Name: Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een efficiënte methode voor co-expressie van meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten met één expressieplasmide. Deze techniek vereenvoudigt eiwitonderzoek in planta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van het laboratorium van de Wang voor nuttige discussies en opmerkingen. Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, subsidie nr. 31570001) en de Natural Science Foundation van de Guangdong provincie en Guangzhou stad (nr. 2016A030313401 en 201707010024) aan H.W.

1. primer Design strategie en versterking van DNA
<ol><li>De inleidingen voor het moleculaire klonen van DNA-fragmenten te ontwerpen. De inleidingen bestaat uit 20 bp gene specifieke bindende sequenties en 20 tot 25 bp 5'-eind overstek sequenties, die de complementaire overlappende volgorde van aangrenzende DNA moleculen zijn (Zie tabel 1 bijvoorbeeld). Opmerking: De daaropvolgende vergadering van elk DNA fragmenten, koppeling van verschillende eiwit expressie cassettes, en integratie met de uiteindelijke expressie vector alle afhangen van erkenning van de aangrenzende overlappende sequenties.</li>
	<li>Versterken van de fragmenten van DNA, met inbegrip van de promotor, fluorescerende verslaggever, doel-gen en terminator, die noodzakelijk voor de bouw van de semi-onafhankelijke eiwit expressie cassettes door standaard PCR reacties met hun bijbehorende inleidingen en hoge zijn trouw polymerase. Opmerking: De sjablonen in deze studie gebruikt voor de versterking van DNA worden afgeleid van eerdere studies15,-22,23. De onthardende temperatuur en tijd van de uitbreiding van de PCR reacties zijn primer en gene afhankelijk.</li>
</ol>2. DNA Fragment assemblage en bouw van eiwit expressie Cassettes
<ol><li>De kwaliteit van de eerste ronde PCR producten door de Elektroforese van het DNA te onderzoeken en kwantificeren door spectrofotometer. Controleer of DNA afbraak en verontreiniging door 1% agarose de Elektroforese van het gel zijn opgetreden. De OD260/OD280 van de PCR producten moet tussen de 1.6 en 1.8.</li>
	<li>Mix van verschillende DNA-fragmenten (0.05 - 0.1 pmol voor elk fragment) in een nieuwe PCR-buis tot een eindvolume van 5 µL. Opmerking: Mix DNA moleculen ontworpen voor de hetzelfde eiwit expressie cassette samen in één PCR buis. Vermijd mengen ANI van verschillende expressie cassette samen, aangezien het zal verminderen de efficiency van DNA vergadering als gevolg van de toenemende aantallen DNA-moleculen die moeten worden gekoppeld. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
	<li>Bereiden van 5 x ISO voorraad buffer: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM dithiothreitol; 25% polyethyleenglycol (PEG) 8000; en 5 mM nicotinamide adenine dinucleotide (NAD).</li>
	<li>Vul 1 mL 2 x master mengsel van 400 µL 5 x ISO voorraad buffer, 7,5 eenheden voor T5 exonuclease 62,5 eenheden van HiFi-polymerase van DNA, 5.000 eenheden van Taq polymerase (Zie Tabel of Materials), en gesteriliseerde dubbel gedestilleerd H2O. Opmerking: Dit is aangepast van eerdere studies24,25,26; deze volumes moeten worden geoptimaliseerd.</li>
	<li>Aliquot 100 µL van 2 x master mengsel per buis en winkel bij-20 ° C. Let op: Vaak bevriezen en ontdooien van 2 x master mengsel kunnen leiden tot lage DNA vergadering efficiëntie.</li>
	<li>Voeg 15 µL van 2 x master mengsel aan de 5 µL DNA mengsel en Incubeer bij 50 ° C gedurende 60 minuten.</li>
</ol>3. bouw van de Vector voor co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten in planten
<ol><li>Versterken van de gehele semi-onafhankelijke eiwit expressie cassette door een tweede-ronde-PCR met behulp van het product (0,5 - 1,0 µL) uit de eerste ronde isothermische vergadering reactie als de sjabloon en de ultraperifere inleidingen (bijvoorbeeld 1-FP35S en 1-RNOS voor expressie cassette 1).<ol>
<li>Gebruik 1 eenheid van polymerase van de high-fidelity in een volume van 50 µL reactie gevolgd door 30 cycli (94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, en 68 ° C gedurende 2 minuten), gevolgd door een definitieve verlenging bij 68 ° C gedurende 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Linearize de definitieve eiwit expressie ruggengraat vectoren pUC18 en pCAMBIA1300, die zijn ontworpen voor voorbijgaande eiwituitdrukking en genetische transformatie, respectievelijk door 4 eenheden Sma toe te voegen ik in een eindvolume 10 µL reactie en drachtige voor 1 - 2 hr bij 25 ° C. Inactivering van het beperkingsenzym door broeden bij 65 ° C gedurende 20 min.</li>
	<li>Meng mengsel DNA moleculen van eiwit expressie cassettes en gelineariseerde definitieve vector in een volume van de uiteindelijke reactie van 5 µL. Voer vervolgens de tweede-ronde-DNA-recombinatie door het te mengen met 15 µL 2 x master buffer en incuberen bij 50 ° C gedurende 60 minuten.</li>
	<li>De eindproducten van de reactie van tweederonde-isotherme recombinatie kunt transformeren bevoegde E. coli cellen (bijvoorbeeld DH5α) volgens standaardprocedures27. Controleer of u positieve kolonies door PCR en DNA sequentiebepaling van de kolonie. Pak de positieve plasmiden uit de E. coli met behulp van een mini plasmide extractie kit en opslaan bij-80 ° C. Let op: Voor langdurige opslag, plasmiden opgelost in TE buffer of dubbel gedestilleerd H2O zijn stabieler dan houden ze in E. coli stammen.</li>
</ol>4. Biolistic-bombardement gemedieerde voorbijgaande co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten in planten
<ol><li>Tabak BY-2 schorsing cellen en Arabidopsis jonge planten voorbereiden door bombardement.<ol>
<li>Cultuur BY-2 cellen in Murashige en Skoog (MS) medium door subcultuur tweemaal per week bij 25 ° C in een shaker vastgesteld op 130 rpm. Verzamelen 30 mL 3 d gekweekt door-2 cellen op een stuk van 70 mm gesteriliseerde met autoclaaf filtreerpapier via een vacuümpomp filteren door de vacuüm druk op 40 mbar.</li>
		<li>Om te voorkomen dat de cellen uitdrogen tijdens de volgende stappen uit, voeg enkele druppels BY-2 cel culturele vloeistof in een petrischaal alvorens het koffiefilter (volgende stap).</li>
		<li>Overbrengen in het filtreerpapier met de BY-2 cellen daarop een nieuwe petrischaal (85 mm x 15 mm).</li>
		<li>Oppervlak steriliseren Arabidopsis thaliana (Col-0) zaden in vortexing een mengsel met 70% (v/v) ethanol met 0,05% Tween 20 gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Spin down de zaden met behulp van een bank top centrifuge op max snelheid voor 2 s, verwijder het supernatant en wassen van de zaden met 100% ethanol eens voor 30 s. Pipet uit de zaden op een nieuwe steriele filtreerpapier in een steriele kap. Vervolgens drogen van de zaden en verspreid hen op ½ MS agar platen.</li>
		<li>Opslaan van de platen bij 4 ° C gedurende 48 uur vóór het overbrengen van hen naar een plant groei kamer met de volgende instellingen: 16 h 8 h donker licht met 120-150 µm m-2 s-1 intensiteit, 22 ° C.
</li>
		<li>Pipetteer 7 - dagen oude planten van het monster in een cirkel met een diameter 30 mm in het midden van een nieuwe ½ MS middelgrote plaat aan de verhoging van de efficiëntie van bombardementen. Let op: Vermijd overlapping van de planten bij overdracht en brengen ze naar de nieuwe plaat van de ½ MS.</li>
		<li>Voeg enkele druppels ½ MS vloeistof op het oppervlak van de planten of de weefsels te behouden vocht en te voorkomen dat het drogen van de planten uit tijdens de volgende stappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jas gouddeeltjes met plasmide DNA.<ol>
<li>Vortex gouden microcarrier oplossing grondig, voor 3 min. bereiden een nieuwe 1,5 mL-buis.</li>
		<li>Sequentieel toevoegen de volgende oplossingen in de buis en de vortex: 25 µL (1,5 mg) gouden deeltjes, vortex 10 s; 10 µL van 25.46 mg/L spermidine, vortex 10 s; 5 µL van 1µg/µL plasmide DNA, vortex 3 min; 25 µL van 277.5 mg/L CaCl2 oplossing, vortex 1 min. Let op: Houd vortexing tijdens deze stap.</li>
		<li>Spin down de gouden microcarriers met behulp van een bank top centrifuge op max snelheid voor 5 s en zorgvuldig Pipet uit het supernatant zonder de pellet te verstoren. Wassen met 200 µL van absolute ethanol en resuspendeer de pellet door vortex voor 5-10 s. Spin down bij max snelheid voor 5 s en verwijder de ethanol.</li>
		<li>Resuspendeer de gouddeeltjes in 18 µL van absolute ethanol en aliquoot 6 µL deeltjes schorsing op het midden van drie macrocarriers. Laat ze droge lucht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetteer DNA in planten via deeltje bombardement.<ol>
<li>Instellen van het uitvoeringssysteem deeltje als volgt: 1100 psi, 28-mm Hg vacuüm, 1 cm tussenruimte afstand en 9 cm deeltje vlucht afstand.</li>
		<li>De cellen/planten op de middellange agarplaat bombarderen voor driemaal op drie verschillende posities en vervolgens houden de cellen/planten in donker onmiddellijk na het bombardement. Let op: Draag veiligheidsbril wanneer het besturingssysteem deeltje levering wegens de vereniging van hogedruk gas en hoge snelheid deeltjes met het systeem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Houd gebombardeerd cellen/planten in het donker in de zaal van de plant groei gedurende 6 tot 72 uur vóór observatie van fluorescerende signalen. De plant groei kamer ingesteld op 24 h donker en 22 ° C. Let op: De efficiëntie van de expressie en fluorescent signaal intensiteit zijn promotor-, gen- en plant/weefsel-afhankelijk.</li>
</ol>5. generatie van stabiele transgene Arabidopsis mede uiting van meerdere chimeer fluorescente proteïnen door Agrobacterium-gemedieerde transformatie.
<ol><li>De Agrobacterium bevoegde cellen (PMP90) op ijs ontdooien en 30 min wachten, dan 2 µL binaire vector (100-200 ng) (bereid boven) in de bevoegde cellen toevoegen. Het mengsel zitten op het ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Breng het mengsel in een vooraf gekoeld 0,1 cm electroporation cuvette. Cuvette invoegen het electroporation-systeem en het uitvoeren van electroporation met de volgende instellingen: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.</li>
	<li>Voeg 1 mL SOC vloeistof in de meetcel onmiddellijk na de electroporation, Pipetteer van de cellen in een nieuwe 1,5 mL-buis en Incubeer bij 28 ° C in een horizontale roteerschudapparaat bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 120 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 2348 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, negeren van de meerderheid van de bovendrijvende substantie, zachtjes resuspendeer de Ingehuld cellen met een pipet tip, verspreiden ze op een bord van de LB met 50 mg/L Hygromycin B en Incubeer bij 28 ° C gedurende 2-3 dagen.</li>
	<li>Arabidopsis thaliana Col-0 planten met de Agrobacterium, waarin de pCAMBIA1300 van de binaire vector geïntegreerd met meerdere eiwit expressie cassettes, door de methode28 floral duik zoals eerder is beschreven om te transformeren stabiele transgene planten te genereren.</li>
	<li>Het oppervlak van de transgene Arabidopsis zaden steriliseren door hen te vermengen met 70% (v/v) ethanol met 0,05% Tween-20. Vortex voor 10 min. Spin down de zaden met behulp van een bank top centrifuge op max snelheid voor 2 s, verwijder het supernatant en wassen van de zaden met 100% ethanol eenmaal voor 30 s.</li>
	<li>Pipetteer uit de zaden op een steriele filtreerpapier in een steriele kap. Daarna, droge lucht en verspreid hen op ½ MS agar borden met Hygromycin B voor het screenen van positieve nakomelingschap.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 4 ° C voor 2 dagen. Dan, ze vervolgens overbrengen naar de plant groei kamer en cultuur voor 7 dagen.</li>
	<li>Selecteer 7 - dagen oude overleving jonge planten door te controleren voor fluorescerende signalen onder de fluorescente microscoop, en breng de planten in de bodem voor verdere screening van homozygoot planten.</li>
</ol>6. farmaceutische behandelingen
<ol><li>Voor farmaceutische behandelingen, Verdun elk medicijn in vloeibare MS middellange tot haar juiste werken concentraties voordat incubatie met cellen of planten.<ol>
<li>Wortmannin behandeling: bereiden van 1 mM voorraadoplossingen van wortmannin door het oplossen van wortmannin poeder in DMSO en opslaan van de voorraden bij-20 ° C. Pipetteer van plantencellen of jonge planten in de vloeistof van MS met 16,5 µM wortmammin en incubeer gedurende 30-45 min vóór imaging.</li>
		<li>Brefeldin A (BFA) behandeling: bereiden van 1 mM stamoplossingen van de BFA door ontbinding van de BFA poeder in DMSO en opslaan van de voorraden bij-20 ° C. Pipetteer plantencellen of jonge planten in de vloeistof van MS met 10 µg/mL BFA voor 30-45 min vóór imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. confocal microscoop beeldvorming en Eiwit Subcellular Localisatie van co-analyse
<ol><li>Breng de jonge planten of schorsing cellen op een conventionele glasplaatje en zachtjes zetten een dia deksel boven voor beeldvorming door standaard confocale laser scanning microscopie. Gebruik de volgende instellingen: 63 X water doelstelling (N.A 1.4), 0 achtergrond 700 winst, 0.168 mm pixelgrootte en fotomultiplicator buis detector. Excite GFP-gelabelde proteïnen op 485 nm en detecteren van fluorescentie bij 525 nm. Voor RFP-gelabelde proteïnen, prikkelen op 514 nm en op 575 te sporen nm.</li>
	<li>Het berekenen van de verhouding van de mede-localisatie van fluorescerende signalen met behulp van Image J software (https://imagej.nih.gov/ij/) met de Pearson-Spearman correlatie (PSC) mede lokalisatie plug-in als eerder beschreven8. Correlatiecoëfficiënten van Pearson of Spearman de rangschikking correlatiecoëfficiënten worden weergegeven in de resultaten (Figuur 4). De geproduceerde r-waarden zullen vanaf -1 op 1. 0 toont geen detecteerbare correlatie van twee signalen, overwegende dat + 1 en -1 show vol positieve en negatieve correlatie, respectievelijk, van twee signalen.</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+machinery+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li>
<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Expression+Systems+in+Plants%3A+Potentialities+and+Constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246(2017).</li>
<li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method%3A+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li>
<li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization%2C+movement+and+interactions+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li>
<li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li>
<li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression%2C+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218(2014).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li>
<li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+red+fluorescent+protein+eqFP611%3A+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptors+%28VSRs%29+and+secretory+carrier+membrane+proteins+%28SCAMPs%29+are+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptor+%28VSR%29+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li>
<li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Biotechnological+Equipment%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li>
<li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li>
<li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li>
<li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated%2C+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li>
<li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells%3A+evidence+for+two+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li>
<li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression%2C+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus%2C+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li>
<li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+gene+silencing+regularized%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li>
<li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li>
<li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li>
<li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+for+all%3A+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071(2017).</li>
<li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li>
<li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+%26%2334%3Bpurple+endosperm+rice%27%27+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Development of &#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li>
<li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+formation%2C+evolution%2C+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben wij een nieuwe methode om te krachtig drukken mede chimeer fluorescerende fusion eiwitten in planten aangetoond. Het kan worden gebruikt voor zowel voorbijgaande expressie en genetische transformatie en is compatibel met de huidige TL proteïne gebaseerde bio-imaging, moleculaire en biochemische toepassingen en technologieën9,10,13 . Bovendien, overwint het de problemen van de conventionele methoden die gebruikmaken v...

Chimeer fluorescerende fusion eiwitten werden beschouwd als een nuttig instrument te bestuderen van intracellulaire dynamiek en subcellular localisatie en verder begrijpen hun fysiologische functies en werkende mechanismen1,2, 3 , 4. het is vooral gunstig voor Co express bekende organel verslaggever eiwitten met het eiwit in kwestie beter illustreren de spatio grondgedachte, distributie en functie (s) binnen het endomembraansysteem in cellen4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Een chimeer fluorescerende fusieproteïne kan worden uitgedrukt in planten via voorbijgaande expressie en stabiele genetische transformatie, die hun respectieve voordelen en beperkingen9,10,11 hebben. Voorbijgaande uitdrukking van een eiwit is een handige aanpak waarin biolistic bombardement-, polyethyleenglycol (PEG)-, of electroporation-gemedieerde DNA voorbijgaande expressie in protoplasten en Agrobacterium-gemedieerde blad infiltratie in intact plantencellen, zoals weergegeven in figuur 1A, B12,13,14,15,16. Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in een enkele plant cel vereist echter een mix van verschillende onafhankelijke expressie plasmiden. De nadelen van het gebruik van meerdere plasmiden voor co eiwituitdrukking in planten zijn dus lagere CO expressie toe te schrijven aan de sterk verminderde kans op verschillende plasmiden gelijktijdig invoeren dezelfde cellen in vergelijking met een enkele plasmide, en de varianten van eiwit expressie niveaus veroorzaakt door het ongecontroleerd willekeurige hoeveelheid elke soorten plasmide wordt overgebracht in de cel17,18. Bovendien is het technisch uitdagend te introduceren van verschillende onafhankelijke expressie plasmiden in een enkele Agrobacterium voor eiwit co expressie9,10,11. Daarom Agrobacterium-gemedieerde eiwit voorbijgaande expressie door infiltratie van tabak verlaat is alleen geschikt voor het uitdrukken van een plasmide tegelijk, zoals weergegeven in figuur 1B. In tegenstelling, wordt generatie transgene planten uiting van fluorescerende fusion eiwitten gewoonlijk bereikt door Agrobacterium die een binaire transformatie-vector draagt. De binaire vector die de genenoverdracht en inbrengen in het genoom van de plant bemiddelt is echter alleen geschikt voor het uitdrukken van een enkele fluorescerende fusion eiwit (figuur 1B)9,10,12. Het genereren van een transgene plant die gelijktijdig verschillende chimeer fluorescente proteïnen uitdrukt vereist meerdere rondes van genetische kruising en screening, die kan maanden tot jaar afhankelijk van de nummers van de genen tot duren samen uitgedrukt worden.
De werkgelegenheid die de speerpunt van een enkele uitdrukking voor co expressie van meerdere eiwitten in de plant is gemeld door verscheidene vorige studies2120,19,. Meerdere rondes van de enzymatische spijsvertering en DNA Afbinding van DNA moleculen en ruggengraat vectoren zijn echter meestal vereist voor generatie van de definitieve plasmide voor co eiwituitdrukking of overmatige expressie. Hier hebben we een nieuwe en robuuste methode voor het uitdrukken van meerdere chimeer fluorescente proteïnen in planten samen ontwikkeld. Het is een zeer efficiënte en handige methode die meerdere co eiwituitdrukking in planten voor zowel voorbijgaande expressie en stabiele transformatie in een aloude mode behaalt. Het maakt gebruik van een enkele vector die meerdere functioneel onafhankelijk eiwit expressie cassettes voor co eiwituitdrukking bevat en daardoor ondervangt de nadelen van de conventionele methoden. Bovendien, het is een zeer veelzijdig systeem waarin DNA manipulaties en vergadering worden bereikt door een eenvoudige one-step geoptimaliseerd reactie zonder extra stappen van DNA spijsvertering en afbinding. Het werkingsprincipe is geïllustreerd in Figuur 2. Bovendien, het is volledig compatibel met de huidige cellulaire, moleculaire en biochemische benaderingen die zijn gebaseerd op chimeer fluorescerende fusie-eiwitten.

<table><tbody><tr><td>KOD-FX Polymerase</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold microcarrier particles</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &micro;m</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarriers</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Rupture disk</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>Stopping screen</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He particle delivery system</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780&amp;7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 Power Supply</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agrose</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetie Acid</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

co expressie van meerdere chimeer fluorescerende fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Informatie over de spatio subcellular localization(s) van een eiwit is kritiek te begrijpen zijn fysiologische functies in cellen. Fluorescente proteïnen en generatie van fluorescerende fusion eiwitten zijn wild gebruikt als een effectief instrument te visualiseren direct het eiwit lokalisatie en de dynamiek in de cellen. Het is vooral nuttig om ze te vergelijken met bekende organel markeringen na co expressie met de proteïne van belang. Toch klassieke benaderingen voor co eiwituitdrukking in planten meestal sprake van meerdere onafhankelijke expressie plasmiden, en daarom hebben nadelen die lage co expressie efficiëntie, expressie-niveau variatie en hoog tijd bevatten uitgaven in genetische oversteken en screening. In deze studie beschrijven we een robuuste en nieuwe methode voor co expressie van meerdere chimeer fluorescente proteïnen in planten. Het overwint de beperkingen van de conventionele methoden met behulp van een enkele uitdrukking vector, dat is samengesteld uit meerdere semi-onafhankelijke waarin cassettes. Elk eiwit expressie cassette bevat eigen functioneel eiwit expressie-elementen, en daarom het flexibel kan worden aangepast om te voldoen aan de vraag van de diverse expressie. Ook, het is eenvoudig en handig voor het uitvoeren van de vergadering en manipulatie van DNA fragmenten in het plasmide expressie met behulp van een geoptimaliseerde one-step reactie zonder extra spijsvertering en Afbinding stappen. Bovendien, het is volledig compatibel met de huidige TL eiwitten bio-imaging technologieën en applicaties, zoals FRET en BiFC. Als een validatie van de methode werken we dit nieuwe systeem Co express fluorescently gesmolten vacuolar sorteren receptor te secretoire vervoerder membraaneiwitten. Uit de resultaten blijkt dat hun vooruitzichten subcellular lokalisaties hetzelfde als in eerdere studies door voorbijgaande expressie zowel genetische transformatie bij planten zijn.

Hebben we een robuust en zeer efficiënte methode voor de co uitdrukking van meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten. Het doorbreekt de barrières van de conventionele benaderingen gebruikt meerdere gescheiden plasmiden voor co eiwituitdrukking, zoals weergegeven in figuur 1A, B, via voorbijgaande expressie of stabiele genetische transformatie. In deze nieuwe methode genereren we een enkele uitdrukking vector, dat is ...

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire en cellulaire plantenbiologie, zoals hoe we eiwitten in de cel kunnen uitdrukken. Het grote voordeel van deze techniek is de hoge efficiëntie van het co-expresseren van cellulaire fusie-eiwitten in één expressievector. De procedure zal worden gedemonstreerd door Guitao Zhong, een afgestudeerde student uit ons laboratorium.Om te beginnen, ontwerp de primers voor moleculaire klonering van DNA-fragmenten zoals beschreven in het tekstprotocol. Versterk DNA-fragmenten die nodig zijn voor de constructie van de semi-onafhankelijke eiwitexpressie cassettes door standaard PCR-reacties met hun corresponderende primers en hoge-fideliteit polymerase. Dit omvat de promotor, fluorescente reporter, doelgen en terminator.Bekijk de kwaliteit van de eerste ronde PCR-producten door te zoeken naar DNA-degradatie en besmetting met DNA-elektroforese met behulp van een 1% agarosegel. Kwantificeer de PCR-producten met een spectrofotometer. De verhouding tussen de metingen bij 260 en 280 nanometer van de PCR-producten moet tussen 1,6 en 1,8 liggen.Meng de DNA-fragmenten die zijn ontworpen voor dezelfde eiwitex

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Sinds de ontdekking van het groene fluorescente eiwitgen, hebben fluorescente eiwitten invloed gehad op de moleculaire celbiologie. Dit protocol beschrijft hoe expressie van verschillende fluorescente eiwitten door genetische manipulatie wordt gebruikt voor het barcoden van individuele cellen. De procedure maakt het mogelijk om verschillende populaties in een cellenmengsel te volgen, wat ideaal is voor multiplextoepassingen.

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Leer een efficiënte methode voor co-expressie van meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten met één expressieplasmide. Deze techniek vereenvoudigt eiwitonderzoek in planta.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Meer video's verkennen