Name: Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Leer de constructie van een synthetische phage-display antilichaam bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit. Deze methode biedt een alternatief voor traditionele hybridoma-technieken bij therapeutische antilichaamontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs waarderen Dr. Frederic Fellouse van het Sidhu laboratorium voor kritische opmerkingen over Kunkel van methode gebaseerd synthetische Fab faag bibliotheek bouw. De auteurs waarderen Mrs. Alevtina Pavlenco en andere leden van de Sidhu lab voor waardevolle hulp van de voorbereiding van hoogrenderende electro-bevoegde E. coli cellen en hoge kwaliteit dU-ssDNA. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) DW en door ShanghaiTech University (Grant No.: F-0301-13-005) laboratorium van antilichaam engineering.

<ol><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28799485">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+watch+in+2017%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Antibodies to watch in 2017.</a> MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).</li>
<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybridoma+revolution%3A+an+offshoot+of+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The hybridoma revolution: an offshoot of basic research.</a> Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).</li>
<li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-Friendly+Affinity+Reagents%3A+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li>
<li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSidhu%2C+SS+%22Phage+Display+in+Biotechnology+and+Drug+Discovery%22">Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery</a>. , CRC Press. (2005).</li>
<li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li>
<li>Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+human+antibodies+in+clinical+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy.</a> MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).</li>
<li>Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic antibodies.</a> Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).</li>
<li>Adams, J. J., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibody+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibody technologies.</a> Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+for+selection+of+novel+binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phage display for selection of novel binding peptides.</a> Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).</li>
<li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT+unique+numbering+for+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+variable+domains+and+Ig+superfamily+V-like+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.</a> Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+between+Peptostreptococcus+magnus+protein+L+and+a+human+antibody+reveals+structural+convergence+in+the+interaction+modes+of+Fab+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins.</a> Structure. 9 (8), 679-687 (2001).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody%3A+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li>
<li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li>
<li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li>
<li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+antibody+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).</li>
<li>Fantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody+library+diversity+through+next+generation+sequencing+and+technical+error+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation.</a> PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+in+library+selection+projects%3A+what+insight+does+it+bring%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?</a> Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).</li>
<li>Perelson, A. S., Oster, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+studies+of+clonal+selection%3A+minimal+antibody+repertoire+size+and+reliability+of+self-non-self+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination.</a> J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).</li>
<li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492(2015).</li>
<li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity%2C+developability+and+functional+size%3A+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li>
<li>Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics+-+the+evolving+patent+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22N+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics - the evolving patent landscape.</a> N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor de bouw van hoge diversiteit, faag-weergegeven Fab Bibliotheken, kwaliteitscontrole zijn controleposten nodig om te controleren van de verschillende fasen van het bouwproces, met inbegrip van de bevoegdheid van electro-bevoegde cellen, kwaliteit van de dU-ssDNA-sjabloon, efficiëntie van CCC-dsDNA synthese, titer na electroporation, Fab vouwen en diversiteit van het aminozuur van CDR door sequentieanalyse van Fab-faag klonen.
Hoge opbrengst en zuiverheid van de dU-ssDNA is essentieel voor ...

mAbs heeft brede toepassingen variërend van fundamenteel onderzoek tot de diagnose van de ziekte en therapeutics. Vanaf 2016 zijn meer dan 60 mAbs goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) voor de klinische behandeling van auto-immuunziekten, kanker en infectieziekten1,2.
In 1975 rapporteerde Kohler en Milstein een techniek voor de continue generatie van antilichamen van een enkele klonen specificiteit van een cellulaire bron aangeduid als 'hybridomas' en deze techniek is later uitgegroeid tot een hoeksteen in geneeskunde en industrie3 ,4. Generatie van mAbs door deze methode vereist een paar stappen, met inbegrip van de productie van antigeen muis immunisatie, winning van B-lymfocyten, fusie van B-cellen met myeloma cellen vormen onsterfelijke hybridoma cellen, selectie van de kloon, en voor therapeutische toepassingen, humanisering is vereist om te voorkomen dat menselijke anti-muis-antilichamen (HAMA)4,5. Echter, voor deze technologie, antigenen met inbegrip van toxines, pathogenen en zeer geconserveerde eiwitten zijn relatief niet effectief in het genereren van een immuunrespons in vivo voor mAb productie5.
In 1978 gemeld Hutchison et al. het gebruik van een oligonucleotide aan directe mutagenese van een residu in een single-stranded bacteriofaag virus6. In 1985, Smith gemeld dat buitenlandse gene fragmenten kunnen worden gesmolten in het frame met het gen codering faag vacht eiwit III en kunnen dus worden weergegeven op het oppervlak van de bacteriofaag zonder afbreuk te doen aan haar infectiviteit7. Deze baanbrekende werken een basis gelegd voor de latere aanleg van phage-weergegeven antilichaam bibliotheken in immuun, naïef, en synthetische vormt met de formaten van single-keten variabele fragment (scFv) en antigeen-bindende fragment (Fab) voor therapeutische mAb development8,9. Van de technisch oogpunt, de ontwikkeling van het antilichaam weergave gebaseerde van de bacteriofaag biedt een complementaire benadering van hybridoma gebaseerde mAb ontwikkeling dat bijdragen kan tot het omzeilen van de beperkingen die sommige antigenen kunnen opleveren en de humanisering proces dat hybridoma afkomstige antilichamen vereisen vaak5. Vanaf 2016, 6 faag display afkomstige mAbs zijn goedgekeurd in de markt met inbegrip van Humira, een van de meest succesvolle mAbs gebruikt voor de behandeling van reumatoïde artritis, en vele faag display afkomstige antilichaam kandidaten zijn momenteel in diverse stadia van klinische onderzoek10.
Voor immuun- en naïef faag antilichaam bibliotheken, de diversiteit van complementariteit-bepalen regio's (CDR) in lichte en zware keten is afgeleid van het natuurlijke immuunsysteem repertoire (d.w.z., van B-cellen). De diversiteit van CDR in synthetische faag antilichaam bibliotheken is daarentegen volledig kunstmatige. Synthetische benaderingen van bibliotheek bouw bieden nauwkeurige controle over het ontwerp van de reeks diversiteit en bieden mogelijkheden voor mechanistische studies van antilichaam structuur en werken11,12. Bovendien kan het kader voor synthetische bibliotheken worden geoptimaliseerd voor bibliotheek bouw om stroomafwaarts, grootschalige industriële ontwikkeling11,12.
In 1985, Kunkel rapporteerde een single-stranded DNA (ssDNA) mutagenese sjabloon gebaseerde benadering om plaats-geleide mutaties in M13 bacteriofaag efficiënt13. Deze aanpak werd vervolgens op grote schaal gebruikt voor de bouw van bibliotheken faag-weergegeven. Chemisch gesynthetiseerd DNA oligonucleotides ontworpen om diversiteit in Fab CDR worden opgenomen in een phagemid met een antilichaam ruggengraat sjabloon. In dit proces, de phagemid wordt uitgedrukt als een uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) en de oligonucleotides worden gegloeid op de CDR en verruimd en double-stranded DNA (dsDNA) in aanwezigheid van DNA van T7 polymerase en T4 DNA ligase synthetiseren. Tot slot kan gegenereerde ds-DNA in Escherichia coli door electroporation worden binnengebracht.
Voor hoge diversiteit, faag-weergegeven bibliotheek bouw, hoog-voltage electroporation van een tweecomponenten mengsel van electro-bevoegde cellen en covalent moet gesloten circulaire dsDNA (CCC-dsDNA) zorgvuldig worden voorbereid. Sidhu et al. bewerkt voor de bereiding van electro-bevoegde cellen en DNA op basis van traditionele methoden en sterk verbeterde bibliotheek diversiteit14.
In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Figuur 1 toont een overzicht van de bibliotheek bouw waaronder: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van dU-ssDNA; 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde ELISA voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit. In de materiaal tabelstaan alle reagentia, stammen en apparatuur. Tabel 1 toont de reagens setup.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP mix</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>oplossing met 25 mM van elk van dATP, dCTP, dGTP en dTTP.</td></tr><tr><td>3,3&rsquo;,5,5&rsquo;-tetramethylbenzidine (TMB)</td><td>Kirkegaard &amp; Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, carb</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL in water,&nbsp; 0.22 &mu;m filter-sterilise, werkconcentratie: 100 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Chloramfenicol, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL in ethanol, 0.22 &mu;m filter-sterilise, werkconcentratie: 10 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>Granulated agar</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 peroxidase substraat</td><td>Kirkegaard &amp; Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin, kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL in water,&nbsp; 0.22 &mu;m filter-sterilise, werkconcentratie: 50 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! WAARSCHUWING NaOH veroorzaakt brandwonden.</td></tr><tr><td>NON-Fat Powdered Milk</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-HRP conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kit</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Protein L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/mL in water, 0. 22 &mu;m filter-sterilise, werkconcentratie: 10 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL in ethanol, werkconcentratie: 0.25 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf </td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Stammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Genotype: dut-&nbsp; ung-&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Gebruikt voor de bereiding van dU-ssDNA.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Genotype: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta;M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta;(araABC-leu)7679 &Delta;lacX74 galUgalK rpsL thi. Geoptimaliseerd voor hoog-efficiënte elektroporatie en filamenteuze bacteriofagenproductie.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf </td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2-cm gap elektroporatie cuvette</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well 2mL Deep-well platen</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96-well Maxisorp immunoplaten</td><td>Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>Baffled flessen</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeflessen</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 elektroporatieapparaat</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetische roerstaven</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher centrifuge</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hogesnelheid shaker</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shaker</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare handelaar voor 96 en 384 wells</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meerkanaals pipette</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

bouw van synthetische phage weergegeven fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Vraag naar monoclonal antilichamen (mAbs) in fundamenteel onderzoek en geneeskunde groeit jaarlijks. Hybridoma technologie is de dominante methode voor mAb development sinds haar eerste verslag in 1975. Als een alternatieve technologie zijn faag display methoden voor mAb ontwikkeling steeds aantrekkelijker omdat Humira, het eerste faag afkomstige antilichaam en één van de best verkochte mAbs, goedgekeurd voor de klinische behandeling van reumatoïde artritis in 2002. Als een proefdiervrije mAb ontwikkeling technologie gebaseerde, mijdt faag display antigeen immunogeniciteit, humanisering en dierlijke onderhoud die worden vereist van de ontwikkeling van het antilichaam van de technologie op basis van traditionele hybridoma. In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Dit protocol bestaat uit: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van uracil-bevattende single-stranded DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit.

Na het stroomschema van de Fab bibliotheek bouw (Zie Figuur 1), wij bereid M13KO7 helper faag vooraf besmet E. coli SS320 electro-bevoegde cellen. De efficiëntie van deze electro-bevoegde cellen wordt geraamd op 2 X 109 cfu/µg toen de ruggengraat van de Fab phagemid voor bouw van library werd gebruikt (Figuur 4).
De efficiëntie van de opneming uracil...

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de bouw van een bibliotheek van synthetische antilichaam faag-weergegeven met op maat gemaakte diversiteit. Synthetische antilichamen hebben brede toepassingen van fundamenteel onderzoek om de diagnose van de ziekte en therapeutics.

Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Het algemene doel van deze procedure is om lezers gedetailleerde praktische ervaring te bieden in het construeren van een faag-getoond synthetisch humaan antilichaam-bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit. Synthetische faag-getoonde antilichaam-bibliotheken hebben een groot potentieel om traditionele hybridoom-gebaseerde technieken voor de ontwikkeling van therapeutische monoklonale antilichamen te vervangen door het omzeilen van de noodzaak voor immuunrespons bij dieren en de daaropvolgende humanisering van antilichamen. Het voordeel van een synthetische antilichaam-bibliotheek is dat op maat gemaakte diversiteit wordt geïntroduceerd in een antilichaamkader met inzicht in positionele diversiteit die hoge affiniteitsinteractie en wenselijke eiwiteigenschappen ondersteunt.Naast de praktische bruikbaarheid kunnen synthetische antilichaam-bibliotheken ook worden gebruikt om experimenteel de rol van specifieke aminozuren in biomoleculaire interacties te onderzoeken, waardoor hun eigen continue verbetering wordt ondersteund. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door een afstudeerstudent genaamd Zhenwei Zhong en Doctor Shin-chen Hou uit ons laboratorium. Om te zijn

construction-synthetic-phage-displayed-fab-library-with-tailored

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the phage display technique to isolate pre-engineered phages expressing proteins with high affinity to the target protein.

Using Phage Display to Select Proteins with High Affinity to a Target Protein

Faagdisplay is een krachtige techniek om eiwitten of eiwitcomponenten die interageren met een geïmmobiliseerd molecuul van belang vangen. Zodra een beslissing van de aard van de faag cDNA bibliotheek creëren en het scherm is gemaakt, de hier beschreven protocol maakt efficiënte affiniteit selectie leidt tot de identificatie van interactoren.

Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.

Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

De beschreven protocollen toestaan de bouw, karakterisering en selectie (tegen het doelwit) van een bibliotheek van de "domainome" gemaakt van elke bron van DNA. Dit wordt bereikt door een onderzoek-pijpleiding dat verschillende technologieën combineert: faag display, een opvouwbare verslaggever en de volgende generatie sequencing met een web-tool voor data-analyse.

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Het creëren van chemisch geïnduceerde eiwit door dimerisatie systemen met de gewenste affiniteit en specificiteit voor een bepaalde kleine molecule ligand zou veel biologische sensing en bediening toepassingen. Hier beschrijven we een efficiënte, generaliseerbare methode voor de Novo engineering van chemisch geïnduceerde door dimerisatie systemen via de stapsgewijze selectie van een Phage-weergegeven combinatorische single-Domain antilichamen bibliotheek.

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Ubiquitinatie is een kritisch eiwit posttranslationele modificatie, waarvan ontregeling is betrokken bij tal van menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft hoe faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe ubiquitinevarianten te isoleren die de activiteit van E3-ligases kunnen binden en moduleren die de specificiteit, efficiëntie en patronen van ubiquitinatie regelen.

Faagdisplay gebruiken om ubiquitinevariatoren voor E3-ligases te ontwikkelen

Een eenvoudige methode voor de identificatie van de prioritaire bacteriële pathogenen is het gebruik van genetisch gemanipuleerd reporter faag. Deze verslaggever faag, die specifiek zijn voor hun specifieke gastheer soorten, zijn in staat om snel transduceren een lichtgevend signaal naar aanleiding van gastheercellen. Hierin beschrijven we het gebruik van de reporter faag voor de detectie...

&#39;Bioluminescent&#39; Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Dit protocol biedt een stap-voor-stap procedure te controleren enkele cel gedrag van verschillende bacteriën in de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Verder hebben we geven richtlijnen hoe de microscopie beelden te analyseren.

Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie

Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Leer de constructie van een synthetische phage-display antilichaam bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit. Deze methode biedt een alternatief voor traditionele hybridoma-technieken bij therapeutische antilichaamontwikkeling.

Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit

Meer video's verkennen