Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis
16 mei 2018
We kwantificeren epidermale celdood in kikkers met chytridiomycosis met twee methoden. Ten eerste, we gebruiken terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ histologie om verschillen tussen klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren te bepalen. Ten tweede, wij voeren een tijdreeksanalyse van apoptosis over infectie met behulp van een caspase-3/7 eiwit analyse.
Het algemene doel van dit experiment is om de invloed van de amfibische schimmelpathogeen batrachochytrium dendrobatidis op apoptose en celdood in het epifyseweefsel van kikkers te observeren. Deze methode kan ons helpen om dierziekten zoals dierlijke ziekten te begrijpen, zoals of infectie celdood veroorzaakt of, omgekeerd, of er immuunmechanismen tegen infectie zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd op kleine weefselbiopsiemonsters, zodat kleine individuen herhaaldelijk kunnen worden bemonsterd tijdens het verloop van de infectie.
Om met deze procedure te beginnen, bereidt u hydrofiele glazen schuifjes met monsterweefsel voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de weefselsecties te deparaffineren, wast u de schuifjes drie keer gedurende vijf minuten met xyleen in een Coplin-pot. Was daarna de schuifjes twee keer gedurende vijf minuten met 100% ethanol.
Was daarna de schuifjes met 95% ethanol en 70% ethanol gedurende drie minuten. Was vervolgens de schuifjes eenmaal met PBS gedurende vijf minuten. Om experimentele en negatieve controle-schuifjes voor te bereiden, behandel de weefsels voor met vers verdunde proteinase K die rechtstreeks op de schuifjes wordt toegevoegd.
Bewaar de schuifjes gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuifjes twee keer gedurende twee minuten met PBS. Om positieve controle-schuifjes voor te bereiden, behandel de weefsels met DN-buffer en bewaar de schuifjes gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Los hierna DNase één op in DN-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 microgram per milliliter. Voeg de voorbereide DNase-oplossing toe aan de schuifjes. Bewaar de schuifjes gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
Was vervolgens de schuifjes met gedestilleerd water in een Coplin-pot vijf keer gedurende drie minuten. Doe de reactie uit in 3% waterstofperoxide in PBS gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuifjes twee keer gedurende twee minuten met PBS.
Voeg vervolgens evenwichtsbuffer toe aan het weefsel op de schuifjes. Bewaar gedurende 10 seconden op kamertemperatuur. Tik vervolgens het overtollige vocht rond de weefselsectie af.
Verdun terminaal deoxynucleotidyl transferase-enzym in reactiebuffer. Voeg het vervolgens toe aan het weefsel op de experimentele en positieve controle-schuifjes. Bewaar in een bevochtigde kamer gedurende één uur op 37 graden Celsius.
Plaats de schuifjes vervolgens in een Coplin-pot met de werkconcentratie van stopbuffer. Schud gedurende 15 seconden en bewaar de schuifjes gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuifjes drie keer gedurende één minuut met PBS en tik het overtollige vocht af.
Voeg vervolgens het anti-digoxigenine-conjugaat toe, voorverwarmd tot kamertemperatuur, rechtstreeks op het weefsel. Bewaar de schuifjes gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in een bevochtigde donkere kamer. Was na de bewaarperiode de schuifjes vier keer gedurende twee minuten met PBS.
Tik eventueel overtollig vocht af. Voeg vervolgens montagemedium toe aan de schuifjes. Voeg 15 microliter DAPI-oplossing toe aan het montagemedium op de schuifjes.
Bedek elke schuif met een dekglas en verzegel met nagellak. Laat de schuifjes in het donker drogen. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de schuifjes onmiddellijk na voltooiing van het staande proces te observeren.
Neem foto's op 400 keer in willekeurige intervallen langs elke huidsectie. Tel de DAPI-gekleurde blauwe cellen om ervoor te zorgen dat er ten minste 100 cellen per huidsectie per dier zichtbaar zijn. Tel vervolgens het aantal TUNEL-positieve cellen die verschijnen als rode enkele cellen met duidelijke celranden.
Gebruik om te beginnen een omgekeerde lichtmicroscoop met een vergroting van 40 keer om een foto te maken van elk van de tenen van de kikker. Teken lijnen rond de rand van de teenclip en gebruik beeldverwerkingssoftware om de oppervlakte binnen de vorm te schatten. Om het oppervlak van het driedimensionale huidmonster te evalueren, vermenigvuldigt u de geschatte oppervlakte met pi.
Om eiwitten uit een bevroren kikkerteenmonster te extraheren, plaatst u het monster in een microcentrifugebuisje met schroefdop van 1,5 milliliter dat 100 microliter monsterbuffer en twee roestvrijstalen kralen bevat. Gebruik een bead beater op maximale snelheid om de cellen te lyseren. Plaats vervolgens de buis op ijs gedurende drie minuten.
Centrifugeer vervolgens de buis om het supernatant te verzamelen. Om de caspase 3/7-assay uit te voeren in een 384-wellsplaat, voegt u 10 microliter monsterbuffer toe als blanco en 10 microliter eiwitextract in drievoudige. Pipetteer vervolgens 10 microliter commercieel verkrijgbaar caspase 3/7-reagens naar het eiwitextract en de blanco putjes.
Schud vervolgens de plaat zachtjes gedurende 15 seconden om de twee reagentia te mengen. Bewaar gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in het donker. Gebruik vervolgens een lichtmetende plaatlezer om de luminescentie van het monster te meten.
In deze studie tonen de geïnfecteerde dieren significant meer TUNEL-positieve cellen in vergelijking met controledieren, zoals geïllustreerd door rode of roze gekleurde cellen. Bij controledieren zijn er weinig TUNEL-positieve cellen en ze zijn niet geconcentreerd in de epidermis. Bij geïnfecteerde dieren zijn de TUNEL-positieve cellen frequenter in de epidermis.
TUNEL-positieve cellen zijn meer geconcentreerd op en direct naast de plaatsen van geïnfecteerde cellen. Ook zijn er meer wijdverspreide TUNEL-positieve cellen over de epidermis en in epidermale lagen die dieper zijn dan waar de schimmelpathogeen verbleef. Bij geïnfecteerde dieren zijn er meer TUNEL-positieve cellen in alle drie de huidtypes met een bijzonder hoog niveau in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de impact van de amfibie-schimmelpathogeen Batrachochytrium dendrobatidis op apoptose en celdood in epidermale weefsels van kikkers. Door gebruik te maken van TUNEL in situ histologie en caspase 3/7 eiwitonderzoek, beoogt het onderzoek de relatie tussen infectie en celdood te verduidelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Ziekten bij wilde dieren
- Celbiologie
Achtergrond
- Chytridiomycose vormt een aanzienlijke bedreiging voor amfibiepopulaties.
- Inzicht in de mechanismen van celdood kan bijdragen aan instandhoudingsinspanningen.
- Apoptose kan een rol spelen bij de respons op schimmelinfecties.
- Kleine weefselmonsters maken herhaalde analyse gedurende de infectie mogelijk.
Doel van de studie
- Om epidermale celdood te kwantificeren bij kikkers die geïnfecteerd zijn met chytridiomycose.
- Om verschillen in apoptose vast te stellen tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde kikkers.
- Om het verloop van apoptose tijdens de infectie te analyseren.
Gebruikte methoden
- Terminal transferase-gemedieerde dUTP nick end-labelling (TUNEL) voor histologische analyse.
- Caspase 3/7-eiwit analyse voor tijdreeksbeoordeling.
- Bereiding van hydrofiele glasplaatjes met weefselmonsters.
- Deparaffinering van weefselcoupes met behulp van xyleen- en ethanolwasbeurten.
Belangrijkste Resultaten
- Er werden verschillen in apoptose-snelheden waargenomen tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde kikkers.
- Tijdreeksanalyse onthulde trends in celsterfte gedurende het verloop van de infectie.
- De methoden bleken effectief voor het analyseren van kleine weefselmonsters.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan het begrip van immuunresponsen op infectie.
Conclusies
- De studie biedt waardevolle gegevens over de effecten van chytridiomycose op epidermale cellen van kikkers.
- Inzicht in apoptose binnen deze context kan bijdragen aan strategieën voor natuurbehoud.
- Toekomstig onderzoek zou immuunmechanismen tegen schimmelinfecties kunnen verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Deze studie demonstreert hoe apoptose-assays kunnen worden gebruikt om door pathogenen geïnduceerde weefselschade in ziekte-modellen bij wilde dieren te evalueren, wat een kader biedt voor mechanische risicoreductie bij vroege validatie van targets. Door de celdood in de epidermis te kwantificeren bij kikkers die geïnfecteerd zijn met Batrachochytrium dendrobatidis, ondersteunt deze aanpak het voorspellend vertrouwen bij het beoordelen van gastheer-pathogeeninteracties en draagt het bij aan de ontdekking van translationele biomarkers. Het gebruik van kleine weefselbiopten maakt longitudinale bemonstering mogelijk, wat cruciaal is voor het volgen van de ziekteprogressie en therapeutische interventies in preklinische systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door pathogeen-gestuurde apoptose te onderscheiden van gastheer-afweermechanismen in epidermale weefsels.
- Operationele waarde: Levert ruimtelijk opgeloste celstervingsgegevens via TUNEL-kleuring om mechanismen van weefseldisruptie in infectieziektemodellen te verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het vertrouwen in targets door caspase 3/7-activiteit te correleren met de infectielast over tijd, wat dosis-respons- en temporele profilering mogelijk maakt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Stelt gestandaardiseerde protocollen vast voor de detectie van apoptose in kleine weefselmonsters, waardoor reproduceerbare screening van verbindingen mogelijk wordt in situaties met beperkte hoeveelheden materiaal.
- Operationele waarde: De Caspase 3/7-assay biedt compatibiliteit met high-throughput voor tijdreeks-experimenten, terwijl TUNEL validatie biedt van ruimtelijke apoptosepatronen.
- Klaarheid voor assay: Fluorescentiemicroscopie en luminescente read-outs genereren kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor assay-optimalisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt epidermale apoptose aan de ernst van de ziekte, wat de afstemming van biomarkers tussen moleculaire read-outs en de klinische progressie van de infectie ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk door de dynamiek van caspase 3/7 te volgen over verschillende infectiestadia in longitudinale studies.
- Translationele continuïteit: Demonstreert hoe histologische en biochemische apoptose-assays gecombineerd kunnen worden om de preklinische validiteit in modellen voor infectieziekten te versterken.
Integratie van pipeline en workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door apoptose-readouts te bieden die bijdragen aan targetvalidatie en leadidentificatie, in het bijzonder in studies waarbij de toegankelijkheid van weefsels conventionele histologie beperkt.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing over de vraag of blootstelling aan pathogenen apoptose in gastweefsel induceert of onderdrukt, waardoor mechanismen van weefselbeschadiging worden verduidelijkt.
- Screening: De Caspase 3/7-assay maakt schaalbare, kwantitatieve screening mogelijk van modulatoren die apoptose in kleine bioptmonsters beïnvloeden.
- Analytics: Luminescente en fluorescente outputs leveren kwantificeerbare, genormaliseerde metingen voor het vergelijken van apoptose over verschillende condities en tijdstippen.
- Translational Research: Correleert moleculaire apoptose-activiteit met histopathologische veranderingen, wat de kwalificatie van biomarkers in preklinische modellen ondersteunt.
- Enterprise Reuse: De gecombineerde TUNEL- en caspase 3/7-benadering vestigt een herbruikbaar platform voor apoptose-profilering voor studies naar infectieziekten en toxicologie.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de lokalisatie en kinetiek van apoptose in geïnfecteerde versus controleweefsels te onderscheiden.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde protocollen voor preparatie en beeldvorming van coupes waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en monsterbatches.
- Strategische waarde: Maakt eerdere go/no-go-beslissingen mogelijk door vroege biomarkers van weefselstress en pathogeenimpact te leveren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van targets door apoptose te kwantificeren als een functionele readout van het ziektemechanisme.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologie, fluorescentiemicroscopie en eiwitextractie uit beperkte weefselmonsters.
- Afhankelijk van toegang tot een cryostaat, fluorescentiemicroscoop en luminescente plaatlezer voor TUNEL- en caspase 3/7-assays.
- Standaardisatie tussen gebruikers is noodzakelijk voor het snijden van weefselcoupes, de timing van kleuringen en de beeldinstellingen om de gevoeligheid van de assay te behouden.
- Aanpassing aan andere modelsystemen vereist validatie van de antilichaampenetratie en enzymtoegankelijkheid in verschillende weefseltypen.
- Praktische beperking: Kleine biopsieën van de teentop beperken de eiwitopbrengst, waardoor alternatieve normalisatiemethoden nodig zijn, zoals schatting van het huidoppervlak via imaging, om verbruik van het extract te vermijden.
