Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie
27 maart 2018
Weefsel-engineered renale constructies bieden een oplossing voor het tekort aan organen en de schadelijke effecten van dialyse. Hier beschrijven we een protocol bij micro ontleden lymfkliertest nieren voor isolatie van cortico-Wallenberg segmenten. Deze segmenten zijn steiger-vrije cellulaire constructies, vorming van renale organoids ingeplant.
Het algemene doel van deze microscopische dissectieprocedure is om discrete segmenten van levend nierweefsel met intacte nierarchitectuur te isoleren voor weefselengineeringtoepassingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van weefselengineering, zoals of hele segmenten van geïsoleerd primair orgaanweefsel sterieel kunnen worden geoogst en in cultuur kunnen worden gehouden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de segmenten intacte nierarchitectuur bevatten, in tegenstelling tot het gebruik van cellijnen om een complex orgaan met meer dan 26 verschillende celtypen na te bootsen.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van end-stage nierziekte omdat deze constructen de filtratie verbeteren en patiënten kunnen helpen om af te zien van dialyse. Tijdens de operatie, draag proper chirurgisch gereedschap, inclusief een masker en een muts om het risico op besmetting te minimaliseren. Evenzo, doe al het mogelijke om de steriliteit te behouden gedurende de gehele procedure.
Begin met de voorbereidingen door de operatietafel af te dekken. Open vervolgens de pakket met geautoclaveerde instrumenten op de steriele doeken. Deze moeten drie kleine hemostati, fijne pincetten met tanden, fijne pincetten zonder tanden en rechte iris schaar omvatten.
Bedek het midden van de operatietafel met een tweede niet-geperforeerde chirurgische doek. Voordat u de operatiekamer inricht, bereid 50 milliliter antibioticum aangevuld DBPS voor en verdeel vijf milliliter in een 15 milliliter buisje. Anesthetiseer nu een acht tot twaalf weken oude C57 zwarte zes muis en controleer periodiek het niveau van anesthesie door de peselfreflex te beoordelen met een stevige teenprik.
Gebruik vervolgens een haartjesverwijderingscrème om alle haren van de ventrale romp te verwijderen en spoel de crème en het haar af met gedestilleerd water. Breng vervolgens de muis over naar de operatietafel en plaats hem op zijn rug onder de niet-geperforeerde doek. Snijd nu een twee centimeter vierkante fenestratie in de doek over de buik van de muis.
Spoel vervolgens de blootgestelde huid af met povidon-jood gevolgd door 70% ethanol drie keer om de huid te steriliseren en de voorbereidingen voor de operatie te voltooien. Begin de operatie door fijne pincetten met tanden en iris schaar te gebruiken. Maak een incisie van drie tot vier centimeter in de huid parallel aan de middenlijn, een halve centimeter links van de middenlijn.
Grijp vervolgens het buikvlies met fijne pincetten zonder tanden en incis met iris schaar om de buikholte te betreden. Breng vervolgens hemostati aan op de superieure en inferieure laterale randen van de huid en het buikvlies om lateraal spanning te plaatsen en de blootstelling te verbeteren. Verplaats nu delicaat de darminhoud naar de rechterkant van de buik om de linker nier bloot te leggen.
Plaats vervolgens voorzichtig tractie op de nier om deze uit de buik te tillen. Plaats nu een hemostat over het hilum van de nier en gebruik iris schaar om de ureter en de niervaten door te snijden. Breng vervolgens de nier over naar de buis met 1% pen-strep DBPS op ijs.
Neem deze buis naar een steriele kweekkap voor verwerking. Breng de nier over naar een 60 millimeter petrischaal en spoel hem twee keer af met verse vijf milliliter DPBS met calcium en magnesium. Na de tweede wasbeurt, suspendeer de nier in verse vijf milliliter DBPS in een nieuwe 60 millimeter schaal.
Bereid vervolgens een extra petrischaal voor die alleen vijf milliliter DBPS bevat voor later gebruik. Blijf een steriele techniek gebruiken, inclusief steriele handschoenen, chirurgisch masker en bouffant om besmettingsrisico's te minimaliseren. Bedek vervolgens het stagegebied en het gebied rond de stereomicroscoop.
Plaats vervolgens plastic zelfklevende vellen op de microscoop focusknoppen en besproei ze met 70% ethanol. Schakel vervolgens de dual gooseneck verlichting in om het stage te verlichten. Leg nu op de steriele doeken, open een pakket gesteriliseerde instrumenten met fijne pincetten zonder tanden, een scalpelgreep, een nummer 15 scalpelmes, twee rechte hemostati, en twee 30,5 gauge hol-bore naalden.
Plaats het nummer 15 mes op de scalpelgreep en bevestig een hemostat aan elke naaldadapterhub om naaldissectie-instrumenten te maken. Breng vervolgens de twee schalen, een met de nier in DPBS en de andere alleen DBPS, naar het microscoopgebied. Verwijder het deksel op de nier-schaal en focus de microscoop op het voorste of achterste oppervlak van de nier bij een vergroting van 3,2 tot 4X.
Gebruik vervolgens met de niet-dominante hand fijne pincetten zonder tanden om de nier door te prikken en vast te pinnen tegen de schaal op de inferieure en superieure polen van de nier. Gebruik vervolgens met de dominante hand het nummer 15 mes om de doorschijnende fibreuze kapsellaag van het blootgestelde oppervlak te verwijderen. Scheer de meest oppervlakkige 0,5 millimeter van het blootgestelde oppervlak van de nier af om de rest van het kapsel te verwijderen.
Ga door door de nummer 15 blaadjes te gebruiken om een omgekeerde piramide van weefsel te disseceren van het gedecapselde gebied dat ongeveer twee vierkante millimeter is. Breng vervolgens het weefsel over in de schone schaal met DBPS en gooi de rest van de nier weg. Focus nu op het gedisseceerde weefsel en verlaag de vergroting naar 1,5 tot 2,0X.
Gebruik de twee hemostat naalden als snijgereedschap om het weefselfragment in progressief kleinere stukken te snijden totdat de weefselsegmenten de grootte van de naaldpunten of kleiner zijn. Er moeten ongeveer 50 segmenten worden geproduceerd. Dit is een kritisch deel van de procedure.
Elk segment moet de diameter van de 30-1/2 gauge naaldpunt nauw benaderen om grote segmenten te vermijden die de diffusie kunnen belemmeren. Breng het weefsel terug naar de weefselkweekkap en verwijder het DPBS met behulp van een P1000 micropipet. Voeg vervolgens vijf milliliter DMEM aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 1% pen-strep toe.
Kweek vervolgens het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het micro-dissecteren van muizennieren om cortico-medullaire segmenten te isoleren voor toepassingen in tissue engineering. De geïsoleerde segmenten behouden de intacte renale architectuur, wat een veelbelovend alternatief biedt voor traditionele cellijnen bij orgaanreconstructie.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Weefseltechnologie
- Nierbiologie
- Orgaanconstructen
Achtergrond
- Tekorten aan organen en complicaties bij dialyse maken innovatieve oplossingen noodzakelijk.
- Een intacte renale architectuur is cruciaal voor effectieve tissue engineering.
- Primaire segmenten van organweefsel kunnen inzicht bieden in de orgaanfunctie en het herstel ervan.
- Deze methode is erop gericht de levensvatbaarheid van renale constructen voor therapeutische toepassingen te verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een steriele methode voor het isoleren van levende segmenten nierweefsel.
- Het evalueren van het potentieel van deze segmenten voor weefseltechnologie.
- Het aanpakken van uitdagingen bij het behoud van de orgaanarchitectuur tijdens dissectie.
Gebruikte methoden
- Microscopische dissectie van muisnieren.
- Isolatie van cortico-medullaire segmenten.
- Implantatie in scaffold-vrije cellulaire constructen.
- Handhaven van steriliteit gedurende de gehele procedure.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van renale segmenten met behoud van de architectuur.
- Segmenten bleven levensvatbaar voor kweek en experimentatie.
- Potentieel voor verbeterde filtratie in renale constructen.
- Draagt bij aan vooruitgang in therapieën voor nierfalen in het eindstadium.
Conclusies
- Deze techniek biedt een nieuwe benadering voor niertissue-engineering.
- Het behoud van de nierearchitectuur is essentieel voor functionele organoïden.
- Toekomstige toepassingen kunnen een aanzienlijke impact hebben op alternatieven voor dialyse.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode maakt de isolatie mogelijk van levende nierweefselsegmenten met een intacte architectuur, wat een biologisch relevant systeem biedt voor de preklinische ontwikkeling van nierconstructen. Door de natuurlijke corticomedullaire structuur te behouden, ondersteunt het de mechanische risicoanalyse bij weefselgeknutselde niertherapieën. De aanpak overbrugt translationele kloven in het modelleren van complexe orgaanfuncties voor interventies bij nierfalen in het eindstadium.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de functie van renale segmenten binnen de oorspronkelijke architecturale context mogelijk.
- Operationele waarde: Levert steriel, levensvatbaar primair weefsel voor hypothesetoetsing bij constructie-integratie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare resultaten, zoals albuminereabsorptie-hotspots voor functionele beoordeling.
- Operationele waarde: Ondersteunt gestandaardiseerde segmentvoorbereiding voor reproduceerbare zaaiing van constructen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de corticomedullaire integriteit die cruciaal is voor het modelleren van filtratie- en reabsorptiepaden.
- Operationele waarde: Faciliteert snelle incorporatie in scaffold-vrije constructen voor vascularisatieonderzoeken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Positioneert geïsoleerde renale segmenten als een mogelijkmakende stap in de ontdekkingsfase voor het bouwen van preklinische renale constructen voorafgaand aan functionele validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de renale functie op weefselniveau met behulp van intacte primaire segmenten.
- Screening: Maakt assay-klare segmenten mogelijk voor het evalueren van de integratie van het construct met de gastheer en de filtratiecapaciteit.
- Analytica: Biedt structurele en functionele read-outs, waaronder levensvatbaarheidstesten en metrieken voor albumintransport.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de levensvatbaarheid van segmenten met de preklinische prestaties van constructen in dialyse-relevante modellen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbare methode voor de winning van weefsel voor iteratief ontwerp van renale constructen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de natuurlijke renale architectuur te behouden ten opzichte van gedissocieerde celsystemen.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van segmentgrootte (200-300 μm) mogelijk voor consistente zaaiing van constructen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van renale constructen door validatie van vroege integratie.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van scaffold-vrije benaderingen met gebruik van primair weefsel.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in steriele microchirurgie en de anatomie van de nier van knaagdieren.
- Afhankelijk van stereomicroscopie, fijn instrumentarium en het behoud van een steriel veld.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor kwaliteitscontrole van segmenten tussen biologie- en engineeringteams.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten soortspecifieke segmentafmetingen en compatibiliteit van het construct.
- Praktische beperkingen omvatten het venster van segmentlevensvatbaarheid en de afhankelijkheid van verse donororganen.
