Formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen maatregel chromatine toegankelijkheid in zoogdiercellen

Het algemene doel van dit experiment is om de chromatine-toegankelijkheid van een genetisch locus te bepalen door de DNA covalent te crosslinken met de geassocieerde eiwitten, gevolgd door zuivering en kwantificering van het vrije DNA. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het chromatine-veld te beantwoorden, omdat de toegankelijkheid van DNA kan worden bepaald, ongeacht het celtype in onbehandelde cellen en ook in cellen die chromatine-remodellering ondergaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen gebruik maakt van enzymen om het DNA te spalten of antilichamen die voor elke experimentele setting getitreerd moeten worden.

Dit protocol heeft het extra voordeel dat het geen speciale apparatuur nodig heeft anders dan een Sonicator. De procedure wordt gedemonstreerd door Olesja Ritter en Tabea Riedlinger, die promovendi zijn uit mijn laboratorium. Om het protocol te beginnen, voegt u formaldehyde direct toe aan het groeimedium van cellen die een dag eerder zijn gezaaid, om een ​​eindconcentratie van 1%volume per volume te bereiken.

Incubeer het medium gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en draai de platen elke twee minuten handmatig. Voeg vervolgens glycine toe tot een eindconcentratie van 0,125 molair om het formaldehyde te blussen. Incubeer de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en draai deze elke twee minuten.

Aspireer het medium en voeg vervolgens voorzichtig ijs-koud PBS toe aan de zijkant van de schaal om de cellen te wassen. Aspireer het medium en herhaal de wassing voorzichtig twee keer. Na de derde wassing, resuspendeer de cellen in één milliliter ijs-koud PBS en gebruik indien nodig een celschraper om de cellen los te maken.

Breng ze over naar een 1,5 milliliter reactiebuis op ijs. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300g en vier graden Celsius in een gekoelde tafelcentrifuge. Aspireer voorzichtig en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer het cellenpellet in één milliliter FAIRE-lysebuffer door voorzichtig meerdere keren op en neer te pipetten. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten op ijs. Na incubatie, soniceer het cross-linked DNA om het te splitsen in een gemiddelde grootte van 200 tot 300 basenparen en koel de monsters tijdens sonicatie om verhitting van het monster te voorkomen.

De fragmentatie van DNA is cruciaal voor dit experiment, aangezien de grootte van de fragmenten de gevoeligheid van de oplossing van de hele techniek beïnvloedt, dus het is belangrijk om de sonicatiecondities zorgvuldig van tevoren vast te stellen en om de grootte van de chromatinefragmenten in elke afzonderlijke proef te controleren. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten en 13.000g bij vier graden Celsius. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe reactiebuis.

Splits de monsters in 100 microliter aliquots. Gebruik een 100 microliter aliquot om de crosslink om te keren en als referentie voor het totale DNA te gebruiken. Voeg 10 microliter RNase A toe en incubeer het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 10 microliter proteïnase K toe. Gebruik een programmeerbare thermoblok om het monster gedurende vier uur bij 37 graden Celsius en vervolgens gedurende zes uur bij 65 graden Celsius te incuberen om de eiwitten te spalten en de crosslinks om te keren. Haal een nieuwe 100 microliter aliquot, voeg 10 microliter RNase A toe en incubeer het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie, ga parallel door met het niet-ontkruiste monster en het ontkruiste monster van de vorige sectie.

Voeg H2O toe om een ​​eindvolume van 300 microliter te bereiken. Voeg vervolgens 300 microliter fenol chloroform isoamyalcohol toe in een afzuigkap en vortex krachtig. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 13.000g en vier graden Celsius.

Breng vervolgens voorzichtig 280 microliter van de bovenste waterige fase over naar een nieuwe reactiebuis. Zorg ervoor dat u geen puin van de interfase neemt, die ook eiwitten bevat, en gooi de resterende onderste fase weg als organisch oplosmiddelafval. Herhaal de behandeling en breng voorzichtig 270 microliter van de bovenste waterige fase over naar een nieuwe reactiebuis.

Voeg 270 microliter chloroform toe in een afzuigkap en vortex krachtig. Centrifugeer het monster. Na centrifugatie, breng voorzichtig 250 microliter van de bovenste waterige fase over naar een nieuwe reactiebuis, zorg ervoor dat u geen puin van de interfase meeneemt.

Gooi de resterende steekproef weg als organisch oplosmiddelafval. Voeg vervolgens 25 microliter vijf molair natriumchloride, 250 microliter isopropanol en vijf microliter glycogeen toe als DNA-drager. Draai de buisjes om en incubeer ze bij kamertemperatuur.

Na incubatie, centrifugeer het monster om het DNA te laten bezinken. Was vervolgens het DNA-pellet met 400 microliter 70%volume per volume ethanol en centrifugeer het monster. Aspireer voorzichtig het supernatant en laat het pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur drogen.

HeLA-cellen werden gedurende één uur gestimuleerd met TNF en geanalyseerd door FAIRE. De verhouding tussen vrij versus totaal DNA werd bepaald voor de promotor van ACTB, het gen dat codeert voor beta-actine en de positieve controle, een heterochromatinegebied op chromosoom 12, de negatieve controle, en de IL8-Promotor. Een met ethidiumbromide gekleurde gel met verschillende sonicatietijden werd gegenereerd en geeft aan dat de optimale chromatinegrootte van 200 tot 300 basenparen werd verkregen na 20 minuten sonicatie.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee dagen worden uitgevoerd. Door deze procedure te volgen, kunnen andere methoden zoals deep sequencing worden uitgevoerd om de chromatine-toegankelijkheid op genoombreed niveau te bepalen. Vergeet niet dat het werken met formaldehyde en fenol chloroform extreem gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals werken in een afzuigkap, het dragen van handschoenen en het juiste weggooien van het afval moeten worden gegarandeerd door deze procedure uit te voeren.