Het MPLEx-Protocol voor Multi-dienst Analyses van bodemmonsters
30 mei 2018
Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.
Deze methode wordt gebruikt in de proteomics-, metabolomics- en lipidomics-velden door uitgebreide informatie te verkrijgen over de moleculaire veranderingen die plaatsvinden in bodemgeassocieerde microbiële gemeenschappen als gevolg van omgevingsverstoringen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het verkrijgen van meerdere analyten uit een enkele bodemmonster de precisie en nauwkeurigheid verhoogt en tegelijkertijd de bemonsteringstijd en het bereidingsproces vermindert. Om te beginnen, weeg voor elke 20-gram bodemmonster 10 gram in twee afzonderlijke methanol/chloroform-compatibele buizen van 50 milliliter.
Gebruik plastic buizen gemaakt van PTFE, omdat chloroform de meeste kunststoffen zal aantasten en de monsters zal verontreinigen. Voeg ongeveer 10 milliliter chloorform-gewassen roestvrijstalen en granaatparels toe aan elke buis. Voeg vervolgens, terwijl op ijs, vier milliliter koude ultrapure water toe aan elke buis en breng de monsters in een ijsketel over naar een afzuigkap.
Gebruik een glas schuimpipet van 25 milliliter om snel 20 milliliter ijskoud twee op één chloroform tot methanol volume/volume toe te voegen aan de buizen. Draai de deksels vast en vortex de bodemmix tot oplossing. De chloroform-methanol helpt de celwand van prokaryoten te breken en inactiveert ook enzymatische activiteiten.
Bevestig vervolgens de buizen aan 50-milliliter buis-vortexaansluitingen en vortex horizontaal gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius indien mogelijk in een koelkast. Plaats vervolgens de monsters in een vrieskast van min 80 graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten om ze volledig af te koelen. Soniceer vervolgens elk monster met een sonicatie-sonde in een afzuigkap met een zes millimeter, 1/4-inch sonde met 60% amplitude gedurende 30 seconden op ijs.
Na sonicatie plaats je de monsters in een vrieskast van min 80 graden Celsius, omdat sonicatie veel warmte kan genereren. Na het herhalen van de horizontale vortexing, sonicatie en invriezen stappen, centrifugeer de monsters bij 4.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Op dit punt zal het monster worden gescheiden in de bovenste metabolietenlaag, de eiwitinterlaag en de onderste lipidelaag.
Plaats de monsters op ijs. Gebruik vervolgens in een afzuigkap een glas schuimpipet van 10 milliliter om de bovenste metabolietenlagen van de twee 50-milliliterbuizen over te brengen in één grote glazen buis. Kantel de 50-milliliterbuis vervolgens lichtjes om de eiwitinterlaag vrij te maken, zodat deze vrij zwevend is boven de onderste lipidelaag.
Gebruik vervolgens een schone roestvrijstalen spatel om zorgvuldig beide eiwitinterlagen te scheppen en plaats ze samen in één nieuwe 50-milliliterbuis. Gebruik een glas schuimpipet van 25 milliliter om de onderste lipidelagen over te brengen in één grote glazen buis. Voeg 20 milliliter ijskoud methanol toe aan de twee buizen met debrijs en aan de ene buis met de eiwitinterlaag.
Vortex de buizen kort en centrifugeer de debrijspellets en eiwitinterlaag bij 4.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Decanteer vervolgens het methanol in een gevaarlijk afvalcontainer in een afzuigkap. Bevries de eiwit- en debrijspellen in vloeibare stikstof en droog ze gedurende ongeveer twee uur in een lyofilisator.
Voeg 20 milliliter eiwitsolubilisatiebuffer in 50-millimolare trisbuffer, pH 8,0, toe aan elk van de debrijspellen en 10 milliliter aan de eiwitinterlaagbuis. Probeer sonicatie de monsters in een afzuigkap met 20% amplitude gedurende 30 seconden om ze in oplossing te brengen. Vortex de monsters gedurende twee minuten.
Plaats vervolgens het eiwitinterlaagmonster in een labbuisrotator bij 50 graden Celsius gedurende 30 minuten om het eiwit te solubiliseren. Vortex de debrijsmonsters horizontaal gedurende nog eens 10 minuten om eventuele resterende intacte cellen te lysen. Roteer vervolgens met de eiwitinterlaagmonsters gedurende de resterende 20 minuten.
Centrifugeer alle monsters bij 4.500 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en verzamel het supernatant van elke buis per monster in twee 50-milliliterbuizen. Voeg 10 milliliter solubilisatiebuffer toe aan de eiwitinterlaagpellet. Soniceer en vortex vervolgens de pellet terug in oplossing.
Na centrifugatie, combineer de supernatanten gelijkmatig in de twee 50-milliliterbuizen met de debrijspellensupernaten en centrifugeer de buizen in een vasthoekige emmerrotor bij 8.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om eventueel resterend debrijs te pelletten. Verdeel de supernatanten in twee 50-milliliterbuizen. Voeg vervolgens met een glas schuimpipet van 10 milliliter 7,5 milliliter TCA toe aan elke buis.
Vortex de monsters tot oplossing. Plaats vervolgens de monsters in een vrieskast van min 20 graden Celsius gedurende twee uur tot een nacht. Centrifugeer het monster bij 4.500 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het geprecipiteerde eiwit te pelletten en decanteer het supernatant in afval.
Voeg 10 milliliter 100% ijskoud aceton toe aan elk eiwitpellet. Vortex de buizen en combineer soortgelijke pellets in één buis. Centrifugeer en decanteer vervolgens het aceton.
Gebruik een kleinere hoeveelheid aceton om het pellet twee keer te wassen en breng de suspensie over naar een 1,5 of twee-milliliterbuis voor de laatste spin. Decanteer het supernatant in afval en laat het pellet gedurende ongeveer 20 minuten op zijn kop drogen op een papieren doek in een afzuigkap. Afhankelijk van de grootte van het pellet, voeg 100 tot 200 microliter van de eiwitsolubilisatiebuffer toe.
Soniceer en vortex het pellet tot oplossing. Merk op dat het monster viskeus kan zijn vanwege humuszuren die samen met het eiwit worden geprecipiteerd, wat bij een volgende centrifugatie wordt verwijderd. Schu
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het extraheren van metabolieten, eiwitten en lipiden uit één enkel bodemmonster, wat multi-omische massaspectrometrie-analyses faciliteert. Deze aanpak vermindert de tijd voor monstervoorbereiding en verbetert de precisie en nauwkeurigheid van de resultaten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Proteomics
- Metabolomics
- Lipidomics
Achtergrond
- Deze methode biedt uitgebreide inzichten in moleculaire veranderingen in bodemgeassocieerde microbiële gemeenschappen.
- Het pakt de uitdagingen aan die worden veroorzaakt door omgevingsperturbaties.
- Het gebruik van één enkel monster voor meerdere analyses verhoogt de efficiëntie.
- Chloroformcompatibiliteit is cruciaal voor de integriteit van het monster.
Doel van de studie
- Om het extractieproces van diverse analyten uit bodemmonsters te stroomlijnen.
- Om de nauwkeurigheid van multi-omische analyses te verbeteren.
- Om onderzoek in de bodemmicrobiologie en milieukunde te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Weeg 10 gram bodem af in twee methanol/chloroform-bestendige buizen van 50 milliliter.
- Voeg aan elke buis roestvrijstalen en granaatkralen toe die gewassen zijn met chloroform.
- Voeg koud ultrapuur water toe terwijl de monsters op ijs worden bewaard.
- Verplaats de monsters naar een zuurkast voor verdere verwerking.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt gelijktijdige extractie van meerdere analyten mogelijk.
- Het vermindert de voorbereidingstijd en inspanning aanzienlijk.
- Het verbetert de precisie van de resulterende analyses.
- Het faciliteert een beter begrip van de reacties van microbiële gemeenschappen.
Conclusies
- Dit protocol is effectief voor multi-omische studies in de bodemmicrobiologie.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor het analyseren van beperkte monsterhoeveelheden.
- De methode kan worden aangepast voor diverse milieuonderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Geïntegreerde multi-omische profilering van complexe microbiële gemeenschappen maakt mechanistische risicoreductie mogelijk in de vroege ontdekkingsfase door moleculaire fenotypen te koppelen aan omgevingsperturbaties. Het MPLEx-protocol ondersteunt targetvalidatie en assayontwikkeling door reproduceerbare, kwantitatieve metaboliet-, eiwit- en lipidenprofielen te leveren uit beperkte bodembiomassa. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in pipelines voor leadidentificatie via gestandaardiseerde, high-content moleculaire read-outs.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door multi-omische verschuivingen te correleren met responsen van de microbiële gemeenschap op perturbaties.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd en inspanning voor monstervoorbereiding door gelijktijdige extractie van metabolieten, eiwitten en lipiden uit één enkel bodemmonster.
- Predictieve waarde: Verhoogt de precisie en nauwkeurigheid van moleculaire metingen, wat biologische risicoreductie en beslissingen over portfolio-triage ondersteunt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door compatibele metaboliet-, eiwit- en lipide-extracten te leveren voor massaspectrometrie.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via een robuuste, op oplosmiddelen gebaseerde extractiemethode die toepasbaar is op diverse monstertypes.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door kwantitatieve resultaten te leveren uit beperkte hoeveelheden complexe bodemmonsters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt ziekterelevante systeemanalyses door snelle multi-omische metingen mogelijk te maken om veranderingen na biologische en omgevingsperturbaties te evalueren.
- Mechanistische risicoreductie: Vergemakkelijkt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van preklinische modellen door consistente terugwinning van eiwitten, lipiden en metabolieten over verschillende monstertypes heen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door een brede toepasbaarheid aan te tonen over microbiële consortia, weefsels en biofluïda.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het MPLEx-protocol positioneert zich binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, door multi-omische data te leveren die bijdragen aan de betrouwbaarheid van targets en de verduidelijking van signaalpaden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie door het mogelijk maken van uitgebreide profilering van moleculaire veranderingen in met bodem geassocieerde microbiële gemeenschappen.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door middel van gestandaardiseerde extractie, wat resulteert in gescheiden metaboliet-, eiwit- en lipidelaagjes voor downstream-analyse.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen (bijv. 3.376 peptiden, 105 lipiden, 102 polaire metabolieten) die vergelijking van condities en effecten van verbindingen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische continuïteit door het nut aan te tonen over diverse monstertypen, inclusief microbiële consortia en weefselmodellen.
- Enterprise Reuse: Positioneert de methode als een herbruikbare capaciteit voor multi-omische studies in plaats van een eenmalige techniek, waardoor redundante monstervoorbereiding wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in de analyse van microbiële gemeenschappen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van multi-omische monstervoorbereiding.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroegtijdig mechanistisch inzicht.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over voortgang op basis van geïntegreerde omische profielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in proteomiek-, metabolomiek- en lipidomiek-workflows en massaspectrometrie-instrumentatie.
- Vereist chloroform-compatibele instrumentatie (PTFE-buisjes, glazen pipetten) en cold-chain-infrastructuur voor de integriteit van de monsters.
- Vereist standaardisatie van extractieparameters (vortexen, sonicatie, centrifugatie) tussen teams om reproduceerbaarheid tussen laboratoria te waarborgen.
- Vereist aanpassingen voor variërende bodembiomassa en het gehalte aan humussubstanties die het herstel van eiwitten uit de tussenlaag beïnvloeden.
- Omvat praktische beperkingen, waaronder de omgang met gevaarlijke stoffen (chloroform), waarvoor het gebruik van een zuurkast en veiligheidsprotocollen vereist is.
