Name: Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer TUNEL en caspase-3/7 analyse om apoptose in kikkerhuid te meten bij chytridiomycose-infectie. Deze methode helpt onderzoekers celdood te kwantificeren in kleine weefselmonsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de volgende mensen die met veeteelt en gegevensverzameling geholpen: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney en T. Knavel; en M. Merces voor hulp bij dissecties. Wij zouden ook willen bedanken M. McFadden, P. Harlow en Taronga Zoo voor het aantrekken van de L. v. alpinaen G. Marantelli voor het aantrekken van de P. corroboree. Wij danken F. Pasmans, A. Martel voor advies over apoptosis testen, C. Constantine, A. Kladnik en R. Webb voor hulp bij TUNEL assay, en T. Emeto en W. Weßels voor hulp bij protocol en kit voor caspase-3/7 assay. Dit manuscript en het protocol is aangepast van Brannelly et al. 2017 Peer J22.

James Cook University goedgekeurd dierenethiek toepassingen A1875 in P. corroboree en A1897 en A2171 voor L. v. alpina.
1. de veehouderij en het toezicht op
<ol><li>Huis dieren individueel, in een omgeving die geschikt is voor de soort, met een passende water, voeden en reinigen van de planning. Dieren dagelijks controleren.<ol>
<li>Volwassen individuen van de bedreigde Pseudophryne corroboree gebruiken (voor de TUNEL Assay, punt 4) en het bedreigde Litoria verreauxii alpina (voor de Caspase-3/7 assay, afdeling 5), geschonken uit gevangenschap fokken van voorzieningen. Onderhouden van de dieren bij 15-18 ° C, op een mos en substraat grind, mist ze dagelijks met omgekeerde osmosewater en voeden van 3 keer per week met gut geladen krekels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gegevens verzamelen over elke afzonderlijke eenmaal per week. Swab het individuen voor Bd zoals beschreven in stap 2.1. Wegen van elk dier op neared 0,1 g nauwkeurig af met behulp van een schaal, en meet hun snuit om te ventileren (SVL) lengte tot de dichtstbijzijnde 0,01 mm met behulp van dial remklauwen.</li>
	<li>Controleer na inoculatie (zoals beschreven in sectie 3), dieren dagelijks voor klinische tekenen van infectie (onregelmatige huid slough, eetlustgebrek, been roodheid, lethargie of vertraagde restarmen reflex) met inachtneming van dierenethiek richtsnoeren. Euthanaseren dieren als klinische symptomen en morbiditeit aanwezig zijn.<ol>
<li>Euthanaseren met een overdosis van tricaïne methanesulfonate (MS222) (0,1% w/v MS222 pH 6-7 met natriumbicarbonaat in leeftijd leidingwater). Dieren in de MS222 houden, want 10 minuten beweging immers ophoudt en zij geen reactie op prikkels tonen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. testen voor Bd -infectie
<ol><li>Zwabberen voor Bd
	<ol>
<li>Elk dier wisser met een nieuwe steriele rayon doekje (één staafje per dier). Gebruik de volgende swabbing methode: vijfmaal de venter, vijfmaal over elke dij, kant en ledematen. Dit is een totaal van 45 slagen.</li>
		<li>Tijdens en tussen de lijnen om effectieve opname van DNA het staafje voorzichtig draaien. De swab tip afbreken in 1,5 mL microcentrifuge buizen en bewaren bij-20 ° C tot extractie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA-extractie en kwantitatieve analyse van qPCR<ol>
<li>Het uittreksel van genomic DNA van de swabs door toevoeging van 50 µL van een commercieel beschikbare DNA-extractie reagens met 30-40 mg van 0.5 mm silica parels. Kraal verslaan de monsters in een kraal klopper cel ontregelt op maximale snelheid gedurende 2 minuten. Centrifugeer na de kraal klopper stap, de monsters bij 2.000 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Incubeer de monsters bij 100 ° C gedurende 10 minuten en laat afkoelen. Centrifugeren van de monsters bij 5.000 x g gedurende 3 min, en vervolgens het supernatant overbrengen in individuele 1,5 mL micro centrifuge buizen en bewaren bij-20 ° C tot qPCR.</li>
		<li>Gebruik van kwantitatieve PCR (qPCR) na Boyle et al. 200418 voor het analyseren van de infectie laden. Gebruik de volgende wijzigingen:<ol>
<li>DNA-extractie monsters 6:100 met dubbele gedeïoniseerd water verdunnen. Voeg 0,7 µL van bovien serumalbumine (BSA) aan elk putje om te voorkomen dat PCR remming. Elk monster wordt in singlicate uitgevoerd. Op elke plaat gebruik een negatieve (geen sjabloon) controle en een positieve controle met een reeks verdunning normen Zoöspore (infectie) belasting.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. enten
<ol><li>Cultuur Bd
	<ol>
<li>Bereiden cultuur Bouillon door 16 g trypton, gelatine hydrolysaat 2 g en 4 g van lactose (TGHL) tot 1 L gedeïoniseerd water toe te voegen. Autoclaaf (121 ° C gedurende 40 min.) en laat de Bouillon te koelen.</li>
		<li>Inoculeer Bd isolaat (in dit geval, geïsoleerd van New South Wales isoleren, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage nummer 11) in een TGHL Bouillon en groeien voor 7 d bij 23 ° C, dan de Bouillon cultuur naar TGHL agar platen.</li>
		<li>Om platen, voegt u 16 g trypton, gelatine hydrolysaat 2 g, 4 g van lactose (TGHL) en 10 g bacteriologische agar aan 1 L van gedeïoniseerd water en autoclaaf (121 ° C gedurende 40 minuten). Zodra het mengsel is koel genoeg om te raken, maar voordat het stolt, giet de TGHL agar in 92 mm diameter cultuur platen zodat ze 1/4 tot 1/3 volledig, in een klasse II biologische veiligheidskast.</li>
		<li>Wanneer de agar is verhard en volledig is afgekoeld, Inoculeer elke plaat met 0,5 mL van Bd van de vloeibare Bouillon en gelijkmatig. Laat Bd Bouillon mengsel droog op de plaat gedurende ongeveer 1 uur en dan zegel platen met kunststof paraffine film. Incubeer de platen agar kant neer bij 23 ° C gedurende 5-7 d.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platen worden zondvloed voor Zoöspore inoculatie oplossing<ol>
<li>Controleer Zoöspore motiliteit onder een omgekeerde lichte Microscoop te zorgen dagelijks voor inoculatie levensvatbaarheid. Wanneer Zoöspore release hoog, met veel zoospores zwemmen buiten de Sporangium is, is de cultuur klaar voor de inenting.</li>
		<li>Overgiet elke plaat met 3 mL leeftijd leidingwater of kunstmatige vijverwater, door het water te gieten in de plaat en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de zoospores in het water. Na de incubatieperiode, de Zoöspore schorsing te decanteren in een nieuwe steriele container.</li>
		<li>Schatting Zoöspore concentratie volgens de instructies van de fabrikant van met behulp van een haemocytometer. Zodra de concentratie van de Zoöspore schorsing is bekend, Verdun de schorsing tot een concentratie van 1 x 106 zoospores per 3 mL met leeftijd leidingwater.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculeer dieren<ol>
<li>Inoculeer elke dier door gieten 3 mL van het mengsel van de entmateriaal over haar venter19 in individuele 50 mL verpakkingen. Toestaan dat overtollige entmateriaal om te verzamelen in de base van de inoculatie container. Laat ieder dier in individuele inoculatie container voor 24u om infectie en na de inoculatie van de 24 h, keren elk individu naar een ontsmet terrarium.<ol>
<li>Desinfecteren terraria met behulp van een 13% volume/volume (v/v) commerciële bleekwater oplossing20, ten minste tweemaal spoelen met water en laten drogen gedurende niet minder dan 24 uur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor Bd-negatieve controles, mock enten van de dieren met behulp van dezelfde methoden zoals in 3.2-3.3, maar overstromingen van Bd-gratis agar platen met 5 mL leeftijd leidingwater in plaats daarvan van Bd geïnoculeerd agar platen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. TUNEL Assay
<ol><li>Euthanaseren van dieren die klinische symptomen van chytridiomycosis, vertonen, zoals beschreven in stap 1.3.1, en een gelijk aantal Bd-negatieve controledieren.</li>
	<li>Ontleden van de huid (dorsale, ventrale en dij) monsters van elk dier. Corrigeer de huid monsters gedurende 2 uur in 4% v/v fosfaatgebufferde formaldehyde. De korte- en consistente vaststelling van tijd kunnen de weefsels vast te stellen ten volle, maar ook zorgt voor de doeltreffende en accurate immunohistochemistry kleuring. Vervolgens transfer naar 80% ethanol tot insluiten voor segmenteren.</li>
	<li>Huid in paraffine voor histologisch preparaat na standaardmethoden21insluiten. Kortom, het protocol is als volgt:<ol>
<li>Uitdrogen van weefsels in een gesorteerde reeks van ethanol, en schakel de ethanol met xyleen. Het weefsel inbedden in paraffine, en leg alle drie huid monsters voor elk individu in een paraffine blok.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sectie huid gebruikend microtome standaard histologisch preparaat21na. Afdeling van het weefsel serieel op 5 µm en vervolgens brengt op hydrofiele glas dia's. Plaats vier seriële histosections per huidtype per dia. Drie dia's per persoon met seriële huid secties maken, bedenk dan dat elke dia heeft vier secties van elk weefsel aangebracht.</li>
	<li>Vlekken van de dia's in de volgende volgorde:<ol>
<li>De eerste dia vlek met haematoxyline gevolgd door eosine counterstaining (H & E). Deze dia is het visualiseren van de locatie van Bd Sporangium binnen de huid.</li>
		<li>Vlekken van de tweede dia die volgt op een commercieel beschikbare TUNEL assay voor histologisch preparaat en volg de instructies van de fabrikant, die hieronder worden beschreven.<ol>
<li>Eerst de weefselsecties in een coplin pot deparaffinize door het wassen van de dia's met drie wijzigingen van xyleen voor 5 min per wasbeurt, en volgen met twee wijzigingen van 100% ethanol voor 5 min elke wassen. Volg met een wash van 95% ethanol voor 3 min en vervolgens 70% ethanol voor 3 min. afwerking met een wash van PBS voor 5 min.</li>
			<li>Voorbehandeling van het weefsel met vers verdunde eiwit verteren enzym (proteïnase K bij een concentratie van 20 μg/mL verdund in PBS) en rechtstreeks aan de dia toevoegen. Laat Incubeer gedurende 15 min. Wash met twee wijzigingen van PBS in een pot van de coplin voor elke 2 min.</li>
			<li>Onttrekt uit de overmaat vloeistof en doven in 3,0% waterstofperoxide in PBS in een coplin pot voor 2 min op kamer temp. Spoel tweemaal met PBS, vijf minuten elke wassen.</li>
			<li>Onttrekt uit de overmaat vloeistof, dan 75 µL/5 cm2 van de buffer evenwicht rechtstreeks op het weefsel op de dia toepast. Incubeer gedurende 10 s. kraan uit de overtollige vloeistof rond de sectie en 55 µL/5 cm2 terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzym te werken toe te passen. Incubeer in een bevochtigde kamer voor 1 uur bij 37 ° C.</li>
			<li>Na de incubatie TdT, zet de dia in een coplin pot van werkende kracht stop/was buffer, doorroeren voor 15 s en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de dia met drie wijzigingen van PBS voor 1 min per wasbeurt. Onttrekt uit de overmaat vloeistof.</li>
			<li>Anti-heksenkruid geconjugeerde (rhodamine), dat is zijn opgewarmd tot kamertemperatuur aan het weefsel, 65 µL/5 cm2van toepassing. Broeden in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten op kamer temp en Vermijd blootstelling aan licht. Wassen met vier wijzigingen van PBS gedurende 2 minuten per wasbeurt. Onttrekt uit de overmaat vloeistof.</li>
			<li>Voltooien door toe te voegen 15 µL van 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) in de dia, die als een teller vlek fungeert medium dia montage. Vervolgens dek af met een cover slip en verzegel met nagellak of rubber-cement. Laat dia's te drogen in het donker als de bepaling lichtgevoelig is.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vlek de derde dia is gekleurd met de TUNEL assay en DAPI counterstain, maar als een positieve en negatieve controle gebruiken voor elk monster. Opmerking: De 4 histosections op de controle-dia's, de eerste 2 zijn positieve controle wordt gerepliceerd en de laatste 2 zijn negatieve controle wordt gerepliceerd.<ol>
<li>Voor de positieve controles, in plaats van stap 4.5.2.2, vooraf behandelen het weefsel met DN buffer (30mM trizma basis, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0.1 mM DDT) en laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Los vervolgens Dnase ik bij DN buffer voor een eindconcentratie van 0.1ug / mL, en direct toepassen op de dia. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.  Vervolgens wassen de dia met 5 wash van dH2O gedurende 3 minuten elke wassen. Vlek uit de overtollige vloeistof. Vervolgens weer TUNEL assay zoals aangegeven in sectie 4.5.2.3.</li>
			<li>Voor de negatieve controles, Voeg geen het terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzym aan deze monsters (zoals beschreven in sectie 4.5.2.4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observeren TUNEL dia's onmiddellijk na voltooiing van de test.<ol>
<li>Neem foto's willekeurig regelmaat langs elke sectie van de huid bij 200 X met behulp van een fluorescente microscoop, met behulp van filters voor zowel de rhodamine vlek, die onthult de apoptotic cellen en verschijnt rood en DAPI die onthult alle kernen en wordt blauw weergegeven, zodat een overlay van cellen kunnen worden gegenereerd. Zorgen voor ten minste 100 cellen per huid sectie per monster zijn gefotografeerd. De dia's opslaan in een donkere Microscoop vak bij-20 ° C.</li>
		<li>Cellen (blauwe DAPI gekleurd) tellen per beeld. Zorgen voor ten minste 100 cellen per huid sectie zijn geteld. Om te bereiken 100 cellen, alle cellen binnen het besturingselement image te tellen. Als minder dan 100 cellen in één beeld aanwezig zijn, tellen een ander beeld tot ten minste 100 cellen worden bereikt per huid sectie per dier.</li>
		<li>Vervolgens tellen het aantal TUNEL positieve cellen in dezelfde afbeeldingen (rode rhodamine gekleurd). TUNEL positieve cellen, die duiden op een apoptosis en niet necrose of achtergrond, zijn afzonderlijke cellen met randen van de cel wissen (membranen zijn met geen lysis intact). De cellen kleiner soms formulier apoptotic organen.</li>
		<li>Zoek de gebieden geteld in de TUNEL assay en analyseren van de desbetreffende regio's op de H & E gekleurd histosections. Bevestigen dat de H & E gekleurd secties correspondeert met sites van Bd infectie, die zorgt voor Bd-besmette sites worden gebruikt bij het tellen van apoptotic cellen in de TUNEL assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caspase 3/7 Assay
<ol><li>Teen tips verzamelen van elk dier ( Bd- blootgesteld en Bd- negatieve) eenmaal per week door de week 3 post inoculatie, en twee weken tot het einde van het experiment, tot 8 tenen per individu.<ol>
<li>Snijd de tip teen op de tweede falanx met een vlam-gesteriliseerde schaar, en plaatst in een 1,5 mL microtube en onmiddellijk bevriezen bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haal eiwitten uit bevroren teen monster.<ol>
<li>Leg monsters in 100 µL van monster buffer (25 mM HEPES pH = 7, 5 mM MgCl2) met twee RVS kralen (3.2 mm) in een 1,5 mL schroefdop microtube. Lyse monsters door 4 cycli van 1 min parel verslaan op maximale snelheid (in de dezelfde kraal klopper als gebruikt in stap 1.2.1) gevolgd door 3 min op ijs. Centrifugeer na lysis, monsters van 12.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min. verzamelen supernatant in de test wilt gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eiwitconcentratie per monster met behulp van de analyse van Bradford te kwantificeren.<ol>
<li>In een 384 goed plaat, meng 10 µL van eiwit extract met 10 µL van Bradford reagens en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Uitvoeren van elk monster in tweevoud, samen met een reeks van 5 vouw BSA verdunning normen. Lees de absorptie bij 595 nm op een extinctie-afleesapparaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als alternatief, als de teen tip monsters te klein (de eiwitconcentratie is in de buurt van de laagste standaard bepaald op basis van de analyse van Bradford in stap 4.3.1 of zo de kikkers die zijn bemonsterd zijn onder 3 g totale gewicht), standaardiseren monsters door te schatten huidoppervlak gebied met behulp van foto's, in plaats van de analyse van Bradford.<ol>
<li>Voor het uitpakken van fotograferen de eiwitten uit het monster voor de caspase-assay, elke teen op 40 X vergroting met behulp van een omgekeerde licht microscope.</li>
		<li>Het analyseren van de teen monster met behulp van een computer beeldbewerkingssoftware, door het schatten van de ruimte van de teen. Dit doen door een streep rond de rand van de clip van de teen, en hebben het imaginggebied van de schatting software binnen de vorm. Dan dat gebied te vermenigvuldigen met pi (3.14), die zal bij benadering van de oppervlakte van het monster van de huid 3-dimensioneel (lengte x doorsnede (pi x diameter) geeft de buitenste oppervlakte van een buis).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De caspase-3/7-bepaling uit te voeren.<ol>
<li>Voeg in een 384 goed luminescentie plaat, 10 µL van verkrijgbare caspase-3/7 reagens en 10 µL van eiwit extract. Elk monster in drievoud worden uitgevoerd.</li>
		<li>Meng de reagentia door schudden van de plaat langzaam voor 15 s. Incubate de plaat weg van licht gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meten met behulp van een verlichte afleesapparaat luminescentie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li>
<li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10393-007-0093-5">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li>
<li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chytridiomycosis%2C+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li>
<li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li>
<li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li>
<li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-1795.2007.00150.x/full">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li>
<li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li>
<li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127(2015).</li>
<li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li>
<li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen%2C+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069(2016).</li>
<li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li>
<li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li>
<li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="https://biblio.ugent.be/publication/1077693/file/1077694.pdf">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li>
<li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+skin+deep%3A+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li>
<li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li>
<li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+%28Batrachochytrium+dendrobatidis%29+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li>
<li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort%3A+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li>
<li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li>
<li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+A+%22Laboratory+Histopathology%3A+A+Complete+Reference%22">Laboratory Histopathology: A Complete Reference</a>. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).</li>
<li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Verkenden we epidermale apoptosis en dood van de cel als een potentiële mechanisme van de pathologie van de dodelijke ziekte chytridiomycosis of een mechanisme van ziekteresistentie bij Bd vatbare soorten. We gebruikten twee methoden voor de beoordeling van de dood van de cel in de opperhuid, TUNEL assay voor in situ epidermale cell death analyse en caspase-3/7 assay voor het toezicht op de epidermale celdood tijdens de voortgang van de infectie. Wij vonden dat celdood en apoptosis worden gecorreleerd m...

Amfibieën zijn momenteel een de grootste verlies van mondiale biodiversiteit van alle gewervelde taxa1. Een belangrijke oorzaak van deze daling is de fatale huid ziekte chytridiomycosis, veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis, Bd2. Het pathogene agens oppervlakkig infecteert de epidermis, die kan leiden tot verstoring van de functie van de huid leidt tot ernstige elektrolyt verlies, hartstilstand en overlijden3. Verschillende potentiële gastheer immuun mechanismen tegen Bd worden momenteel bestudeerd, zoals antimicrobiële peptiden4,5, cutane bacteriële flora6, immuun cel receptoren7,8, en lymfocyt activiteit9,10. Echter onderzoeken weinig studies of epidermale apoptosis en cel dood een immuun mechanisme tegen dit dodelijke pathogenen is.
Celdood, apoptosis (geprogrammeerde celdood) of necrose (unprogrammed dood), in de epidermis mogelijk een pathologie van Bd infectie. Vorige onderzoek suggereert dat Bd infectie apoptosis veroorzaken kan, omdat verstoring van de intracellulaire kruispunten wordt waargenomen wanneer huid explantaten zijn blootgesteld aan Zoöspore supernatant in vitro11. Bovendien, degeneratieve epidermale veranderingen in Bd-besmette kikkers zijn waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie12,13. Transcriptomic analyses geven aan dat apoptosis trajecten upregulated in geïnfecteerde huid14 zijn, en wormsalamanders splenocytes ondergaan apoptosis wanneer ze worden blootgesteld aan Bd supernatant in vitro15. Ondanks de groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat Bd kan veroorzaken cel apoptosis en de gastheer dood in vitro, in vivo studies die onderzoeken of het kwantificeren van apoptosis mechanismen door de progressie van de infectie ontbreken. Het is verder onbekend, gebruikt de host dit apoptosis als een defensieve immuun strategie ter bestrijding van Bd infectie of apoptosis is een pathologie van ziekte.
In deze studie, we gericht op het detecteren van epidermale celdood en apoptosis in besmette dieren in vivo met behulp van twee methoden: caspase-3/7 eiwit assay en terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ assay. Zoals elke bepaling verschillende aspecten van cel dood16 detecteert, samen deze methoden geven een volledig inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij de dood van de cel en zorgen voor een nauwkeurige meting van het effect. Het caspase-3/7-assay kwantificeert de activiteit van effector caspases 3 en 7, waarmee kwantificering van zowel de intrinsieke en extrinsieke apoptosis trajecten. In tegenstelling, detecteert de TUNEL assay fragmentatie van DNA, die wordt veroorzaakt door cel dood mechanismen, met inbegrip van apoptosis, necrose en pyroptosis17. We gebruiken de TUNEL bepaling te onderzoeken van de locatie van de dood van de cel binnen de epidermis van zowel klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van drie verschillende huid secties: het dorsum, de venter en de dij van Pseudophryne corroboree. Deze methode geeft de anatomische site van celdood, evenals de locatie binnen specifieke epidermale lagen onderscheid te maken. Vervolgens gebruiken we de caspase-3/7-bepaling uit te voeren een tijd serie kwantificering van apoptosis in een 8-weekse infectie in Litoria verreauxii alpina. We nemen teen tip monsters twee weken uit dezelfde dieren en zijn in staat om pathogenen infectie belasting correleren met caspase-3/7 activiteit.

<table><tbody><tr><td>POLARstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Luminescent plate reader</td></tr><tr><td>384 well flat clear bottom plate</td><td>Corning</td><td>3707</td><td></td></tr><tr><td>384 well low flange white flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacteriologisch (Oxoid)</td><td>Fisher</td><td>OXLP0011B</td><td></td></tr><tr><td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Fisher</td><td>6764254</td><td></td></tr><tr><td>Lactose Broth (Oxoid)</td><td>Fisher</td><td>OXCM0137B</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricane-S (MS-222)</td><td>Fisher</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Invitrogen</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Steriele rayon swab</td><td>Medical Wire &amp; Equipment</td><td>MW-113</td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bradford reagent</td><td>Pierce</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Caspase Glo&nbsp; 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1374248-1G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin hydrolysaat Enzymatic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0262</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)</td><td>Thermo/Life</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Prepman</td><td>Thermo/Life</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Clorox bleekmiddel</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Scan fluorescente microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Fluorescent microscope</td></tr><tr><td>3.2mm roestvrij staal kralen</td><td>BioSpec</td><td>11079132SS</td><td></td></tr><tr><td>Primer ITSI-3 Chytr (5&prime;-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Individueel ontwerp voor primers en sonde</td></tr><tr><td>Primer 5.8S Chytr (5&prime;-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Individueel ontwerp voor primers en sonde</td></tr><tr><td>Minor groove binder sonde Chytr MGB2(5&prime;-CGAGTCGAAC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Individueel ontwerp voor primers en sonde</td></tr><tr><td>Rotor-Gene qPCR Instrumenten</td><td>Qiagen</td><td></td><td>qPCR machine</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>02-681-372</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture petri schotels</td><td>Nunc</td><td>263991</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadBeater Zirconia-Silicaat Beads, 0,5 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105Z</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van terminal transferase-gemedieerde dutp testen nick einde-etikettering (tunel) en caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Amfibieën ondervinden een groot verlies aan biodiversiteit wereldwijd en een van de belangrijkste oorzaken is de chytridiomycosis van infectieziekten. Deze ziekte wordt veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis (Bd), die infecteert en verstoort kikker epidermis; echter, pathologische veranderingen hebben niet expliciet gekenmerkt. Apoptose (geprogrammeerde celdood) kan kan worden gebruikt door ziekteverwekkers te beschadigen gastheer weefsel, maar ook een mechanisme van de gastheer van ziekteresistentie voor pathogen verwijdering. In deze studie, kwantificeren we epidermale celdood van besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van twee verschillende testen: terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) en caspase-3/7. Gebruik van ventrale, dorsal, en dij huidweefsel in de TUNEL assay, we observeren cel dood in de epidermale cellen in situ van klinisch besmette dieren en celdood vergelijken met niet geïnfecteerde dieren met behulp van fluorescentie microscopie. Om te bepalen hoe apoptosis niveaus in de epidermis veranderen in de loop van infectie we Verwijder teen-tip monsters twee weken over een 8-weekse periode en gebruik een caspase-3/7-assay met uitgepakte eiwitten te kwantificeren activiteit binnen de monsters. Wij vervolgens correleren caspase-3/7 activiteit met infectie belasting. De TUNEL assay is handig voor lokalisatie van cel dood in situ, maar is duur en tijd intensieve per monster. Het caspase-3/7-assay is efficiënt voor grote steekproeven en tijd cursus experimenten. Omdat kikker teen tip biopsieën klein zijn echter er beperkt extract beschikbaar voor monster normalisatie via eiwit kwantificering methoden, zoals de analyse van Bradford. Daarom is het raadzaam het schatten van de totale oppervlakte van de huid door middel van fotografische analyse van Teen biopsieën om extracten te consumeren tijdens monster normalisatie.

TUNEL Assay
Er waren meer TUNEL positieve cellen in de besmette dieren dan in de niet-geïnfecteerde controledieren. De locatie in situ van TUNEL positieve cellen verschilden besmet en controledieren. In controledieren was er een gelijkmatige verdeling van TUNEL positieve cellen gedurende de dermale en epidermale huid lagen op een laag niveau (Zie figuur 1A), maar in de geïnfecteerd...

We kwantificeren epidermale celdood in kikkers met chytridiomycosis met twee methoden. Ten eerste, we gebruiken terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ histologie om verschillen tussen klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren te bepalen. Ten tweede, wij voeren een tijdreeksanalyse van apoptosis over infectie met behulp van een caspase-3/7 eiwit analyse.

Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Het algemene doel van dit experiment is om de invloed van de amfibische schimmelpathogeen batrachochytrium dendrobatidis op apoptose en celdood in het epifyseweefsel van kikkers te observeren. Deze methode kan ons helpen om dierziekten zoals dierlijke ziekten te begrijpen, zoals of infectie celdood veroorzaakt of, omgekeerd, of er immuunmechanismen tegen infectie zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd op kleine weefselbiopsiemonsters, zodat kleine individuen herhaaldelijk kunnen worden bemonsterd tijdens het verloop van de infectie.Om met deze procedure te beginnen, bereidt u hydrofiele glazen schuifjes met monsterweefsel voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de weefselsecties te deparaffineren, wast u de schuifjes drie keer gedurende vijf minuten met xyleen in een Coplin-pot. Was daarna de schuifjes twee keer gedurende vijf minuten met 100% ethanol.Was daarna de schuifjes met 95% ethanol en 70% ethanol gedurende drie minuten. Was vervolgens de schuifjes eenmaal met PBS gedurende vijf minuten. Om experimentele en negatieve controle-schuifjes voor te bereiden, behandel de weefsels voor met vers verdunde proteinase K die rechtstreeks op de schuifjes wordt toegevoegd.Bewaar de schuifjes gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuifjes twee keer gedurende twee minuten met PBS. Om positieve controle-schuifjes voor te bereiden, behandel de weefsels met DN-buffer en bewaar de schuifjes gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Los hierna DNase één op in DN-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 microgram per milliliter. Voeg de voorbereide DNase-oplossing toe aan de schuifjes. Bewaar de schuifjes gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.Was vervolgens de schuifjes met gedestilleerd water in een Coplin-pot vijf keer gedurende drie minuten. Doe de reactie uit in 3% waterstofperoxide in PBS gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuifjes twee keer gedurende twee minuten met PBS.Voeg vervolgens evenwichtsbuffer toe aan het weefsel op de schuifjes. Bewaar gedurende 10 seconden op kamertemperatuur. Tik vervolgens het overtollige vocht rond de weefselsectie af.Verdun terminaal deoxynucleotidyl transferase-enzym in reactiebuffer. Voeg het vervolgens toe aan het weefsel op de experimentele en positieve controle-schuifjes. Bewaar in een bevochtigde kamer gedurende één uur op 37 graden Celsius.Plaats de schuifjes vervolgens in een Coplin-pot met de werkconcentratie van stopbuffer. Schud gedurende 15 seconden en bewaar de schuifjes gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuifjes drie keer gedurende één minuut met PBS en tik het overtollige vocht af.Voeg vervolgens het anti-digoxigenine-conjugaat toe, voorverwarmd tot kamertemperatuur, rechtstreeks op het weefsel. Bewaar de schuifjes gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in een bevochtigde donkere kamer. Was na de bewaarperiode de schuifjes vier keer gedurende twee minuten met PBS.Tik eventueel overtollig vocht af. Voeg vervolgens montagemedium toe aan de schuifjes. Voeg 15 microliter DAPI-oplossing toe aan het montagemedium op de schuifjes.Bedek elke schuif met een dekglas en verzegel met nagellak. Laat de schuifjes in het donker drogen. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de schuifjes onmiddellijk na voltooiing van het staande proces te observeren.Neem foto's op 400 keer in willekeurige intervallen langs elke huidsectie. Tel de DAPI-gekleurde blauwe cellen om ervoor te zorgen dat er ten minste 100 cellen per huidsectie per dier zichtbaar zijn. Tel vervolgens het aantal TUNEL-positieve cellen die verschijnen als rode enkele cellen met duidelijke celranden.Gebruik om te beginnen een omgekeerde lichtmicroscoop met een vergroting van 40 keer om een foto te maken van elk van de tenen van de kikker. Teken lijnen rond de rand van de teenclip en gebruik beeldverwerkingssoftware om de oppervlakte binnen de vorm te schatten. Om het oppervlak van het driedimensionale huidmonster te evalueren, vermenigvuldigt u de geschatte oppervlakte met pi.Om eiwitten uit een bevroren kikkerteenmonster te extraheren, plaatst u het monster in een microcentrifugebuisje met schroefdop van 1,5 milliliter dat 100 microliter monsterbuffer en twee roestvrijstalen kralen bevat. Gebruik een bead beater op maximale snelheid om de cellen te lyseren. Plaats vervolgens de buis op ijs gedurende drie minuten.Centrifugeer vervolgens de buis om het supernatant te verzamelen. Om de caspase 3/7-assay uit te voeren in een 384-wellsplaat, voegt u 10 microliter monsterbuffer toe als blanco en 10 microliter eiwitextract in drievoudige. Pipetteer vervolgens 10 microliter commercieel verkrijgbaar caspase 3/7-reagens naar het eiwitextract en de blanco putjes.Schud vervolgens de plaat zachtjes gedurende 15 seconden om de twee reagentia te mengen. Bewaar gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in het donker. Gebruik vervolgens een lichtmetende plaatlezer om de luminescentie van het monster te meten.In deze studie tonen de geïnfecteerde dieren significant meer TUNEL-positieve cellen in vergelijking met controledieren, zoals geïllustreerd door rode of roze gekleurde cellen. Bij controledieren zijn er weinig TUNEL-positieve cellen en ze zijn niet geconcentreerd in de epidermis. Bij geïnfecteerde dieren zijn de TUNEL-positieve cellen frequenter in de epidermis.TUNEL-positieve cellen zijn meer geconcentreerd op en direct naast de plaatsen van geïnfecteerde cellen. Ook zijn er meer wijdverspreide TUNEL-positieve cellen over de epidermis en in epidermale lagen die dieper zijn dan waar de schimmelpathogeen verbleef. Bij geïnfecteerde dieren zijn er meer TUNEL-positieve cellen in alle drie de huidtypes met een bijzonder hoog niveau in

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.

Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo&#39;s en differentiëren van embryonale stamcellen

In this video, the TUNEL assay is performed to detect the presence of apoptotic cells in a sample. The study involves using a special DNA polymerase - terminal deoxynucleotidyl transferase - that catalyzes the addition of labeled dUTPs to the 3' terminus of fragmented DNA, which can be observed and identified under a fluorescence microscope.

Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling&#8212;TUNEL Assay: An In Situ Method to Detect DNA Fragmentation in Apoptotic Cells

This video describes an in vitro Caspase-3/7 luminescent assay to quantify cell death or apoptosis. The assay measures luminescence produced following caspase-3/7 cleavage of a pro-luminescent DEVD substrate. The luminescence generated is proportional to caspase-3/7 activity.

Caspase-3/7 Assay: A Luminescence-Based Assay to Quantify Apoptosis by Measuring Caspase-3/7 Activities in Frog Skin Explants

Bepaalde genetische verstoringen of blootstelling aan toxines kunnen normale ontwikkelingsprocessen verstoren, wat leidt tot de dood van specifieke celtypen. De analyse van geactiveerde Caspase 3 door middel van immunofluorescence in zijn geheel in zebrafish embryo's onthult een stadium- en weefselspecifieke lokalisatie van cellen die specifiek apoptose ondergaan.

Analyse van Apoptose in Zebravis Embryo's door middel van Whole-mount Immunofluorescentie om Geactiveerd Caspase 3 te Detecteren

Batrachochytrium dendrobatidis infectie bij amfibieën kan worden geëlimineerd met behulp van een verminderde concentratie (0.0025%) en de kortere duur (vijf minuten baden voor zes dagen) van itraconazol dan algemeen wordt gebruikt. Minder sterfte en minder negatieve bijwerkingen werden waargenomen met behulp van deze aangepaste behandeling protocol.

Verminderde Itraconazol Concentratie en duur succesvol zijn in het behandelen van<em&gt; Batrachochytrium dendrobatidis</em&gt; Infectie in Amfibieën

Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectioenering en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muis skeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-geautomatiseerde analyse van TUNEL-labeling.

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

We beschrijven een high-throughput colorimetrische test die β-galactosidase-activiteit meet in drie levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas. Deze test kan worden gebruikt om trypanocidale verbindingen op een eenvoudige, snelle en reproduceerbare manier te identificeren.

In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

Leer TUNEL en caspase-3/7 analyse om apoptose in kikkerhuid te meten bij chytridiomycose-infectie. Deze methode helpt onderzoekers celdood te kwantificeren in kleine weefselmonsters.

Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis (Video) | JoVE Journal

Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis

Meer video's verkennen