Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Het algemene doel van dit protocol voor de vorming en beoordeling van biofilm is om de capaciteit van enterische bacteriële pathogenen om een biofilm te vormen te bepalen, vooral onder omstandigheden die de gastro-intestinale transit en blootstelling aan galzouten nabootsen. De methoden kunnen helpen om sleutelvraagstukken in het veld van bacteriële pathogenese te beantwoorden, zoals het vermogen van enterische pathogenen om de zware galzoutenvoorwaarden van het maagdarmkanaal te overleven. Het grote voordeel van de technieken is dat de gecombineerde resultaten van de drie assays een diepgaande karakterisering van de vorming van biofilm in reactie op blootstelling aan galzouten voor elke ziekteverwekker ondersteunen.

We hadden eerst het idee voor de gecombineerde methoden, gezien de noodzaak om de door galzouten geïnduceerde biofilmvorming in Shigella flexneri volledig te kwantificeren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat aspecten van de assay de reproduceerbaarheid kunnen beperken. Dus let goed op de kritische stappen om reproduceerbaarheid te waarborgen.

Het demonstreren van de procedures zal worden gedaan door leden van mijn laboratorium, Kourtney Nicherson, postdoctoraal onderzoeker, en Alejandro Llanos, klinisch onderzoeker. Eerst, label twee 1,5 milliliter buisjes als TSB en TSB plus BS. Voeg vervolgens een milliliter TSB of TSB plus BS toe aan de respectievelijke buisjes. Injecteer vervolgens de buisjes met 20 microliters overnachtcultuur bij een verdunning van één op vijftig.

Voeg vervolgens 130 microliters niet-geïnoculeerd controlemedium toe aan elk van de drie putjes in een steriele, heldere, vlakbodemige, weefselkweekbehandelde, 96-putjesplaat. Dit zal de blanco controle zijn. Voeg 130 microliters geïnoculeerd kweekmedium toe aan elk van de drie putjes.

Na het toevoegen van de controle en het geïnoculeerde kweekmedium in de respectieve putjes, incubeer de 96-putjesplaat gedurende vier tot 24 uur bij 37 graden Celsius, statisch. Zodra de incubatie voorbij is, stel de controlepuit in als blanco op de plate reader. Aspiseer vervolgens het kweekmedium uit elke put.

Was vervolgens de putjes voorzichtig één keer met 200 microliters steriele PBS. Na het wassen, aspiseer de PBS en draai vervolgens de plaat om ongeveer 20 minuten te drogen. Het is erg belangrijk om voorzichtig verwijdering van het medium en voorzichtig wassen te verzekeren om ervoor te zorgen dat de EPS-matrix niet wordt verstoord.

Voeg vervolgens 150 microliters 0,5% kristalviolet toe aan elk van de experimentele en controlepuitjes. Incubeer vervolgens de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na vijf minuten, was de putjes eenmaal met 400 microliters gedestilleerd water.

Voeg 200 microliters gedestilleerd water toe om de putjes vijf keer te wassen. Na alle vijf wasbeurten, draai de plaat om en laat deze volledig drogen, beschermd tegen licht. Om consistente resultaten te verkrijgen, is het belangrijk dat de monsters grondig zijn gedroogd voordat u verder gaat.

Nadat de plaat volledig is gedroogd, gebruik 200 microliters 95%ethanol om de putjes te ontkleurden. Laat vervolgens de plaat gedurende 30 minuten op de shaker bij vier graden Celsius staan om verdamping te voorkomen. Na 30 minuten, neem de OD 540 op op de plate reader.

Voor semi-kwantitatieve detectie van EPS, gebruik een meerkanaals pipette om het kweekmedium over te brengen naar een heldere 96-putjesplaat. Gebruik vervolgens 200 microliters fixeermiddel om de zwarte plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te fixeren. Noteer nu de OD 600-waarde door de controlepuit als blanco in te stellen voor standaardisatie.

Noteer vervolgens de waarde van het kweekmedium terwijl de aangehechte populatie wordt gefixeerd. Zodra het fixeren voltooid is, verwijder het reagens en gooi het in het gevaarlijke afval. Was vervolgens de putjes voorzichtig twee keer met 200 microliters steriele PBS.

Na het wassen, aspiseer de PBS. Voeg vervolgens 150 microliters van 25 microgram per milliliter ConA-FITC toe. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Na de incubatie, was de putjes voorzichtig met 200 microliters PBS. Voeg vervolgens 150 microliters PBS toe aan elke put en noteer de fluorescentie bij 488 nanometer. Na het voorbereiden van verse reagentia, warm de PBS, PBS met glucose, PBS met galzouten, en PBS met glucose en galzouten op tot 27 graden Celsius.

Noteer vervolgens de OD 600-waarden van de overnachtbiofilmplaat op de plate reader door de controlepuit als blanco in te stellen. Aspiseer vervolgens het kweekmedium met behulp van een vacuümlijn, zonder de aangehechte populatie op het kunststofoppervlak te verstoren. Was de putjes voorzichtig twee keer met 200 microliters steriele PBS.

Na het wassen met PBS, voeg 130 microliters van de voorverwarmde PBS, PBS met glucose, PBS met galzouten, en PBS met galzouten en glucose toe aan elk van de drie putjes, en incubeer vervolgens de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder na 30 minuten de plaat uit de incubator. Pipet de supernatant in een verse steriele 96-putjesplaat.

Ten slotte, bereid een tot 10 seriële verdunning van de supernatant met PBS in de 96-putjesplaat, of in een verdunningsblok. Gebruik vervolgens een meerkanaals pipette om vijf microliters van elke verdunning op LB-agarplaten over te brengen. Incubeer de platen gedurende een nacht bij 37 graden Celsius.

De volgende dag, tel het aantal kolonies. De staafgrafiek wordt verkregen om de galzoutenafhankelijke biofilmvorming in enterische pathogenen te kwantificeren. Dit gebeurt door de OD 540-waarden van de individuele stammen in aan- en afwezigheid van galzouten in het medium uit te plotten.

De grafiek toont een significante toename in de biofilmvorming voor de meeste pathogenestammen, behalve Enteroaggrative E.Coli. Vervolgens wordt het EPS dat tijdens de biofilmvorming wordt geproduceerd, gedetecteerd door de hoeveelheid ConA-FITC te bepalen