Name: Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer hoe je biofilmvorming door darmpathogenen analyseert onder galzoutcondities die de gastro-intestinale omgeving simuleren. Dit protocol combineert drie assays voor diepgaande karakterisering van bacteriële overleving en gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Rachael B. Chanin en Alejandro Llanos-Chea voor technische bijstand. Wij danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski en Bobby Cherayil voor de spanningen in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten Grant K22AI104755 (C.S.F.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

1. bereiding van reagentia
<ol><li>Galzouten medium: resuspendeer ter voorbereiding al soja Bouillon (TSB) met 0,4% galzouten (gewicht/volume), 200 mg van galzouten in 50 mL gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Maak wekelijks vers medium. Opmerkingen: De galzouten routinematig gebruikt is een 1:1 mengsel van natrium cholate en natrium deoxycholate van schapen en runderen gallbladders geïsoleerd. Zoals aangetoond eerder4, was de aanwezigheid van glucose nodig voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming. TSB heeft toegevoegd glucose ten opzichte van Luria Bertani (LB) Bouillon; en daarom was voldoende voor het opwekken van biofilm vorming in Shigella en de andere zuurbestendige pathogenen geanalyseerd. Afhankelijk van de bacteriën te analyseren, zou de concentratie van de verschillende glucose of verschillende suiker eisen nodig zijn.</li>
	<li>0,5% w/v kristalviolet in water: los 2,5 g kristalviolet in 500 mL gedistilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC): reconstrueren van de voorraad in 1 x PBS. Verdun de voorraad 10 mg geconcentreerd met 400 μL van 1 x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 25 µg/mL, en beschermen tegen licht.</li>
	<li>PBS + Glucose: Ontbinden 0.2 g glucose in 10 mL 1 x PBS (2% w/v glucose definitief). Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Vers maken op de dag van gebruik.</li>
	<li>PBS + galzouten: Los op 40 mg in 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v galzouten definitief). Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Vers maken op de dag van gebruik.</li>
	<li>PBS + glucose en galzouten: Los 40 mg galzouten en 0.2 g glucose in 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v galzouten en 2% w/v glucose definitief). Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Vers maken op de dag van gebruik.</li>
	<li>Bereiden LB agar platen.</li>
	<li>Formaldehyde/Glutaaraldehyde fix: 810 toevoegen µL formaldehyde (stockoplossing van 37%, 3% eindconcentratie) en 125 µL Glutaaraldehyde (stockoplossing van 25%, de definitieve concentratie van 0,25%) naar 14 mL 1 x PBS. Meng en bewaren bij 4 ° C. De correctie moet koud voor correct gebruik. Let op: De correctie is giftig en gevaarlijk afval vereist.</li>
	<li>Antifade inbedmiddel oplossing: gebruik antifade inbedmiddel oplossing met 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) vlek te remmen photobleaching immunefluorescentie microscopie monsters terwijl fluorescently kleuring van het DNA van de bacterie.</li>
</ol>2. voorbereiding van bacteriën
<ol><li>Groeien overnachting culturen van de bacteriestammen te worden getest door het enten van 3 mL TSB met een enkele, goed geïsoleerde kolonie in een steriele cultuur buis. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 225 t/min voor overnachting incubatie (16-24 uur). Opmerking: Stammen moeten worden restreaked uit diepvries voorraden elke 2 tot 4 weken, en behouden op platen niet meer dan 2 weken oud.</li>
</ol>3. solid-phase naleving Assay
Opmerking: Deze test kwantificeert aanhangend bacteriën met behulp van de methode van een 96-wells-plaat. Bacteriën worden statisch gekweekt in platte bodem platen. Wassen wordt uitgevoerd als u wilt verwijderen niet-aanhanger bacteriën en aanhangend bacteriën zijn gekleurd met crystal violet. De vlek kristalviolet peptidoglycaan bindt in de bacteriële celwand en kan worden solubilized met behulp van ethanol. Het aantal aanhangend bacteriën wordt bepaald op basis van kristalviolet retentie.
<ol><li>Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + galzouten (BS).</li>
	<li>Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.</li>
	<li>Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (op een 1:50 verdunning).</li>
	<li>In een steriele, duidelijk, platbodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat, voeg toe 130 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk mediatype (TSB en TSB + BS) worden getest.</li>
	<li>Toevoegen van 130 µL per putje van geënte cultuur in drie putten, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld in drievoud.</li>
	<li>Incubeer gedurende 4-24 uur bij 37 ° C statisch.</li>
	<li>Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD600. Instellen van de controleputjes als 'leeg'. Bevestig dat het besturingselement medium is duidelijk met geen bewijs van turbiditeit. Als elke troebelheid wordt gedetecteerd, gooi het experiment. De OD-600 -waarden kunnen worden gebruikt om te normaliseren van de gegevens als er aanzienlijke verschillen in groei tussen bacteriestammen.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium met behulp van een vacuüm lijn door zachtjes het kantelen van de plaat en langzaam aspirating het medium aan de onderste rand van de put. Zorg ervoor dat alle het kweekmedium verzamelen zonder het verstoren van de aanhangend bacteriële bevolking gelegen op het plastic oppervlak. Als EPS-matrix werd geproduceerd tijdens de incubatietijd, zal de matrix als een witte neerslag worden gevisualiseerd. De EPS-matrix niet storen.</li>
	<li>Voorzichtig wassen de putjes eenmaal met 200 µL steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn.</li>
	<li>Omkeren van de plaat om te drogen. Toestaan dat een minimum van 20 minuten drogen. Opmerking: Omdat de biofilm moet grondig worden gedroogd alvorens de kleuring, het protocol kunnen onderbroken bij deze stap voor een paar uur of zelfs 's nachts. De toegevoegde droogtijd doet geen afbreuk aan de kleuring procedure terwijl onvolledig drogen zal invloed hebben op de kwantificering van de resultaten en de reproduceerbaarheid.</li>
	<li>Voeg 150 µL van 0,5% kristalviolet aan elk experimentele en controle ook.</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Was de putjes eenmaal met 400 ÂµL van gedistilleerd water. Het toegevoegde volume helpt bij het verwijderen van residuele kristalviolet vlek uit de zijkanten van de putten. Verwijder het wassen met de vacuüm lijn.</li>
	<li>Was de putjes vijfmaal met 200 ÂµL van gedistilleerd water. Verwijder het wassen met de vacuüm lijn. Opmerking: Grondig wassen is belangrijk voor kwantificering. Wanneer de lege putten blijkt uit het gedestilleerd water zijn en geen eventuele resterende kristalviolet vlek bevatten, gaat u verder met de volgende stap.</li>
	<li>Omkeren van de plaat te droog, beschermd tegen licht. Zorgen voor volledige droging van de plaat zoals hierboven vermeld.</li>
	<li>Destain de putjes met 200 µL van 95% ethanol. Incubeer de plaat op het schudapparaat gedurende 30 minuten. Voorkom verdamping, vooral bij hogere temperaturen, waarnemen zulks trede bij 4 ° C.</li>
	<li>Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD540. Opmerking: De golflengte voor maximale extinctie van kristalviolet is in de buurt van 590 nm. De literatuur meldt een bereik van OD540 - OD5954,13,14,15,16 voor kristalviolet absorptie; dus kies een golflengte beschikbaar op basis van de afleesapparaat.</li>
</ol>4. EPS-Matrix detectie
Opmerking: Deze gratis testen kwantificeren en visualiseren van de EPS. In beide, wordt EPS gedetecteerd met behulp van een lectine binden polysacchariden. Het eiwit fluorescently-geconjugeerde kunt kwantificering (stap 4.1) of visualisatie (stap 4.2).
<ol><li>Semi-kwantitatieve detectie van EPS<ol>
<li>Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + BS.</li>
		<li>Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.</li>
		<li>Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (een 1:50 verdunning).</li>
		<li>In een steriele, zwart, platbodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat, voeg toe 130 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk medium type te beproeven. Breng 130 µL per putje van geënte cultuur in de putjes, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld in drievoud.</li>
		<li>Incubeer gedurende 4-24 uur bij 37 ° C statisch.</li>
		<li>Het kweekmedium overbrengen in een duidelijk 96-wells-plaat met een pipet, idealiter een meerkanaalspipet. Wees voorzichtig om te verzamelen van alle het kweekmedium zonder het verstoren van de aanhangend bevolking en/of het EPS gelegen op het plastic oppervlak. Gereserveerd.</li>
		<li>De zwarte plaat gedurende 15 minuten op 200 µL per putje van de formaldehyde/Glutaaraldehyde met 1 x PBS RT vaststellen.</li>
		<li>Terwijl de aanhangend bevolking is vaststelling, evalueren het supernatant fractie uit stap 4.1.6. Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD600. Instellen van de controleputjes als 'leeg'. Bevestig dat het besturingselement medium is duidelijk met geen bewijs van turbiditeit. Als elke troebelheid wordt gedetecteerd, gooi het experiment.<ol>
<li>Als alternatief kan de gehele bepaling worden uitgevoerd in een zwarte duidelijk bodemplaat. In deze omstandigheden de600 OD-waarden kunnen worden opgenomen en het kweekmedium kan vervolgens worden verwijderd voordat u doorgaat naar stap 4.1.7. De OD-waarden voor600 kunnen worden gebruikt voor het normaliseren van de gegevens in het geval er zijn belangrijke verschillen in groei tussen bacteriestammen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwijder de correctie en gooi in het gevaarlijk afval.</li>
		<li>Voorzichtig wassen de putjes tweemaal met 200 µL per putje van steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn door zachtjes het kantelen van de plaat en langzaam aspirating het wassen aan de onderste rand van de put.</li>
		<li>Voeg 150 µL per putje van 25 µg/mL ConA-FITC en incubeer gedurende 15 minuten op RT.</li>
		<li>Voorzichtig wassen tweemaal met 200 µL van PBS.</li>
		<li>Voeg 150 µL van PBS toe aan elk putje. Opnemen van de fluorescentie bij 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocale microscopie Visualisatie van EPS-productie en berekening van biofilm dikte<ol>
<li>Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + BS.</li>
		<li>Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.</li>
		<li>Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (op een 1:50 verdunning).</li>
		<li>Instellen een steriele 24-well-bord met 12 mm ronde glazen coverslips steriel. Voeg toe 400 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk medium type te beproeven.</li>
		<li>Voeg toe 400 µL van geënte cultuur aan putjes in tweevoud, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld.</li>
		<li>Incubeer gedurende 4-24 uur bij 37 ° C statisch.</li>
		<li>Visueel bevestigen groei in de TSB voorwaarde, groei en EPS neerslag in de TSB (wit) + BS voorwaarde, en geen groei en/of witte neerslag in steriele-controleputjes. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Positiebepaling voor 15 min op RT 200 µL per putje van formaldehyde/Glutaaraldehyde oplossing met 1 x PBS.</li>
		<li>Verwijder de correctie en gooi in gevaarlijke afvalstoffen.</li>
		<li>Voorzichtig wassen de putjes tweemaal met 200 µL per putje van steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn.</li>
		<li>Voeg 150 µL per putje van 25 µg/mL ConA-FITC en incubeer gedurende 15 minuten op RT.</li>
		<li>Voorzichtig wassen tweemaal met 200 µL per putje van PBS.</li>
		<li>Monteren met antifade inbedmiddel oplossing met DAPI. Opmerking: De oplossing is een oplossing van de kant en klare, glycerol gebaseerde mount met DAPI voor het behoud van het fluorescerende label terwijl gelijktijdig de kleuring van het DNA in bacteriecellen voor visualisatie als een counterstain. Volg de kit aanwijzingen en aanbevelingen voor incubatie tijden voorafgaand aan imaging van monsters. De DAPI kleuring van de procedure kan worden uitgevoerd alvorens antifade inbedmiddel oplossing die geen DAPI bevat.</li>
		<li>Evalueren door confocale microscopie. Op een confocal microscoop, stelt u de laser op 495 nm/519 nm excitatie/emissie voor FITC visualisatie. Een tweede laser ingesteld op 360 nm/460 nm excitatie/emissie te visualiseren DAPI. Zoek de biofilm door te focussen op de DAPI-kanaal. Zowel de FITC de DAPI kanalen gebruiken om de volledige dikte bepalen en instellen van de bovenste en lager imaging grenzen. Volledige dikte Z-stack beelden registreren door het vastleggen van beelden, wordt elke 0,25 µm zodra planimetrische weergave is ingesteld op de boven- en onderkant van de z-stack. Meer informatie over confocale microscopie, Raadpleeg voor publicaties door Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Het reconstrueren van de 3D-beelden in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) voor het visualiseren van de volledige biofilm vorming en berekenen de biofilm dikte. De gemiddelde dikte verkregen voor S. flexneri gal-zout geïnduceerde biofilms was 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. dispersie Assay
Opmerking: In deze test, de demontage van biofilm door bacteriële dispersie wordt gedetecteerd. Hier zijn volwassen biofilms zijn gevestigd en vervolgens (meestal de volgende dag), de media met PBS worden vervangen of aangevuld PBS. Het supernatant component wordt vervolgens beoordeeld om te kwantificeren van het aantal bacteriën die hebben losgekoppeld van de biofilm.
<ol><li>Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + BS.</li>
	<li>Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.</li>
	<li>Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (op een 1:50 verdunning).</li>
	<li>In een steriele, duidelijk, platbodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat, voeg toe 130 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk mediatype te beproeven.</li>
	<li>130 µL per putje van geënte cultuur toevoegen aan drie putten, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld in drievoud.</li>
	<li>Incubeer de plaat voor 4-24 uur bij 37 ° C statisch.</li>
	<li>Voordat u verdergaat, warm de PBS, PBS + glucose, PBS galzouten, en PBS + galzouten + glucose tot 37 ° C. Deze reagentia vers dagelijks voor te bereiden.</li>
	<li>Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD600. Instellen van de controleputjes als 'leeg'. Bevestig dat het medium is duidelijk met geen bewijs van turbiditeit. Als elke troebelheid wordt gedetecteerd, gooi het experiment. De OD-600 -waarden kunnen worden gebruikt om te normaliseren van de gegevens als er aanzienlijke verschillen in groei tussen bacteriestammen.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium via een vacuüm-lijn. Zorg ervoor dat alle het kweekmedium verzamelen zonder het verstoren van de aanhangend bevolking gelegen op het plastic oppervlak.</li>
	<li>Voorzichtig wassen de putjes tweemaal met 200 µL per putje van steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn.</li>
	<li>Vervang de wash met 130 µL per putje van de volgende handelingen uit in elk drie putten: PBS, PBS + glucose, PBS galzouten, en PBS + galzouten + glucose. Deze reagentia moeten voorverwarmde tot 37 ° C.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de plaat van de 37 ° C incubator. Het supernatant overbrengen in een frisse, steriele 96-wells-plaat.</li>
	<li>Met behulp van een 96-wells-plaat of verdunning-blok, 10-fold bereiden (1:10) seriële verdunningen van het supernatant in steriele PBS. Opmerking: De verdunningsreeks moeten variëren van onverdunde tot 10-6 afhankelijk van de bacteriële stam te beproeven. Proefprojecten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen van de optimale verdunningsreeks.</li>
	<li>5 µL van elke verdunning op LB agar met behulp van een meerkanaalspipet plaat met steunkleuren. Incubeer bij 37 ° C's nachts. Telling kolonies op de volgende dag en de account voor de verdunningsfactor bij het bepalen van de herstel kolonievormende eenheden (kve). Als u wilt berekenen de percentage dispersie ten opzichte van de 1 x PBS-controle (ingesteld op 100%), verdeel het herstel CFU van elke behandeling voorwaarde door de terugwinning CFU uit de 1 x PBS controlemonster. Opmerking: Routine media platen voor de bacteriële stam van belang kunnen ook worden gebruikt. Shigella kan bijvoorbeeld worden verguld op Congo red platen. Zorgen dat de platen zijn droog voor geschikte plek-plating technieken.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Analyse van biofilm vorming is uitdagend vanwege de dynamische aard van biofilms en de variabiliteit tussen de stammen, materialen, laboratoria en testen. Hier zijn verschillende strategieën om te bepalen van biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers na galzouten blootstelling met experimentele inzicht geboden ter bevordering van de reproduceerbaarheid gepresenteerd. Er zijn aanvullende overwegingen om de reproduceerbaarheid. Eerst en vooral, is het raadzaam voor het uitvoeren van ten minste drie onafhankelijke exper...

Biofilm formatie is een belangrijke bacteriële overlevingsstrategie geïnduceerde tijdens Barre milieu omstandigheden. Blootstelling aan bactericide verbindingen zoals antibiotica of veranderingen in voedingsstoffen of zuurstof beschikbaarheid induceert een gespannen staat in bacteriën die kan worden verlicht door vorming van biofilms. Een biofilm wordt gekenmerkt door bacteriële gehechtheid aan een oppervlak of andere bacteriën en wordt begeleid door de afscheiding van een matrix van de EPS-voornamelijk samengesteld uit polysacchariden1,2,3. Biofilm vorming is een dynamisch proces waarin een cascade van gebeurtenissen in de vorming van een volwassen aanhangend bacteriële Gemeenschap1,2,3 culmineert. Bacteriën produceren adhesines om vroege bijlage terwijl shifting adhesine gen expressieprofielen ter versterking van de bijlage tijdens biofilm rijping. EPS-productie komt tegelijkertijd jas de bacteriële Gemeenschap in een matrix te beschermen de cellen van de eerste stressor. Bacteriën die deel uitmaakt van de biofilm zijn traag groeiende; en als zodanig, maakt de meeste antibiotica ondoeltreffend. Bovendien, de trage groei bespaart energie tot omstandigheden veranderen om de gunst van de bacteriële groei1,2,3. Na de barre omstandigheden zijn verstreken, bacteriën verspreiden de biofilm en een planktonische levensstijl1,2,3te hervatten. Traditioneel, biofilms zijn waargenomen op oppervlakken en vertegenwoordigen een persistente klinische uitdaging als gevolg van infectie reservoirs aanwezig op katheters en in-woning apparaten1,2,3.
Biofilm vorming werd onlangs beschreven voor verschillende darmen ziekteverwekkers; bacteriën die de dunne darm of dikke darm4 infecteren. Voor Shigella soorten, infectie treedt op in de menselijke darm na een doorvoer over de meerderheid van het maag-darmkanaal. Tijdens de passage door de dunne darm, is Shigella blootgesteld aan gal; een lipide-vernederende wasmiddel uitgescheiden naar de darm te vergemakkelijken van vertering van lipiden terwijl het tegelijkertijd het doden van de meeste bacteriën5. Darmen ziekteverwekkers hebben een unieke vermogen om te weerstaan aan het bactericide effect van gal6. Onze recente analyse gebruikt in vivo-als combinaties van glucose en galzouten om aan te tonen van robuuste biofilm vorming in S. flexneri en andere soorten Shigella, pathogene Escherichia colien Salmonella4. Eerder, Salmonella enterica serovar Typhi bleek te vormen van een biofilm gal-geïnduceerde als gevolg van de unieke kolonisatie van de galblaas bij chronische infectie7,8,9, 10. Daarnaast voorafgaande onderzoek met Vibrio11en Campylobacter12 biofilm vorming in reactie op Gal aangetoond. Dus, de analyses uitgebreid de gal-geïnduceerde biofilm vorming opmerkingen bij andere ziekteverwekkers en helpen om de demonstratie van een reactie van de geconserveerde darmen pathogen op Gal. In tegenstelling tot chronische biofilms waarin bacteriële gene transcriptie is beperkt en cel senescentie kan het optreden van1,2,3, stellen wij voor dat de darmen, gal-geïnduceerde biofilm meer voorbijgaande aard is. Dit van voorbijgaande aard, virulente biofilm is hallmarked door een snelle demontage (zoals gezien in de dispersie-assay) en verbeterde virulentie genexpressie waargenomen in de biofilm bevolking4,6. 
Zoals biofilm vorming is een veelzijdige, dynamische proces en het gebruik van galzouten zoals een activerende factor alleen al recent beschreven voor meest darmen ziekteverwekkers, zijn tools en technieken gebruikt unieke en creatieve toepassingen van traditionele methoden. Dus, hier gepresenteerd zijn drie gratis strategieën te kwantificeren van enkele belangrijke kenmerken van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming, met inbegrip van bacteriële aanhankelijkheid, productie van de EPS-matrix, en de dispersie van levensvatbare bacteriën uit de biofilm. Deze technieken hebben gebruikt voornamelijk voor onderzoek met Shigella; en daarom, evaluatie van andere zuurbestendige ziekteverwekkers optimalisatie kan vereisen. Echter positieve gegevens uit alle drie tests ondersteunen identificatie van biofilms en reproduceerbare protocollen voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming stellen.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm vorming is een dynamische, meertraps proces dat zich in bacteriën onder strenge milieu-omstandigheden of in tijden van stress voordoet. Voor zuurbestendige ziekteverwekkers, wordt een aanzienlijke stress-respons veroorzaakt gastro-intestinale onderweg en bij gal blootstelling, een normaal onderdeel van menselijke spijsvertering. Om te overwinnen de bactericide effecten van gal, vormen vele darmen ziekteverwekkers een biofilm hypothetische zodat overleven wanneer bij het transitovervoer door de dunne darm. Hier presenteren we methoden om te definiëren van biofilm vorming door naleving van de solid-phase assays evenals extracellulaire polymere stof (EPS) matrix detectie en visualisatie. Bovendien wordt biofilm dispersie beoordeling gepresenteerd waarmee de analyse van gebeurtenissen triggering release van bacteriën tijdens de infectie wordt nagebootst. Kristalviolet kleuring wordt gebruikt voor het detecteren van aanhangend bacteriën in een high-throughput 96-wells-plaat naleving assay. EPS-productie beoordeling wordt bepaald door twee tests, namelijk microscopie kleuring van de EPS-matrix en semi-kwantitatieve analyse met een polysaccharide fluorescently-geconjugeerde bindend lectine. Ten slotte wordt biofilm dispersie gemeten door middel van de graven van de kolonie en beplating. Positieve gegevens uit meerdere tests ondersteunen de karakterisatie van biofilms en kan worden gebruikt om het identificeren van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming in andere bacteriestammen.

In Figuur 1, wordt biofilm vorming veroorzaakt in de meeste van de zes darmen ziekteverwekkers geteste volgende groei in media met galzouten. Een aanzienlijke toename van de aanhangend bacteriën nadat galzouten blootstelling wordt waargenomen in bijna alle stammen getest. De uitzondering is de enteroaggregative E. coli (EGA); nochtans, merken op de geïnduceerde observatie van de Δaaf mutant4. De resultaten w...

Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Het algemene doel van dit protocol voor de vorming en beoordeling van biofilm is om de capaciteit van enterische bacteriële pathogenen om een biofilm te vormen te bepalen, vooral onder omstandigheden die de gastro-intestinale transit en blootstelling aan galzouten nabootsen. De methoden kunnen helpen om sleutelvraagstukken in het veld van bacteriële pathogenese te beantwoorden, zoals het vermogen van enterische pathogenen om de zware galzoutenvoorwaarden van het maagdarmkanaal te overleven. Het grote voordeel van de technieken is dat de gecombineerde resultaten van de drie assays een diepgaande karakterisering van de vorming van biofilm in reactie op blootstelling aan galzouten voor elke ziekteverwekker ondersteunen.We hadden eerst het idee voor de gecombineerde methoden, gezien de noodzaak om de door galzouten geïnduceerde biofilmvorming in Shigella flexneri volledig te kwantificeren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat aspecten van de assay de reproduceerbaarheid kunnen beperken. Dus let goed op de kritische stappen om reproduceerbaarheid te waarborgen.Het demonstreren van de procedures zal worden gedaan door leden van mijn laboratoriu

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere...

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Source: Tay, S. B., et al. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method to quantify biofilm biomass in a pathogenic bacterium, comparing untreated controls with samples treated with a quorum-quenching enzyme. The enzyme disrupts bacterial signaling during early incubation, reducing cell adhesion. After washing and further incubation, control wells form dense biofilms, while treated wells show...

Quantifying Enzyme-Induced Biofilm Suppression in Pathogenic Bacteria

The video demonstrates a solid-phase adherence assay for assessing biofilm formation. In a multi-well plate, bacteria in bile salt-supplemented media adhere to solid surfaces, forming biofilms, which is confirmed by colorimetry through crystal violet staining and ethanol treatment.

A Solid Phase Adherence Assay to Assess Biofilm Formation

This video demonstrates a fluorescence-based method for quantifying bile salt-induced biofilm formation. Upon the addition of bile salts in the culture of a pathogenic enteric bacteria, biofilm production is detected using a fluorescent lectin that binds to the polysaccharides in the extracellular polymeric substance (EPS) matrix of the biofilm.

An Assay to Study Bile-Salt Induced Biofilm Formation through EPS Matrix Detection

The video showcases a biofilm dispersion assay using a multi-well plate. Buffer and glucose treatment disassemble the biofilm, releasing bacteria, while bile salts induce stress, retaining bacteria in the protective extracellular polymeric substance. Higher dispersion with buffer and glucose confirms successful biofilm disassembly, estimated by colony forming units measurement.

Detection of Biofilm Disassembly Through a Dispersion Assay

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Dit protocol beschrijft een aanpak die statische en dynamische methoden combineert om de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms in de zuivelindustrie te evalueren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van nieuwe biologische of chemische formuleringen voor de bestrijding van biofilms te testen.

Evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een aanpak die statische en dynamische methoden combineert

Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.

Kwantificerings-, levensvatbaarheidsbeoordeling en visualisatiestrategieën voor Acinetobacter-biofilms

Leer hoe je biofilmvorming door darmpathogenen analyseert onder galzoutcondities die de gastro-intestinale omgeving simuleren. Dit protocol combineert drie assays voor diepgaande karakterisering van bacteriële overleving en gedrag.

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Meer video's verkennen