) in plaats van de voorbereidingen van de celmembraan. Hierdoor is eenvoudig aan te passen van de bepaling naar het formaat van een plaat, dat de doorvoer verhoogt. Deze test is gebleken te zijn een waardevolle generiek geneesmiddel ontdekking assay CXCR4-targeting verbindingen te identificeren. Het protocol kan waarschijnlijk worden aangepast aan andere GPCRs, ten minste als fluorescently geëtiketteerde liganden beschikbaar zijn of kunnen worden gegenereerd. Voorafgaande kennis over de intracellulaire signaalroutes die zijn geïnduceerd na activatie van deze GPCRs, is niet vereist.

De algemene workflow van de bindende bepaling is in figuur 1Agepresenteerd. Een illustratie van het soort stroom cytometry gegevens verkregen voor verschillende monster typen in een standaard experiment (dat wil zeggen, negatieve controle, positieve controle en experimentele monster) is afgebeeld in figuur 1B, en een mogelijke plaat lay-out om uit te voeren de bepaling in een 96-wells-plaat-indeling wordt gegeven in <str...

Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Het algemene doel van de cel-gebaseerde Assay is het identificeren van moleculen die zich binden aan een G-proteïnegekoppelde receptor. Gebaseerd op hun vermogen om te concurreren met een fluorescerend-gelabelde ligand voor binding aan de receptor. Competitieve bindingstest kan de ontdekking van G-proteïnegekoppelde receptorgeneesmiddelen ondersteunen.Zoals we zullen demonstreren met dit protocol voor de chemokine receptor, CXC4. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat levende cellen worden gebruikt om receptieve binding te analyseren in plaats van geheugenvoorbereidingen. En dat het gebruik van radioactiviteitslabel-sondes wordt vermeden.Hoewel deze methode aanvankelijk is opgezet om binding aan de chemokine receptor CXCR4 te bestuderen, kan deze ook worden ontwikkeld voor andere GPCR waarvoor fluorescerend-gelabelde liganden bestaan. Om te beginnen, doseert u 100 microliter oplossing van de verbinding in een heldere 96-wels platte bodem plaat, volgens een vooraf gedefinieerde experimentele lay-out. Voeg 50 microliter celsuspensie uit een reagent reservoir toe aan de 96-wels plaat met behulp van een multi-kanaals pipet.Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij kamertem

a-flow-cytometry-based-assay-to-identify-compounds-that-disrupt

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

In this video, we describe a flow cytometry-based competitive binding assay to detect the interactions between the CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) and its fluorescently-labeled natural ligand CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in the presence of a CXCR4-targeting small molecule. Incubating CXCR4-expressing cells with lower small molecule concentrations allows CXCR4-CXCL12 binding to some extent, which progressively declines upon a gradual increase in small molecule concentrations.

Competitive Binding Assay to Identify Compounds Disrupting Receptor-Ligand Interactions

This video illustrates a cellular assay involving glioblastoma cells expressing CXCR4 chemokine receptors. The assay employs a calcium-sensitive dye to measure fluorescence changes upon agent interaction, offering insights into cellular signaling dynamics.

A Cellular Assay for the Identification of CXCR4-Interacting Agents

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.

Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.

Een op flowcytometrie gebaseerde high-throughput techniek voor het screenen van integrineremmende geneesmiddelen

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Leer een flowcytometrie-gebaseerde bindingassay om verbindingen te identificeren die CXCL12-binding aan CXCR4 verstoren. Deze methode gebruikt levende cellen zonder radioactiviteit voor nauwkeurige G-eiwitgekoppelde receptoronderzoek.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren (Video) | JoVE Journal

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Meer video's verkennen