Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten
1 juli 2018
We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire en cellulaire plantenbiologie, zoals hoe we eiwitten in de cel kunnen uitdrukken. Het grote voordeel van deze techniek is de hoge efficiëntie van het co-expresseren van cellulaire fusie-eiwitten in één expressievector. De procedure zal worden gedemonstreerd door Guitao Zhong, een afgestudeerde student uit ons laboratorium.
Om te beginnen, ontwerp de primers voor moleculaire klonering van DNA-fragmenten zoals beschreven in het tekstprotocol. Versterk DNA-fragmenten die nodig zijn voor de constructie van de semi-onafhankelijke eiwitexpressie cassettes door standaard PCR-reacties met hun corresponderende primers en hoge-fideliteit polymerase. Dit omvat de promotor, fluorescente reporter, doelgen en terminator.
Bekijk de kwaliteit van de eerste ronde PCR-producten door te zoeken naar DNA-degradatie en besmetting met DNA-elektroforese met behulp van een 1% agarosegel. Kwantificeer de PCR-producten met een spectrofotometer. De verhouding tussen de metingen bij 260 en 280 nanometer van de PCR-producten moet tussen 1,6 en 1,8 liggen.
Meng de DNA-fragmenten die zijn ontworpen voor dezelfde eiwitexpressie cassette samen in één PCR-buis tot een eindvolume van vijf microliter. Over het mengen van DNS uit verschillende expressie cassette gegevens. Omdat gelijkheid de efficiëntie van DNA-assemblage vermindert, vanwege het toenemende aantal DNA-moleculen die moeten worden gelinkt.
Voeg nu 15 microliter van 2x mastermix toe aan het 5 microliter DNA-mengsel en incubeer gedurende 60 minuten bij 50 graden Celsius. Versterk de volledige semi-onafhankelijke eiwitexpressie cassette door een tweede ronde PCR. Gebruik 0,5 tot één microliter van het product van de eerste ronde isotherme assemblagereactie als sjabloon in de buitenste primers.
Gebruik één eenheid van hoge-fideliteit polymerase in een 50 microliter reactievolume gedurende 30 cycli, gevolgd door een laatste extensie bij 68 graden Celsius gedurende vijf minuten. Linealiseer vervolgens de uiteindelijke eiwitexpressie backbone vector POC 18 en vector CAMBIA 1300, door vier eenheden van kleine eenheid toe te voegen aan een eindvolume van 10 microliter reactievolume. Deze vectoren zijn ontworpen voor tijdelijke eiwitexpressie en genetische transformatie.
Incubeer de restrictiedigestie gedurende een tot twee uur bij 25 graden Celsius. Na de vertering, inactiveer het restrictie-enzym door gedurende 20 minuten te incuberen bij 65 graden Celsius. Meng vervolgens equimolaire DNA-moleculen van eiwitexpressie cassettes en gelinealiseerde uiteindelijke vector tot een eind reactievolume van vijf microliter.
Voer ten slotte de tweede ronde van DNA-recombinatie uit door de reactie te mengen met 15 microliter van 2x masterbuffer en te incuberen gedurende 60 minuten bij 50 graden Celsius. Om tabak BY-2 suspensiecellen voor bombardement voor te bereiden, filter-verzamel 30 milliliter van 3-dagen gekweekte BY-2 cellen op een stuk van 70 milliliter gesteriliseerde filterpapier via een vacuümpomp, door de vacuümdruk in te stellen op 40 millibar. Voeg ondertussen enkele druppels BY-2 cellulair vloeibaar cultuurmedium toe aan een petrischaal.
Breng het filterpapier met de BY-2 cellen erop over naar de petrischaal. Om jonge arabidopsis planten voor bombardement voor te bereiden, bereid zeven-dagen-oude monsterplanten zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng ze vervolgens over naar een rechthoek in het midden van een nieuwe halfsterkte MS-mediumplaat om de efficiëntie van het bombardement te verhogen.
Zorg ervoor dat de planten niet overlappen tijdens het overbrengen en plaatsen op de plaat. Voeg enkele druppels halfsterkte MS vloeibaar medium toe aan het oppervlak van de planten of weefsels om vocht te behouden en uitdroging van de planten tijdens de resterende stappen te voorkomen. Om gouddeeltjes met plasmide-DNA te coaten, roer de goudmicrocarrier-oplossing eerst drie minuten goed door elkaar.
Voeg nu 25 microliter gouddeeltjes toe aan een nieuwe 1,5 milliliter buis en roer gedurende 10 seconden. Voeg 10 microliter van 25,46 milligram per liter spermidine toe en roer gedurende 10 seconden. Voeg vervolgens vijf microliter van één microgram per microliter plasmide-DNA toe en roer gedurende drie minuten.
Voeg tenslotte 25 microliter van 277,5 milligram per liter calciumchloride-oplossing toe en roer gedurende één minuut. Spuit de goudmicrocarriers neer met behulp van een tafelcentrifuge bij maximale snelheid gedurende vijf seconden. Na centrifugatie, pipet voorzichtig het supernatant uit zonder de pellet te verstoren.
Was vervolgens de pellet met 200 microliter absoluut ethanol en hervat het door 5 tot 10 seconden te roeren. Spuit de goudmicrocarriers weer neer bij maximale snelheid gedurende vijf seconden en verwijder het ethanol. Hervat de gouddeeltjes in 18 microliter absoluut ethanol.
Breng vervolgens zes microliter van de deeltjessuspensie aan op het midden van drie microcarriers en laat ze drogen. Om het DNA via deeltjesbombardement in de cellen en planten over te brengen, stel eerst het deeltjesleveringssysteem in zoals beschreven in het tekstprotocol. Bombardeer vervolgens de cellen of planten op de agromediumplaat drie keer op drie verschillende posities.
Houd de gebombardeerde cellen en planten gedurende zes tot 72 uur in het donker in de plantengroeikamerraam voor observatie van fluorescente signalen. Stel de plantengroeikamerraam in op 24 uur donker en 22 graden Celsius. Breng de jonge planten of suspensiecellen over naar een conventionele glazen plaatje en plaats voorzichtig een dekglas erop voor beeldvorming door standaard confocale laserscanmicroscopie.
Gebruik de instellingen die in het tekstprotocol worden vermeld, om GFP-getagde eiwitten op te wekken bij 485 nanometer en fluorescentie te detecteren bij 525 nanometer. Voor RFP-getagde eiwitten, opwekken bij 585 nanometer en detecteren bij 608 nanometer. Bereken tenslotte de collocalisatie-verhouding van fluorescente signalen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Co-expressie van arabidopsis VSR-2 en arabidopsis SCAMP4
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor de co-expressie van meerdere chimerische fluorescerende fusie-eiwitten in planten. De techniek maakt gebruik van een enkel expressieplasmide dat meerdere onafhankelijke eiwitexpressie-cassettes bevat, wat de efficiëntie van de co-expressie van eiwitten verhoogt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantaire moleculaire biologie
- Celbiologie
- Protein engineering
Achtergrond
- Conventionele methoden voor co-expressie van eiwitten in planten zijn vaak beperkt.
- Chimere fluorescente fusie-eiwitten zijn waardevol voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Efficiënte co-expressie kan complexe biologische onderzoeken faciliteren.
- Deze methode is erop gericht het proces van eiwitexpressie in plantensystemen te stroomlijnen.
Doel van de studie
- Om een efficiëntere methode te ontwikkelen voor de co-expressie van eiwitten in planten.
- Om de beperkingen van bestaande technieken voor eiwitexpressie aan te pakken.
- Om onderzoekers in staat te stellen eiwitinteracties en -functies effectiever te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van primers voor moleculaire klonering van DNA-fragmenten.
- Het amplificeren van DNA-fragmenten die nodig zijn voor het construeren van semi-onafhankelijke eiwitexpressiecassettes.
- Het gebruik van standaard PCR-reacties met high-fidelity polymerase.
- Het integreren van promotors, fluorescente reporters, doelgenen en terminators in het ontwerp.
Belangrijkste Resultaten
- De methode vertoont een hoge efficiëntie bij de co-expressie van cellulaire fusie-eiwitten.
- Het maakt het gebruik van één enkele expressievector voor meerdere eiwitten mogelijk.
- Resultaten wijzen op verbeterde uitkomsten in studies naar eiwitexpressie.
- Deze aanpak kan het onderzoek in de moleculaire plantbiologie aanzienlijk bevorderen.
Conclusies
- De nieuwe methode biedt een robuuste oplossing voor de co-expressie van eiwitten in planten.
- Het opent nieuwe wegen voor het onderzoeken van eiwitfuncties en -interacties.
- Deze techniek zou het begrip van complexe biologische processen in planten kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Efficiënte co-expressie van meerdere fluorescente fusie-eiwitten in planten maakt nauwkeurige spatiotemporele lokalisatiestudies mogelijk, die cruciaal zijn voor doelwitvalidatie in biofarmaceutisch plantonderzoek. Deze methode vermindert mechanistische ambiguïteit door directe vergelijking met organelmarkeringen mogelijk te maken, wat het voorspellend vertrouwen in functionele assays ondersteunt. Het pakt een belangrijke uitdaging in de ontdekkingsfase van fenotypische screening aan, waarbij de co-expressie-efficiëntie de betrouwbaarheid van de gegevens en de doorvoersnelheid beïnvloedt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door gelijktijdige visualisatie van meerdere eiwitlokalisaties in levende plantencellen.
- Operationele waarde: Vermindert variatie in expressieniveaus en tijdsbesteding door de behoefte aan meerdere plasmiden en genetische kruisingen te elimineren.
- Strategische waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door reproduceerbare gegevens over subcellulaire lokalisatie te leveren voor prioritering van targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve co-lokalisatie-uitlezingen die essentieel zijn voor de standaardisatie van assays in eiwitinteractiestudies.
- Operationele waarde: Faciliteert de preparatie van gevalideerde biologische systemen die compatibel zijn met FRET- en BiFC-toepassingen voor downstream screening.
- Strategische waarde: Verbetert de screeningbereidheid en het hergebruik van platforms via een single-vector systeem dat schaalbaar is over verschillende modelsystemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Waarborgt de continuïteit van ziekte-relevante systemen door co-expressie te valideren in zowel transiënte als stabiele transgene plantensystemen.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang mogelijk door consistente, reproduceerbare gegevens over eiwitlokalisatie over verschillende experimentele modellen heen.
- Strategische waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door verwachte subcellulaire patronen te bevestigen voorafgaand aan preklinische investeringen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie, door betrouwbare gegevens over de subcellulaire lokalisatie te verschaffen die bijdragen aan mechanistische risicoreductie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden via directe visualisatie van chimerische fluorescente fusie-eiwitten in planta.
- Screening: Levert reproduceerbare expressiesystemen die klaar zijn voor assays, met kwantitatieve fluorescentie-outputs voor de evaluatie van compound-effecten.
- Analytica: Maakt berekeningen van colocalisatieratio's mogelijk die teams helpen om eiwitinteractiecondities te vergelijken en target engagement te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekking met preklinische continuïteit door gevalideerde co-expressie in transgene planten, wat validatie op basis van biomarkers ondersteunt.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor multi-eiwit co-expressiecampagnes, waardoor redundante vectorconstructie over projecten heen wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in lokalisatiestudies te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid via single-vector co-expressie die compatibel is met bestaande bio-imaging workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het aantal mislukte assays als gevolg van gebrekkige co-expressie te verminderen en snellere go/no-go beslissingen mogelijk te maken.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door betrouwbare subcellulaire gegevens te leveren die de risico's bij de verdere ontwikkeling van targets verkleinen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, PCR-optimalisatie en technieken voor partikelbombardement.
- Afhankelijk van toegang tot high-fidelity polymerase, restrictie-enzymen en confocale microscopie voor fluorescentiedetectie.
- Vereist standaardisatie van de mengverhoudingen van DNA-fragmenten om de assemblage-efficiëntie tussen cassettes te handhaven.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende plantensoorten en celtypen, waaronder BY-2 suspensiecellen en Arabidopsis-weefsels.
- Houdt rekening met praktische beperkingen met betrekking tot biosafety-protocollen voor partikelbombardement en de noodzaak van incubatieperioden in het donker na transformatie.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
DNA Fragment Assembly and Construction of Protein Expression Cassettes
2:03
Construction of the Vector for Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in Plants
3:30
Biolistic-bombardment Mediated Transient Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in Plants
7:20
Results: Representative Images of Co-expression of Chimeric Fluorescent Fusion of VSR and SCAMP in Plant Cells
8:40
Conclusion
