Name: Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer Promotor Capture Hi-C om genregulerende elementen aan hun doelgenen te koppelen via lange-afstands chromosomale interacties. Deze methode onthult driedimensionale genoomarchitectuur en helpt bij het verbinden van niet-coderende ziektevarianten met therapeutische inzichten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Valeriya Malysheva voor kritische lezing van het manuscript en deskundige hulp met cijfer 1. Dit werk werd gesteund door de Medical Research Council, UK (heer/L007150/1) en de UK biotechnologie en biologische Sciences Research Council, UK (BB/J004480/1).

Auteurs hebben niets te onthullen.

Modulair ontwerp voor promotor vangen Hi-C
Promotor vangen Hi-C is ontworpen om specifiek verrijken Hi-C bibliotheken voor interacties voor initiatiefnemers. Deze interacties vormen slechts een subset van afbinding producten aanwezig in de bibliotheek van een Hi-C.
Capture Hi-C kan eenvoudig worden aangepast om te verrijken van Hi-C bibliotheken voor genomic regio of regio's van belang door het veranderen van het systeem vastleggen. Capture regio's kunnen continu genomic segmenten44,45,46,48, versterkers die zijn omschreven in de PCHi-C ('Reverse vangen Hi-C'35) of DNase I overgevoelig sites49 . De omvang van de opname-systeem kan worden aangepast afhankelijk van de experimentele reikwijdte. Bijvoorbeeld Dryden et al. target 519 aas fragmenten in drie gene woestijnen borst kanker44is gekoppeld. Het systeem vastleggen door Martin et al. richt zich op zowel continu genomic segmenten ('Regio Capture': 211 genomic regio's in totaal, 2,131 beperkingsfragmenten) en initiatiefnemers (3,857 gene initiatiefnemers)45geselecteerd.
SureSelect-bibliotheken zijn beschikbaar in verschillende grootte varieert: 1 kb tot 499 kb (5.190 – 4,806), 500 kb tot 2,9 Mb (5.190 – 4,816), en 3 Mb tot 5,9 Mb (5.190 – 4,831). Zoals elke afzonderlijke opname Biotine-RNA 120 nucleotiden lang is, deze vangen systemen geschikt voor maximaal 4,158, 24,166 en 49,166 individuele vangen sondes, respectievelijk. Dit komt overeen met 2,079, 12,083 en 24,583 gerichte beperkingsfragmenten, respectievelijk (merk op dat de aantallen voor beperkingsfragmenten ondergrenzen gebaseerd op de veronderstelling dat de twee afzonderlijke opname sondes kunnen worden ontworpen voor iedere restrictie fragment — in werkelijkheid als gevolg van repetitieve sequenties zal dit niet gebeuren voor iedere restrictie fragment (Zie ook figuur 1B, C), wat resulteert in een hoger aantal targetable beperkingsfragmenten voor een constant aantal beschikbare vangst sondes ).
Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het gebruik van een restrictie-enzym met een 6 bp erkenning site om te ontdekken van lange-afstands interacties. Met behulp van een restrictie-enzym met een 4 bp erkenning site voor grotere resolutie van meer proximale interacties is ook mogelijk40,49.
Beperkingen van PCHi-C
Een inherente beperking van alle chromosoom conformatie vangen tests is dat hun resolutie wordt bepaald door de restrictie-enzym gebruikt voor de generatie van de bibliotheek. Interacties die tussen DNA-elementen gelegen op de dezelfde beperking fragment plaatsvinden zijn onzichtbaar voor 'C-type' testen. Verder, in PCHi-C, in sommige gevallen meer dan één transcriptie start website kan zich bevinden op de dezelfde promotor-bevattende beperking fragment en PIRs in sommige gevallen haven zowel actieve en repressieve Histon merken, waardoor het moeilijk te lokaliseren die regelgevende elementen bemiddelen de interacties, en om te voorspellen de regelgevende output van interacties van de promotor. Met behulp van restrictie-enzymen met 4 bp erkenning sites vermindert dit probleem maar gaat ten koste van enorm toegenomen Hi-C bibliotheek complexiteit (Hi-C bibliotheken die zijn gegenereerd met 4 bp erkenning site restrictie-enzymen zijn ten minste 100 keer complexer dan Hi-C bibliotheken die zijn gegenereerd met 6 bp erkenning site restrictie-enzymen), en de bijkomende kosten voor het volgende generatie rangschikken.
Een andere beperking is dat het huidige PCHi-C-protocol vereist dat miljoenen cellen als grondstof, uitschakeling van de analyse van de promotor interacties in zeldzame celtypes. Een gemodificeerde versie van PCHi-C om de ondervraging van promotor contacten in cel populaties met 10.000 tot 100.000 cellen (bijvoorbeeld cellen tijdens de vroege embryonale ontwikkeling of hematopoietische stamcellen) zou dus een waardevolle toevoeging aan het vangen Hi-C de werkset.
Ten slotte, zoals alle methoden die afhankelijk zijn van formaldehyde fixatie, PCHi-C registreert alleen interacties die 'bevroren worden' op het tijdstip van fixatie. Dus, om te studeren de kinetiek en de dynamiek van de promotor interacties, methoden zoals Super resolutie levende cel microscopie nodig zijn naast PCHi-C.
Methoden om te ontleden ruimtelijke chromosoom organisatie met hoge resolutie
De enorme complexiteit van chromosomale interactie bibliotheken verbiedt een betrouwbare identificatie van producten van de interactie tussen twee specifieke beperkingsfragmenten met statistische significantie. Om dit probleem te omzeilen, is volgorde vastleggen gebruikt of Hi-C33,34,40,44 of 3 C50,51 bibliotheken voor specifieke interacties te verrijken. Het grote voordeel van het gebruik van Hi-C bibliotheken meer dan 3C bibliotheken voor de verrijking stap is dat de Hi-C, in tegenstelling tot de 3C, een verrijking stap voor echte afbinding producten bevat. Als gevolg daarvan, is het percentage van geldige luidt in PCHi-C bibliotheken ongeveer 10-fold hoger dan in Capture-C bibliotheken50, die ongeveer 5-8% geldig na HiCUP filteren leest. Sahlen et al. hebben rechtstreeks Capture-C tot HiCap, die net als PCHi-C Hi-C bibliotheken gebruikt voor verrijking van de opname, in tegenstelling tot de Capture-C die gebruik maakt van 3 C bibliotheken vergeleken. In overeenstemming met onze bevindingen, vonden ze dat Capture-C bibliotheken zijn voornamelijk samengesteld uit un-ligaturen fragmenten40. Bovendien had HiCap bibliotheken een hogere complexiteit dan Capture-C bibliotheken40.
Een variant op Capture-C, genaamd volgende-generatie Capture-C52 NG Capture-C maakt gebruik van een oligo per beperking fragment einde, als eerder gevestigd in PCHi-C33,34, in plaats van overlappende sondes gebruikt in de oorspronkelijke In Capture-C protocol50. Dit verhoogt het percentage van geldige luidt in vergelijking met Capture-C bescheiden, maar NG Capture-C maakt gebruik van twee opeenvolgende rondes van capture verrijking, en een relatief hoog aantal PCR cycli (20 tot en met 24 cycli in totaal, vergeleken met 11 cycli meestal voor PCHi-C), die leidt onvermijdelijk tot hogere aantallen reeks duplicaten en lagere complexiteit van de bibliotheek. In proef experimenten tijdens de optimalisatie van PCHi-C, vonden we dat het percentage van de unieke (dat wil zeggen, niet gedupliceerd) paren was slechts ongeveer 15 leest % toen gebruikten we 19 cycli van PCR (13 cycli vooraf vastleggen + 6 cycli post vangen; gegevens niet worden weergegeven), maar optimalisatie voor een lager aantal cycli van PCR, levert meestal 75-90% unieke Lees paren. Dus, het verminderen van het aantal cycli van PCR aanzienlijk verhoogt de hoeveelheid informatieve sequencedata.
Een recente methode combineert ChIP met Hi-C te richten op chromosomale interacties gemedieerd door een specifieke proteïne van belang (HiChIP53). In vergelijking met ChIA-PET54, die is gebaseerd op een soortgelijke reden, bevat HiChIP gegevens een hoger aantal informatieve volgorde leest, zodat voor hogere-vertrouwen interactie aanroepen van53. Het zal zeer interessant zijn om te vergelijken direct de bijbehorende HiChIP en vangen Hi-C datasets zodra ze beschikbaar komen (bijvoorbeeld met behulp van een antilichaam tegen de cohesin eenheid Smc1a HiChIP53 met Capture Hi-C voor alle Smc1a gebonden beperking fragmenten) naast elkaar. Een inherente verschil tussen deze twee benaderingen is dat vangen Hi-C niet afhankelijk is van de chromatine immunoprecipitation, en daarom kunnen ondervragen chromosomale interacties ongeacht eiwit bezetting. Hierdoor vergelijking van 3D genoom organisatie in de aan- of afwezigheid van specifieke factor bindende, als is gebruikt voor het identificeren van PRC1 als een zeer belangrijke regelgever van muis ESC ruimtelijke genoom het platform7.
PCHi-C en GWAS
Genoom-brede vereniging studies (GWAS) is gebleken dat meer dan 95% van ziekte-geassocieerde varianten van de reeks in niet-codeert gebieden van het genoom, vaak op grote afstanden naar eiwit-codeert genen55bevinden. GWAS varianten zijn vaak gevonden in nabijheid van DNase ik overgevoelig sites, dat is een kenmerk van sequenties met potentiële regelgeving. PCHi-C en vangen Hi-C hebben is gebruikt uitgebreid initiatiefnemers koppelen aan GWAS risico loci betrokken bij borst kanker44, colorectal kanker48en auto-immune ziekte35,45,46. Een PCHi-C studie over 17 verschillende menselijke hematopoietische cel typen gevonden SNPs geassocieerd met auto-immune ziekte werden verrijkt in de PIRs in lymfoïde cellen, overwegende dat varianten van de reeks die is gekoppeld aan de bloedplaatjes en rode bloedcellen specifieke kenmerken werden voornamelijk gevonden in de macrofagen en erytroblasten, respectievelijk35,56. Dus, specifieke promotor weefseltype interactomes aan het licht gebracht door PCHi-C kan helpen om de functie van niet-coderende ziekte-geassocieerde begrijpen volgnummer varianten en identificeren van nieuwe potentiële ziekte genen voor therapeutische interventie.
Kenmerken van regio's promotor-interactie
Meerdere lijnen van bewijsmateriaal link promotor interactomes naar gen expressie controle. Ten eerste, verschillende PCHi-C studies hebben aangetoond dat genomische regio's interactie met initiatiefnemers van (zeer) uitgedrukte genen zijn verrijkt met merken die zijn gekoppeld aan enhancer activiteit, zoals het H3K27 acetylation en p300 bindende33,34 , 37. Wij vonden een positieve correlatie tussen gen expressie niveau en het aantal interacterende enhancers, suggereren dat additieve effecten van versterkers resulteren in verhoogde genexpressie niveaus34,35. Ten tweede, natuurlijke expressie kwantitatieve trait loci (eQTLs) zijn verrijkt met PIRs die zijn aangesloten op de dezelfde genen waarvan de expressie wordt beïnvloed door de eQTLs35. Ten derde, door reis57 en PCHi-C gegevens te integreren, Cairns et al. vond dat reis reporter genen toewijzen aan PIRs in muis SER's sterker verslaggever genexpressie dan reporter genen op integratie sites in niet-promotor-interactie regio's weergeven 58, die aangeeft dat de PIRs transcriptionele regelgevende activiteit bezitten. Deze bevindingen stellen samen voor promotor interactomes ontdekt door PCHi-C in verschillende muis en soorten menselijke cellen bevatten belangrijke regelgevende modules voor gen expressie controle.
Het is vermeldenswaard dat versterkers vertegenwoordigen slechts een klein deel (~ 20%) van alle PIRs ontdekt door PCHi-C33,34. Andere PIRs kon hebben structurele of topologische rollen in plaats van directe transcriptionele regelgevende taken. Echter, er is ook bewijs dat PCHi-C DNA-elementen met regelgevende functie die niet klassieke enhancer merken haven doen kan ontdekken. In een menselijke lymfoïde cellijn, werd de promotor van de BRD7 gevonden om te communiceren met een regio verstoken enhancer merken dat bleek te bezitten enhancer activiteit in reporter gene assays33. Regelgevende elementen met vergelijkbare kenmerken kunnen meer overvloedig dan op dit moment gewaardeerd worden. Bijvoorbeeld markeert een CRISPR gebaseerde scherm voor regelgevende DNA elementen geïdentificeerde ongemarkeerd regelgevende elementen (maatregelen) die controle van genexpressie maar zijn verstoken van enhancer59.
In andere gevallen PIRs gebleken haven chromatine merken transcriptionele repressie is gekoppeld. PIRs en interactie initiatiefnemers gebonden door PRC1 in muis SER's waren betrokken bij een uitgebreid ruimtelijke netwerk van onderdrukte genen, rekening houdend met dat de repressieve mark H3K27me37. In menselijke lymphoblastoid cellen, een verre element interactie met de projectontwikkelaar BCL6 onderdrukt transgenic verslaggever gen expressie33, suggereren dat het functioneren kan om te onderdrukken BCL6 transcriptie in zijn oorspronkelijke context.
PIRs verrijkt voor de bezetting van de chromatine isolator proteïne CTCF in menselijke SER's en NEC37 kan nog een andere klasse van PIRs vertegenwoordigen. Collectief, suggereren deze resultaten dat PIRs haven een collectie van regelgevende activiteiten in gen nog moet functioneel worden gekenmerkt.

Vergaren van bewijs suggereert dat de driedimensionale organisatie van het genoom een belangrijke functionele rol in een bereik van nucleaire processen speelt, waaronder gene activering1,2,3, repressie4 ,5,,6,,7,8, recombinatie9,10, DNA reparatie11, DNA replicatie12,13, en cellulaire senescentie14. De versterkers van de verre zijn te vinden in de ruimtelijke nabijheid aan de initiatiefnemers dat zij regelen15,16,17, die is essentieel voor goede spatio-temporele gen expressie controle. Versterker verwijderingen Toon dat de versterkers van de distale essentieel voor doel gene transcriptie18,19,20,21,22, en 'gedwongen chromatine looping zijn' toont aan dat gemanipuleerde tethering tussen een versterker en haar doel promotor in de Hbb locus is voldoende om te rijden transcriptionele activering23. Verder, genoom herschikkingen die genen te onder de controle van ectopische versterkers brengen kunnen leiden tot ongepaste gene activering en ziekte24,25,26. Samen, illustreren deze voorbeelden dat de promotor-enhancer interacties essentieel voor gene controle zijn en strakke regelgeving om passende genexpressie vereisen. De mens en muis genomen zijn elk geschat op haven rond één miljoen versterkers. Voor de overgrote meerderheid van deze versterkers, doelgenen zijn onbekend, en de "rules of engagement" tussen initiatiefnemers en versterkers zijn slecht begrepen. De versterkers van de transcriptionele toewijzen aan hun doelgenen blijft dus een grote uitdaging in het ontcijferen van bij zoogdiercellen expressie controle.
Ons begrip van drie-dimensionale genoom het platform heeft een revolutie teweeggebracht door de invoering van 3C27 (chromosoom conformatie vangen) en haar varianten28,29,30,31 . De meest machtige van deze technieken, Hi-C (hoge doorvoer chromosoom conformatie vangen) is ontworpen om te identificeren van het hele ensemble van chromosomale interacties binnen een celpopulatie. Hi-C bibliotheken, meestal gegenereerd op basis van miljoenen cellen, zijn zeer complex met een geschatte 1011 onafhankelijke afbinding producten tussen ~ 4 kb fragmenten in het menselijk genoom32. Als een gevolg, betrouwbare en reproduceerbare identificatie van interacties tussen individuele beperking (zoals die met een promotor of versterker fragmenten) van is Hi-C gegevens niet haalbaar, tenzij Hi-C bibliotheken zijn onderworpen aan de ultra-diep sequencing, die is niet een economisch levensvatbare oplossing voor laboratoria routinematig voorbereiding van Hi-C bibliotheken. Om te omzeilen deze tekortkoming, ontwikkelden we promotor vangen Hi-C om specifiek verrijken promotor-bevattende afbinding producten van Hi-C bibliotheken. We gericht op de initiatiefnemers om twee redenen. Eerst, promotor-enhancer contacten is gebleken dat cruciaal is voor goede gen expressie niveaus in tal van studies (Zie de verwijzingen hierboven), en anderzijds als initiatiefnemers grotendeels invariant tussen celtypes zijn, hetzelfde vangen aas systeem kan worden gebruikt om te ondervragen de regelgevende circuits op meerdere celtypen en voorwaarden. Onze aanpak is gebaseerd op-oplossing kruising van Hi-C bibliotheken met tienduizenden biotinyleerd RNA 120mers complementair aan promotor-bevattende Hi-C afbinding producten en latere vangen op daar beklede magnetische kralen. Dit resulteert in PCHi-C bibliotheken met verminderd veel complexiteit in vergelijking met de originele Hi-C-bibliotheek, alleen op de identificatie van fragmenten die aan initiatiefnemers bij aanzienlijk hoge frequenties als ligatuur zijn verbonden.
We hebben gebruikt PCHi-C in een aantal menselijke en muis celtypes om bij te dragen tot een beter begrip van gen expressie controle door blootleggen lange-afstands distale promotor interagerende regio's met vermeende regulerende functie, evenals niet-random promotor-promotor contacten in de driedimensionale ruimte van de kern. De studies van honderdduizenden promotor-enhancer contactpersonen hebt toegewezen over talrijke cel typen33,34,35,,36,,37,38, 39, ruimtelijke genoom Polycomb repressieve complexe-gemedieerde organisatie van muis embryonale stamcellen7geïdentificeerd, aangetoond grootschalige herbedradingsproces van promotor interactomes tijdens celdifferentiatie37, 38 , 39en gekoppelde niet-coderende ziekte-geassocieerde volgnummer varianten aan gene initiatiefnemers35.
PCHi-C is een ideaal methode om de kaart van het genoom-brede ensemble van DNA-sequenties interactie met initiatiefnemers. De methode van keuze te verkrijgen met een hoge resolutie interactie profielen voor geselecteerde regio genomic's zijn verwante benaderingen, zoals Capture Hi-C van continue genomic regio's (Zie discussie). PCHi- en Hi-C vangen zijn zeer vergelijkbaar vanuit een experimentele oogpunt (het enige verschil is de keuze van de opname systeem), zodat de adviezen en richtsnoeren die wij leveren zijn van toepassing op beide benaderingen. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van PCHi-C. Wij schetsen de grondgedachte en het ontwerp van een PCHi-C-experiment, bieden een stapsgewijze PCHi-C bibliotheek generatie protocol en illustreren hoe de kwaliteit van de PCHi-C-bibliotheken op verschillende stappen in het protocol bij het opleveren van hoogwaardige gegevens kan worden gecontroleerd.

<table><tbody><tr><td>16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Low-retention filter tips&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 en S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Molecular biology grade water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) SDS&nbsp;&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>20% (vol/vol) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Life Technologies</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase reaction buffer&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, 1 U/&mu;L&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR grade&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000&times;g 50 ml centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Phenol pH 8.0&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate pH 5.2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Voor sonicatie</td></tr><tr><td>SPRI beads (Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo minus 5000 units/mL&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>Quick ligation reaction buffer&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA Quick ligase&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>PE adapter 1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE adapter 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB Phusion PCR kit&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR strips&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 en 401425</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect custom 3-5.9 Mb library&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>aangepaste ontwerp muis of menselijke PCHi-C systeem</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220&nbsp; high-performance focused ultra-sonicator</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

promotor capture hi-c: high-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

De driedimensionale organisatie van het genoom is gekoppeld aan de functie. Bijvoorbeeld, controle regelgevende elementen zoals de versterkers van de transcriptionele de spatio-temporele uitdrukking van hun doelgenen door middel van fysiek contact, vaak aanzienlijke (in sommige gevallen honderden van kilobases) genomic afstanden te overbruggen en omzeilen nabijgelegen genen. Het menselijk genoom herbergt een geschatte één miljoen enhancers, waarvan de overgrote meerderheid hebben onbekende gene doelen. Distale regelgevende gebieden toe te wijzen aan hun doelgenen is dus van cruciaal belang te begrijpen gen expressie controle. We ontwikkeld promotor vangen Hi-C (PCHi-C) de genoom-brede detectie van distale promotor-interactie regio's (PIRs), inschakelen voor alle initiatiefnemers in een enkele experiment. In PCHi-C, zijn zeer complexe Hi-C bibliotheken speciaal verrijkt voor promotor sequenties via in-oplossing hybride selectie met duizenden biotinyleerd RNA lokaas complementair aan de uiteinden van alle promotor-bevattende beperkingsfragmenten. Het doel is om vervolgens pull-down promotor sequenties en hun frequente interactie partners zoals smaakversterkers en andere potentiële regelgevende elementen. Na hoge gegevensdoorvoer gekoppeld-einde sequencing, wordt een statistische toets toegepast op elke promotor-afgebonden beperking fragment te identificeren aanzienlijk PIRs op het beperkingsniveau fragment. PCHi-C hebben we gebruikt voor het genereren van een atlas van lange-afstands promotor interacties in tientallen mens en muis celtypes. Deze promotor interactome kaarten hebben bijgedragen tot een beter begrip van bij zoogdiercellen expressie controle door het toewijzen van vermeende regelgevende gebieden aan hun doelgenen en onthullend preferentiële ruimtelijke promotor-promotor interactienetwerken. Deze informatie is ook groot belang aan het begrip van genetische ziekten bij de mens en de identificatie van potentiële ziekte genen, door het koppelen van niet-coderende ziekte-geassocieerde volgorde van varianten in of nabij besturingsprocessen aan hun doelgenen.

Promotor vangen Hi-C is gebruikt om te verrijken muis7,34,36,,39 en menselijke33,35,,37,38 Hi-C bibliotheken voor promotor interacties. Een vergelijkbaar protocol (genaamd HiCap) is beschreven door de Sandberg groep40. Figuur 1A blijkt de schematische workflow voor promotor vangen Hi-C. In het protocol beschreven hier, worden Hi-C bibliotheken gegenereerd met behulp van in-nucleus afbinding41, die in een aanzienlijk lagere aantal valse afbinding producten42 resulteert. Voor PCHi-C, zeer complexe muis of menselijke Hi-C bibliotheken zijn onderworpen aan-oplossing hybridisatie en vangen met 39,021 biotinyleerd RNAs aanvulling op 22,225 muis promotor-bevattende HindIII beperkingsfragmenten of 37,608 biotinyleerd RNAs gericht op 22,076 menselijke promotor-bevattende HindIII beperkingsfragmenten, respectievelijk. Promotor met beperkingsfragmenten kan worden gericht aan een of beide uiteinden door individuele biotinyleerd RNAs (figuur 1B). We vonden dat de opname van beide verbeterde dekking van individuele initiatiefnemers (Figuur 1 c; rauwe volgorde leest) bijna twee-voudige, eindigt zoals verwacht. Dus, wanneer mogelijk (dat wil zeggen, niet-repeterende regio), adviseren wij met biotinyleerd RNAs complementair is aan beide uiteinden van het fragment van een beperking te worden vastgelegd.
Om te beoordelen PCHi-C bibliotheek kwaliteit in een vroeg stadium tijdens de voorbereiding van de bibliotheek, voeren we twee besturingselementen na Afbinding van DNA en reiniging, als eerder beschreven31. De eerste is het gebruik van specifieke primerparen om afbinding producten zoals in 3 C27te versterken. We gebruiken primerparen (tabel 1) te versterken-celtype invariant lange-afstands afbinding producten, zoals tussen het Myc -gen en de bekende smaakversterkers ligt ongeveer 2 Mb weg (figuur 2A) of tussen genen van het Hist1 locus ( gescheiden door 1.5 Mb), en tussen de twee regio's gelegen in directe nabijheid van de lineaire ('korte afstand control').
De tweede kwaliteitscontrole wordt uitgevoerd om te bepalen van de efficiëntie van biotine opneming tijdens Klenow-gemedieerde fill-in van beperking site overhangen met biotine-dATP. Succesvolle Klenow invullen en latere blunt-end afbinding resultaten bij de verdwijning van de oorspronkelijke site van de beperking tussen de DNA-moleculen van een afbinding product, en in het geval van HindIII in de vorming van een nieuwe NheI erkenning site (figuur 2B ). De verhouding van de HindIII op NheI verteerd afbinding product is een directe uitlezing van biotine opneming efficiëntie. Een slechte kwaliteit Hi-C bibliotheek zal het tonen van een hoog niveau van HindIII de spijsvertering, overwegende dat kwalitatief hoogwaardige bibliotheken in de buurt van-volledige NheI vertering van afbinding producten (figuur 2B hebben).
Na Hi-C bibliotheek voorbereiding (dat wil zeggen, nadat biotine-daar pull-down van grootte geselecteerde Hi-C afbinding producten, adapter afbinding en pre vangen PCR), wordt de integriteit en de omvang verdeling van de Hi-C bibliotheek beoordeeld door de Bioanalyzer (figuur 2 C). de hetzelfde besturingselement wordt uitgevoerd aan het einde van PCHi-C bibliotheek voorbereiding (dat wil zeggen, na inname van de kruising van de promotor-bevattende afbinding producten en na opname PCR). Vergelijking van de Hi-C en PCHi-C Bioanalyzer profielen toont aan dat zoals verwacht, Hi-C bibliotheken veel meer geconcentreerd dan de overeenkomstige PCHi-C-bibliotheken zijn, maar de grootteverdeling van de bibliotheken zeer vergelijkbaar is, hetgeen aangeeft dat de vangst stap in PCHi-C geen grootte bias (figuur 2C, D) worden geïntroduceerd.
Na gekoppeld-einde sequencing, de PCHi-C leest zijn toegewezen, kwaliteit gecontroleerd en gefilterd met behulp van de HiCUP pijpleiding43. Kwalitatief hoogwaardige PCHi-C bibliotheken bevatten tussen 70-90% 'geldig paren' (dat wil zeggen, gekoppeld-einde reeks leest tussen twee beperkingsfragmenten die niet zijn naburige op de lineaire genomic kaart; Figuur 3A, B). Met behulp van de in-nucleus afbinding protocol41,42, lezen het percentage trans paren (dat wil zeggen, gekoppeld-einde reeks leest tussen twee beperkingsfragmenten die op verschillende chromosomen bevinden zich) zijn meestal lage, tussen 5 en 25%, als gevolg van het bestaan van chromosoom gebieden, en met vermelding van de bibliotheek van goede kwaliteit. Directe vergelijking van het percentage van 'geldig paren' tussen Hi-C bibliotheken en hun overeenkomstige PCHi-C bibliotheken35, toont aan dat in alle gevallen het percentage van geldige paren is hoger in de bibliotheken van de PCHi-C (figuur 3B). Dit gaat gepaard met een vermindering van het percentage van niet-geldige 'hetzelfde fragment interne' luidt in PCHi-C (Figuur 3 c). Dit is te verwachten, zoals de capture-stap voor promotor-bevattende afbinding producten verrijkt, maar ook voor beperking fragment doeleinden, als gevolg van de positie van de vangst oligos betreffende beperking fragmenten (Zie figuur 1B).
Na HiCUP filteren, bepalen we de efficiëntie van de opname. PCHi-C bibliotheken bevatten drie typen van geldige reeks luidt na HiCUP filteren: 1.) promotor: genoom leest (dat wil zeggen, leest tussen een fragment van de vastgelegde promotor en een niet-promotor HindIII beperking fragment overal in het genoom) 2.) promotor: promotor leest (leest tussen twee gevangen promotor fragmenten) 3.) genoom: genoom leest (achtergrond Hi-C afbinding producten waar geen van de afbinding Productpartners aan een vastgelegde promotor toegewezen). Deze worden verwijderd vóór de stroomafwaartse analyses.
Kwalitatief hoogwaardige PCHi-C bibliotheken moeten vastleggen efficiëntie (som van de categorieën 1 en 2 hierboven) tussen 65-90% (figuur 3D). Een directe vergelijking naar Hi-C bibliotheken toont aan dat PCHi-C resulteert in een ~ 15-fold verrijking voor promotor-bevattende afbinding producten (figuur 3D), in sommige gevallen 17-fold. Dit is dicht bij het hypothetische maximum (19.6-fold) verrijking voor PCHi-C, die afhankelijk van het percentage van het genoom beperkingsfragmenten is gedekt door het systeem vastleggen. Grotere verrijking kan worden bereikt door het ontwerpen van opname systemen gericht op minder beperking fragmenten44,45,46.
Analyse van de promotor interactomes blijkt cel type en lineage-specificiteit33,34,35, met uitgesproken wijzigingen tijdens celdifferentiatie37,38,39 . Figuren 4 en 5 voorbeelden van lineage specificiteit en differentiatie dynamiek op specifieke initiatiefnemers. Bijvoorbeeld, ALAD constitutively wordt uitgedrukt in alle cellen maar haar expressie is upregulated in de erytroblasten47. De promotor ALAD contact op verschillende distale fragmenten in alle hematopoietische cellen en houdt zich bezig met extra interacties specifiek in de erytroblasten (Figuur 4). IL-8 toont geen statistisch significante interacties in de B-cellen, zeer weinig interacties in T-cellen, maar tientallen interacties in cellen van de myeloïde afkomst, met inbegrip van celtype specifieke interacties in monocyten, neutrofielen en megakaryocytes) Figuur 5). Deze voorbeelden laten zien hoe PCHi-C kan worden gebruikt om te ontrafelen celtype specifieke interactomes en promotor-interactie regio's identificeren met regelgevende potentieel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Figuur 1 : Promotor vangen Hi-C grondgedachte en vangen aas ontwerp. (A) schematische workflow van PCHi-C. In-nucleus afbinding Hi-C41,42 (I) wordt gevolgd door-oplossing kruising met biotinyleerd RNA lokaas (II) de beperkingsfragmenten van alle menselijke gericht op (hier afgebeeld) of muis gene initiatiefnemers (III). (B) aas ontwerp voor PCHi-C. Biotinyleerd RNA vangen lokaas (rode gebogen lijnen) zijn ontworpen tegen de uiteinden van de beperkingsfragmenten promotor-bevattende (grijs; opmerking dat de promotor sequenties zelf (rood) alleen door de RNA vangen lokaas zijn gericht, als ze zich op beperking bevinden fragment eindigt). Afbinding producten bestaande uit promotor-bevattende beperkingsfragmenten (grijs) en hun interactie beperkingsfragmenten (geel en groen) zijn geïsoleerd door middel van sequentie-complementariteit hybridisatie tussen aas van RNA en DNA doelstelling, en daaropvolgende biotine-daar pulldown, zoals in A. (C) vergelijking voor PCHi-C vangen efficiëntie voor beperkingsfragmenten promotor-bevattende doelwit van een RNA aas vangen sonde vs twee RNA aas vangen sondes (zie schema in B). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Figuur 2 : PCHi-C pre sequencing kwaliteitscontroles. (A) verliet schematische van ruimtelijke nevenschikking tussen promotor en PIR, resulterend in een Hi-C afbinding product bestaande uit een fragment beperking promotor-bevattende (grijs; promotor sequentie in het rood) en een PIR beperking fragment (geel). Recht, DNA gel elektroforese waarin voorbeelden van Hi-C afbinding producten versterkt met behulp van specifieke primerparen (zoals afgebeeld in schema aan de linkerkant). (B) verliet representatieve voorbeelden van HindIII, NheI en HindIII/NheI beperking digests van Hi-C afbinding producten (PCR producten getoond in A). Rechts, de volgorde van de schematische voorstelling van DNA na Hi-C afbinding na mislukte (boven) of succesvolle (onder) dNTP Klenow fill-in van beperking kruispunten en latere afbinding. (C) vertegenwoordiger Hi-C bibliotheek bioanalyzer Profiel (1/5 verdunning). (D) vertegenwoordiger PCHi-C bibliotheek bioanalyzer Profiel (geen verwatering). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Figuur 3 : PCHi-C na sequencing kwaliteitscontroles. (A) vergelijking van percentage geldige volgorde lezen paren na HiCUP43 verwerking in vs van de PCHi-C Hi-C bibliotheken (gegevens uit Javierre et al., 201635) overeenkomt. (B) vertegenwoordiger HiCUP PCHi-C resultaat tonen geldig Lees paren, en andere volgorde categorieën die worden genegeerd voordat downstream analyses (gegevens uit Javierre et al., 201635). (C) vergelijking van percentage 'dezelfde interne fragment' leest na HiCUP verwerken in versus van de PCHi-C Hi-C bibliotheken (gegevens uit Javierre et al., 201635) overeenkomt. (D) vergelijking van percentage volgorde leest waarbij aas promotor fragmenten (efficiencyeffect vastleggen) in de vs van de PCHi-C Hi-C bibliotheken (gegevens uit Javierre et al., 201635) overeenkomt. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Figuur 4: ALAD PCHi-C profiel in menselijke hematopoietische cellen. Promotor interacties van soorten myeloïde cellen worden weergegeven als blauwe bogen, en promotor interacties van lymfoïde celtypes worden weergegeven als paars bogen. Erytroblast-specifieke interacties worden aangegeven door rode pijlen (gegevens uit Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Figuur 5 : IL8 PCHi-C profiel in menselijke hematopoietische cellen. Promotor interacties van soorten myeloïde cellen worden weergegeven als blauwe bogen, en promotor interacties van lymfoïde celtypes worden weergegeven als paars bogen. Monocyt-specifieke interacties worden aangegeven met groene pijlen, neutrofiele-specifieke interacties worden aangegeven door rode pijlen en een Megakaryocyt-specifieke interactie wordt aangegeven door een bruine pijl (gegevens uit Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">Menselijke</td>
		</tr>
<tr>
<td>Naam</td>
			<td colspan="3">Volgorde</td>
			<td>Chromosoom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Start GRCh38/hg38</td>
			<td>Einde GRCh38/hg38</td>
			<td>Primer combinaties om 3C interacties en biotine opneming te testen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs AHF66 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs AHF64 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC locus</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs MYC +1820 of hs MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs MYC locus</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs MYC locus</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs HIST1 R</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>gebruiken in combinatie met hs HIST1 F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Muis</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Volgorde</td>
			<td>Chromosoom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Start GRCm38/mm10</td>
			<td>Einde GRCm38/mm10</td>
			<td>Primer combinaties om 3C interacties en biotine opneming te testen</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>gebruiken in combinatie met mm Calr2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>gebruiken in combinatie met mm Calr1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>gebruiken in combinatie met Gapdh4 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>gebruiken in combinatie met Gapdh3 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>gebruiken in combinatie met mm Hoxa13</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>gebruiken in combinatie met mm Hoxa7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>gebruiken in combinatie met Hist1h3e of mm Hist1h4i</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>gebruiken in combinatie met mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>gebruiken in combinatie met mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer sequenties voor kwaliteitscontrole van mens en muis Hi-C bibliotheken.

DNA regelgevende elementen, zoals versterkers, kwaliteitsbeheersing genexpressie door fysiek contact met target gene initiatiefnemers, vaak door middel van lange-afstands chromosomale interacties verspreid over grote genomic afstanden. Promotor vangen Hi-C (PCHi-C) identificeert belangrijke interacties tussen initiatiefnemers en distale regio's, waardoor de toewijzing van potentiële regulerende sequenties aan hun doelgenen.

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Aangezien regulatorische elementen zoals transcriptionele enhancers zich op grote genomische afstanden van hun doelgenen kunnen bevinden, die ze reguleren via langeafstandschromosomale interacties, is het doel van Promoter Capture Hi-C om genregulatorische elementen te koppelen aan hun doelgenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genoomstructuur en functie, zoals hoe de driedimensionale architectuur van een genoom de genexpressiecontrole beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de detectie van significante promotorinteracties mogelijk maakt, een enkele restrictie van de oplossing.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie omdat het niet-coderende ziekte-associatieve sequentievarianten in of nabij regulatorische controlesequenties kan koppelen aan hun doelgenen. Begin met minimaal 20 miljoen cellen per experiment. Voor suspensiecellen verzamel en centrifugeer cellen bij 400 keer g en 20 graden Celsius gedurende drie minuten.Verwijder het supernatant en resuspendeer het celpellet in 30,625 milliliter medium met 10%FBS bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 4,375 milliliter 16%methanolvrije paraformaldehyde toe tot een eindconcentratie van 2%Fixeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zacht mengen op een rocker. Kwets de reactie door 5 milliliter vers bereide één molaire ijskoudige glycine toe te voegen.Meng gedurende vijf minuten met zacht wiegen bij kamertemperatuur. Bewaar vervolgens gedurende 15 minuten op ijs met af en toe omkeren. Centrifugeer vervolgens de suspensiecellen bij 760 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en resuspendeer het celpellet in 50 milliliter ijskoud PBS pH 7,4. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 400 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant. Volg de cellyse zoals beschreven in het tekstprotocol en was de celkernen met 1,25x restrictiebuffer 2.Om dit te doen resuspendeer de pellet in één milliliter ijskoud buffer en breng de gesuspendeerde kernen over in een 1,5 milliliterbuisje. Centrifugeer de kernen bij 760 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten voordat u het supernatant verwijdert. Resuspendeer het pellet in 1790 microliter 1,25x restrictiebuffer 2.Deel vervolgens de suspensie in vijf aliquoten, elk met vijf tot tien miljoen celkernen in 358 microliter. Voeg 11 microliter 10%gewicht per volume SDS per aliquot toe en schud gedurende 30 minuten bij 950 omwentelingen per minuut en 37 graden Celsius in een thermomixer. Als er celklonten verschijnen, dissocieer ze door te pipetteren en vermijd het maken van bubbels.Voeg vervolgens 75 microliter 10%Triton X-100 per aliquot toe en schud gedurende 15 minuten bij 950 tpm en 37 graden Celsius in een thermomixer. Voeg 12 microliter 100 eenheden per microliter van HindIII per aliquot toe. Incubeer gedurende een nacht bij 37 graden Celsius terwijl gedurende de tijd geschud wordt bij 950 tpm in een thermomixer.Na de vertering voer kwantitatieve PCR uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 60 microliter biotinyleringsmastermix per aliquot toe en meng. Bewaar de aliquoten gedurende één uur bij 37 graden Celsius terwijl geschud wordt bij 700 tpm gedurende vijf seconden elke 30 seconden.Na één uur plaats de aliquoten op ijs. Voer de Hi-C-bibliotheek uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng tussen 500 nanogram en één microgram van de Hi-C-bibliotheek over in een nieuwe buis en laat het monster drogen op een vacuümconcentrator.Resuspendeer de verdampte Hi-C-bibliotheek door 3,6 microliter moleculair biologie-kwaliteitswater toe te voegen, 2,5 microliter blokker 1, 2,5 microliter blokker 2 en 0,6 microliter aangepaste blokker. Breng het monster over in een put van een nieuwe PCR-buisjesstrip, sluit het af met de PCR-dopstrip en plaats het monster op ijs. Label de put als D voor Hi-C DNA.Bereid de hybridisatiebuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Bewaar de buffer gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius in een thermomixer. Breng de buffer over in een put van een nieuwe PCR-buisjesstrip, sluit het af met de PCR-dopstrip en bewaar het op kamertemperatuur.Label de put als H voor hybridisatiebuffer. Meng in een put van een nieuwe PCR-buisjesstrip vijf microliter 100 nanogram per microliter gebiotinyleerde RNA-sondes, 0,5 microliter SRNase B RNase-remmer en 1,5 microliter moleculair biologie-kwaliteitswater. Sluit de PCR-buisjesstrip af met een PCR-dopstrip en plaats het op ijs.Label de buis als R voor RNA. Zet de PCR-machine op zoals beschreven in het tekstprotocol. Ga zo snel mogelijk te werk tijdens alle procedures terwijl de PCR-machine draait om monsterverdamping te voorkomen.Plaats de D PCR-buisjesstrip in de PCR-machine, sluit het deksel van de PCR-machine en start de PCR-reactie. Wanneer het PCR-programma 65 graden Celsius bereikt, open het deksel van de PCR-machine en plaats de H PCR-buisjesstrip in de PCR-machine. Sluit het deksel van de PCR-machine en incubeer gedurende drie minuten.Open vervolgens het deksel van de PCR-machine, plaats de R PCR-buisjesstrip in de PCR-machine en sluit de PCR-machine. Na twee minuten opent u het deksel van de PCR-machine en alle PCR-buisjesstrips. Breng 13 microliter van put H over in put R en vervolgens het volledige volume van put D in put R. Pipetteer om en om drie keer om de reactie te mengen en sluit de PCR-buisjesstrip.Verwijder de H en D PCR-buisjesstrips en sluit het deksel van de PCR-machine. Bewaar de reactie gedurende 24 uur bij 65 graden Celsius. Voeg 60 microliter streptavidine-gekoppelde magnetische kralen toe aan een nieuwe buis.Plaats de buis op de magnetische scheidingsstandaard gedurende één minuut voordat u het supernatant verwijdert. Resuspendeer de kralen met 200 microliter 1x binding

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

We rapporteren de toepassing van kwantitatieve chromosoomconformatievangst gevolgd door high-throughput sequencing in embryoïndische lichamen gegenereerd uit embryonale stamcellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de contacten tussen putatieve versterkers en promotorgebieden van een bepaald gen te identificeren en te kwantificeren tijdens embryonale stamceldifferentiatie.

Identificatie van enhancer-promotor contacten in embryoïide lichamen door kwantitatieve chromosoomconformatie Capture (4C)

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

We presenteren een coderingsvrije workflow voor biologen om weefselspecifieke genenverbeteraars te identificeren met behulp van alleen browsergebaseerde tools. Ons protocol maakt gebruik van openbare H3K4me1/H3K27ac-histonmarkeringen en Hi-C-gegevens, waardoor onderzoekers zonder programmeerexpertise toegang kunnen krijgen tot potentiële regulerende elementen die verband houden met hun genen van belang, deze kunnen analyseren en identificeren.

Een webgebaseerde workflow voor het selecteren van gen- en weefselspecifieke versterkers

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Leer Promotor Capture Hi-C om genregulerende elementen aan hun doelgenen te koppelen via lange-afstands chromosomale interacties. Deze methode onthult driedimensionale genoomarchitectuur en helpt bij het verbinden van niet-coderende ziektevarianten met therapeutische inzichten.

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

Meer video's verkennen