Name: Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer celuitbreiding op macroporeuze microcarriers voor weefselengineering met een perfusiebioreactor. Deze methode maakt biocompatibele celafgifte mogelijk zonder oogststap voor klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek leidt tot deze resultaten is financiering van de Europese Unie zevende kader programma KP7/2007-2013 onder grant overeenkomst n ° 607051 (BIO-INSPIRE) ontvangen. Wij danken Carolien van Spreuwel-Goossens van Fujifilm Manufacturing Europe B.V., voor de technische bijstand tijdens RCP productie en Werner Stracke van Fraunhofer Instituut voor silicaat onderzoek ISC, voor hulp bij de SEM-analyse.

hBMSCs werden geïsoleerd van het dijbeen hoofd van artrose patiënten een dijbeen hoofd vervanging operatie ondergaan. De procedure werd uitgevoerd onder de goedkeuring van de lokale ethische commissie van de Universiteit van Würzburg en geïnformeerde toestemming van de patiënt. Primaire microvasculaire endotheliale cellen werden geïsoleerd van de voorhuid Biopten van jonge donoren. Hun wettelijke vertegenwoordiger (s) verstrekte volledig geïnformeerde toestemming schriftelijk. De studie werd goedgekeurd door de lokale ethische Raad van bestuur van de Universiteit van Würzburg (stemming 182/10).
1. isolatie van hBMSCs en HDMECs
<ol><li>Menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (hBMSCs)<ol>
<li>Verwijder sponsachtig bot van het dijbeen hoofd met behulp van een steriele lepel. Opmerking: Het sponsachtig bot verschijnt als een losse en korrelige stof binnen de corticaal bot, die hard en stijf is. Wellicht naar kras delen van het sponsachtig bot uit de corticaal bot met behulp van een scalpel.</li>
		<li>Voeg het verwijderde sponsachtig bot in twee 50 mL tubes. Het volume van het sponsachtig bot kan variëren van 5 tot 10 mL volgens de dimensie van het hoofd verwijderd dijbeen tijdens de heupprothese chirurgie.</li>
		<li>Wassen met DMEM-F12 (1:1 mengsel van DMEM en Ham F12 medium), het vullen van de buis met ca. 30 mL medium.</li>
		<li>Schud de buis handmatig, in een longitudinale manier, voor 5 s tot obesitas-cellen uit het sponsachtig bot laat. Centrifugeer bij 300 x g en 22 ° C gedurende 5 min.</li>
		<li>Gecombineerd met een gegradueerde plastic pipet, de vet-cellaag en ca. 20 mL van het supernatans dat overgebleven. Laat genoeg middellange ter dekking van het sponsachtig bot.</li>
		<li>Vul de buizen met 10 ml DMEM-F12 en schud krachtig met de hand, voor 10-15 s, liet de cellen overlangs.</li>
		<li>10-15 mL celsuspensie met een gegradueerde plastic pipet van de buizen overbrengen naar een nieuwe tube van 50 mL.</li>
		<li>2 - 3 keer herhalen vanaf stap 1.1.6 bundelen van de verkregen celsuspensie totdat het sponsachtig bot verzameld in de tube 50 mL wit is.</li>
		<li>Spoel de celsuspensie met een gegradueerde plastic pipet twee nieuwe buizen, het vermijden van de collageen-pellet afgezet op de bodem van de 50 mL tubes aspirating.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g en 22 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant door het aspirating met een gegradueerde plastic pipet.</li>
		<li>Voeg 40 mL DMEM-F12 10% FCS 1% Pen/Strep 50 µg Mo/mL ascorbaat-2-fosfaat in een derde buis. Pipetteer 5 mL van dit medium aan elke buis met de cel pellet. Resuspendeer de cel pellets door de bodem van de buizen krachtig flikkeren en de cel schorsingen overbrengen in de buis met enige medium.</li>
		<li>Optioneel: Verdun 100 µL van cellen schorsing voor het tellen van de cel, het eerste 1:100 met PBS en vervolgens 1:10 trypan blauw, verdunning door toevoeging van 15 µL van de eerste verdunning aan 15 µL van DPBS en 30 µL Trypan blauw om te verkrijgen van een DPBS: Trypan Blue verhouding van 1:1. De cellen met een standaard kamer Neubauer tellen.</li>
		<li>Beënt de cellen op 109 cellen/175 cm2 T-kolf in 25 mL van medium, zoals beschreven in 1.1.11. Als alternatief, verdeel de hele celsuspensie in maximaal tien 175 cm2 cel cultuur kolven zonder tellen. In dit stadium zijn hBMSCs niet te onderscheiden van de erythrocyten, die sterk talrijker zijn dan de hen. hBMSCs verschijnt als schaars koloniën (1-2/kolf) in de loop van de eerste 7 dagen.</li>
		<li>Medium na 4 dagen na het zaaien zodat interactie tussen de cellen van het bloed en de hBMSCs wijzigen. Na de eerste middellange exchange, het medium elke 2-3 dagen wijzigen. Uitvoeren van de middellange uitwisseling door volledig verwijderen van het kweekmedium met een gegradueerde plastic pipet, twee keer wassen met DPBS (door het toevoegen van 10 mL van de DPBS aan de Adherente cellen en volledig verwijderen van de DPBS met een gegradueerde plastic pipet) en vervolgens toe te voegen 20 mL verse medium, als beschreven in 1.1.11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menselijke dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs)<ol>
<li>Behandel de huid biopsieën en isoleren van de HDMECs volgens de eerder gepubliceerde protocollen21. Incubeer kort, na de scheiding van de dermis van de epidermis, de dermis in trypsine gedurende 40 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Na incubatietijd, de dermis overbrengen in een petrischaal met voedingsbodem en krabben van elk stuk met behulp van een scalpel. De verkregen celsuspensie overbrengen in een plastic tube van 50 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g en 22 ° C. Tellen de celsuspensie met behulp van een Neubauer kamer en zaad bij een dichtheid van 1.2 x 104 cellen/cm2. Wijzig het medium volledig om de andere dag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. opzet en sterilisatie van spinner kolven, RCP microcarriers en bioreactor
<ol><li>Spinner kolven en RCP microcarriers<ol>
<li>Een dag voordat de experimenten, set-up het ringveld kolven en bereiden hen voor sterilisatie door autoclaaf. Opmerking: Laat de doppen van de spinner kolven losse en, indien mogelijk, steriliseren hen in een verticale positie.<ol>
<li>Wikkel de kolven spinner met aluminiumfolie rond de kant doppen afzonderlijk om te voorkomen dat besmetting tijdens het uitpakken. Wikkel de kolven met 1-2 lagen van aluminiumfolie voor de autoclaaf om te minimaliseren van de risico's van verontreiniging na sterilisatie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Weeg de benodigde hoeveelheid RCP macroporeuze microcarriers 20 ml DPBS. Opmerking: 30 mg per spinner kolf vereist is. Laat ze hydrateren gedurende ten minste 1 uur voordat de warmte sterilisatie door autoclaaf (121 ° C gedurende 15 minuten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfusie bioreactor<ol>
<li>Gebruik van het systeem van de bioreactor beschreven voor de productie van gevacuoliseerd weefsel equivalenten20. Deze bioreactor bestaat uit een schip, waarin de biomatrix wordt geplaatst, een middelgrote reservoir en een fles van de druk.<ol>
<li>Sluit het schip met de middellange reservoir en de fles onder druk door silicium buizen (Zie Figuur 3 c). Laat de doppen los en plaats het in een autoclaaf plastic zak, sluit goed en plaats deze in een tweede plastic zak in de autoclaaf. Steriliseren in autoclaaf.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cultuur van hBMSCs en HDMECs op de RCP macroporeuze microcarriers
Opmerking: Het HDMECs gebruikt om het zaad van de RCP microcarriers waren gelabeld met RFP door lentivirale transductie. Dit protocol is na een eerder gepubliceerde protocol5bewerkt.
<ol><li>Laat de RCP macroporeuze microcarriers regelen naar de onderkant en spoel ze met 10 mL gestolde voedingsbodem. Herhaal dit 3 keer.</li>
	<li>Wassen spinner flacons met 10 mL gestolde voedingsbodem.</li>
	<li>Voeg toe 30 mg RCP macroporeuze microcarriers per spinner kolf in 8 mL gestolde voedingsbodem. Equilibreer de spinner kolven met de RCP microcarriers bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30 min, voordat het zaaien van de cellen. Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.</li>
	<li>Zaad 5 x 10-5 -hBMSCs of HDMECs (passage 3) per spinner kolf in 2 mL gestolde voedingsbodem.</li>
	<li>Plaats de spinner kolven op de roerder plaat en start op 90 rpm gedurende 5 minuten en de rest voor 55 min, bij 37 ° C en 5% CO2, voor een totaal van 1 h statisch/dynamisch incubatie roeren. Herhaal 4 keer.</li>
	<li>Voeg 10 mL van de cel kweekmedium per spinner kolf en start continu roeren bij 95 rpm. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Met het gebruik van een micropipet monsters te nemen op de dagen 1, 4 en 7:333 µL voor DNA inhoud (~ 0.5 mg), 1000 µL SEM p.a. (~ 1,5 mg) en 333 µL voor wonen/dode vlekken (~ 0.5 mg). Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.</li>
	<li>Verandering 10 mL gestolde voedingsbodem om de andere dag. Wacht totdat de RCP microcarriers naar de bodem regelen en zeer zorgvuldig gecombineerd 10 mL van de kolf spinner met behulp van een precisiepipet 10 mL en voeg vervolgens 10 mL verse voedingsbodem hiervoor.</li>
	<li>Houd de culturen op de plaat van de roerder vastgesteldop 95 rpm, bij 37 ° C en 5% CO2 voor 7 dagen.</li>
</ol>4. DNA inhoud, SEM analyse, levende dode kleuring en kiemen assay
<ol><li>DNA-inhoud<ol>
<li>Met het gebruik van een micropipet, verzamelen ca. 0.5 mg microcarriers van elke spinner kolf (opgenomen in 333 µL van schorsing) en overdracht aan een plastic buis van 2 ml. Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.</li>
		<li>Eens was met 1 mL van DPBS, dan supernatant gecombineerd.</li>
		<li>Verwijderen van de resterende DPBS in een lyophilizer en het gewicht van het gelyofiliseerd microcarriers voor later normalisatie.</li>
		<li>Bevriezen monsters bij-80 ° C gedurende ten minste 6 uur.</li>
		<li>Incubeer monsters bij 60 ° C's nachts met 300 µL papaïne 5 U/mL.</li>
		<li>Stellen van de juiste titratie curven volgens de instructies van de manufacturer´s van de kwantificatie assay (b.v., PicoGreen dsDNA assay) kit en uitvoeren van de meting van het fluorescerende signaal op 520 nm met een luminescentie detector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scanning elektronen microscopie (SEM) analyse<ol>
<li>Ca. 1 mg microcarriers van verzamelen elke spinner kolf en overdracht aan een plastic buis van 2 mL.</li>
		<li>Wassen microcarriers een keer met 1 mL van DPBS.</li>
		<li>Verwijder DPBS en incubeer in 70% ethanol voor 1 h 1 mL.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en incubeer in 1 mL 80% ethanol voor 1 h.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en incubeer in 1 mL 90% ethanol voor 1 h.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en incubeer in 1 mL 100% ethanol voor 1 h.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en broeden in 1 mL van de hexamethyldisilazane gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Open van GLB en laat de monsters droog 's nachts onder een chemische motorkap.</li>
		<li>Fix monsters op passende steun en overgaan tot SEM analyse volgens de vastgestelde protocollen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DAPI en Live/Dead kleuring<ol>
<li>Op dag 2, 4 en 7 na cel zaaien op de microcarriers verzamelen 0.5 mg microcarriers van elke spinner kolf en overdracht aan een plastic buis van 2 mL. Een keer wassen met 1 mL van DPBS.</li>
		<li>DAPI<ol>
<li>Corrigeer monsters gedurende 10 minuten in genoeg paraformaldehyde 4% ter dekking van hen.</li>
			<li>Een keer wassen met 1 mL van DPBS.</li>
			<li>Incubeer bij kamertemperatuur met de kleurstofoplossing gedurende 45 minuten op een rockende shaker.</li>
			<li>DAPI fluorescent signaal detecteren op een fluorescentie Microscoop met een 420 nm emissie filter en het verwerven van beelden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Live/Dead kleuring<ol>
<li>Incubeer monsters in 500 µL van Live/Dead kleurstof oplossing. Houd de monsters bij 37 ° C gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht.</li>
			<li>Een keer wassen met 1 mL van DPBS.</li>
			<li>Fluorescentie-signaal van levende cellen met een 490 nm emissie filter en dode cellen met een 545 nm emissie filter op een fluorescentie Microscoop detecteren. Verwerven van beelden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kiemen assay voor HDMECs<ol>
<li>Mix-330 µL van collageen R oplossing 0,4%, 170 µL van 0,1% azijnzuur en 50 µL van middellange M199 in een plastic tube van 15 mL. Houd op ijs.</li>
			<li>Nemen ~0.375 mg microcarriers (250 µL) met het gebruik van een micropipet. Overbrengen in een plastic buis van 1,5 mL, wachten op de RCP microcarriers te regelen naar beneden en volledig verwijderen van het medium. Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.</li>
			<li>De hoeveelheid NaOH 0,2 N moeten neutraliseren het collageen mengsel en meng het onmiddellijk met de RCP microcarriers toevoegen. Opmerking: De vereiste hoeveelheid NaOH 0,2 N vooraf bepalen door het toe te voegen aan het mengsel tot verandering in pH (van gele kleur veranderen naar roze), en dan het plaatsen van het mengsel in de incubator voor 1 min, waarna een gel gevormd moet worden.</li>
			<li>Plaat het collageen gel-RCP microcarriers mengsel in een putje van de plaat van een 24-well. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30 min.</li>
			<li>Voeg 200 µL van de vasculaire endotheliale groeifactor (b.v., VascuLife VEGF-Mv kweekmedium). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
			<li>Onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop, met behulp van een 10 X vergroting object, observeren en verwerven van beelden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biomatrix zaaien en starten van bioreactor systeem voor HDMECs
<ol><li>Een dag voordat de bioreactor culturen, gesneden overlangs open BioVaSc (de biomatrix) aan de antimesenteric kant en repareren in een eerder ontsmet polycarbonaat frame (Zie figuur 3A, B). Opmerking: De BioVaSc is een biomatrix die zijn verkregen uit een decellularized varkens jejunal segment, bereid als eerder gepubliceerde21. Opmerking: als het frame polycarbonaat kan niet worden gesteriliseerd door hitte, gedesinfecteerd door 20 min incubatie in sonic bad (40 kHz) gevolgd door 3 keer incubatie in ethanol 70% voor 25 min. Vervolgens wassen het frame 3 keer met DPBS steriel.<ol>
<li>Plaats het biomatrix-frame-systeem in een petrischaal van 100 mm en vul het met de vasculaire endotheliale groeifactor + 1% penicilline streptomycine (Pen/Strep).</li>
		<li>De biomatrix door 's nachts incuberen bij 37 ° C en 5% CO2equilibreer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteren na loskoppelen en het tellen van de cellen, 10 x 107 HDMECs in 1000 µL cultuurmedium via de bewaarde therapieën van de biomatrix, met het gebruik van een 2 mL spuit. Opmerking: Injecteren ~ 700 µL de arteriële instroomopening passeren en ~ 300 µL via het stopcontact van de ader.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 uur, zodat de cel bijlage.</li>
	<li>Vul de bioreactor systeem met 350 mL van de vasculaire endotheliale groeifactor + 1% Pen/Strep en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Plaats het frame binnen het schip van de bioreactor. De arteriële en veneuze pedicles verbinden met het schip.</li>
	<li>Start perfusie door de bioreactor systeem te koppelen aan een peristaltische pomp. De druk vastgesteldop 10 mmHg en amplitude ±1.</li>
	<li>De stapsgewijze druk opvoeren elk uur tot het bereiken van de 100 mmHg druk, amplitude ±20.</li>
	<li>Houd het bioreactor systeem voor 7 dagen onder deze omstandigheden bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
</ol>6. de toevoeging van RFP-HDMECs aan de biomatrix
<ol><li>Mix-330 µL van 0.4% collageen R-oplossing, 170 µL van 0,1% azijnzuur en 50 µL van middellange M199 in een tube van 15 mL Falcon. Houd op ijs.</li>
	<li>Neem de RCP microcarriers van de kolven spinner. Het kweekmedium volledig verwijderen.</li>
	<li>De hoeveelheid NaOH 0,2 N moeten neutraliseren het collageen mengsel en meng het onmiddellijk met de RCP microcarriers toevoegen.</li>
	<li>Voeg de collageen gel-RCP microcarriers mengsel op het lumen van de biomatrix. Toestaan gelering gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Daarnaast heeft het medium van de bioreactor wijzigen door het volledig verwijderen van het medium en voegt u 350 mL vers, pre opgewarmd, vasculaire endotheliale groeifactor + 1% Pen/Strep.</li>
	<li>De bioreactor verbinden met de peristaltische pomp en instellen van de druk bij 100 mmHg en amplitude ±20.</li>
	<li>Het medium elke 7 dagen wijzigen.</li>
	<li>Houd de bioreactor cultuur gedurende 21 dagen.</li>
</ol>7. analyse en read-outs van bioreactor culturen
<ol><li>Bereiding van de monsters<ol>
<li>Haal de biomatrix uit de bioreactor en verwijder deze uit het polycarbonaat frame.</li>
		<li>Het verkregen stuk snijdt in 6 delen: 2 voor MTT, 2 voor paraffine insluiten/kleuring en 2 voor SEM analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paraffine insluiten<ol>
<li>Plaats van de secties in een petrischaal en wassen met genoeg DPBS voor hen. Gooi de DPBS weg.</li>
		<li>Vaststellen van de secties in 4% paraformaldehyde's nachts.</li>
		<li>De cassettes voor te bereiden voor het insluiten van paraffine en het uitvoeren op basis van standaardprotocollen.</li>
		<li>Voorbereiding van de secties in de paraffineblokken en snijd monsters van 3 µm voor H & E kleuring, met het gebruik van een microtoom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H & E kleuring<ol>
<li>Vlek gerehydrateerd secties volgens standaardprotocollen32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scanning elektronen microscopie (SEM) analyse<ol>
<li>Plaats van de secties in een petrischaal en wassen met genoeg DPBS voor hen. Gooi de DPBS weg.</li>
		<li>Herstellen van de secties met de 4,75% Glutaaraldehyde 's nachts.</li>
		<li>Uitvoeren van uitdroging ketting met toenemende concentraties van ethanol 50% - 100%.</li>
		<li>Dekking van de secties met hexamethyldisilazane (HMDS) voor 10 min. Gooi de gebruikte HMDS en toevoegen van verse HMDS.</li>
		<li>De secties te droog 's nachts onder zuurkast toestaan, en dan het voorbereiden van de monsters voor imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)<ol>
<li>Meng de MTT-reagens met de vasculaire endotheliale groeifactor, in een concentratie van 1 mg/mL.</li>
		<li>Incubeer de secties in de MTT-oplossing gedurende 90 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Houd rekening met de vasculaire structuren en cel-geplaatste microcarriers macroscopisch of onder een heldere-veld Microscoop, te detecteren metabolisch actieve cellen. Verwerven van beelden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214031X15000182">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).</li>
<li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+solid+and+porous+microcarriers+for+cell+growth+and+production+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins.</a> Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).</li>
<li>Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical%2C+Spatial%2C+and+Molecular+Aspects+of+Extracellular+Matrix+of+In+Vivo+Niches+and+Artificial+Scaffolds+Relevant+to+Stem+Cells+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research.</a> Stem Cells Int. 2015, 167025(2015).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).</li>
<li>Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+3D+is+never+flat%3A+3D+models+to+optimise+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).</li>
<li>Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+serum-free+microcarrier+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+Parameters+to+be+optimized%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).</li>
<li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li>
<li>Schop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+on+microcarriers%3A+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism.</a> J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).</li>
<li>Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xeno-free+microcarrier-based+stirred+culture+system+for+the+scalable+expansion+of+human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+isolated+from+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue.</a> Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).</li>
<li>Malda, J., Frondoza, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarriers+in+the+engineering+of+cartilage+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microcarriers in the engineering of cartilage and bone.</a> Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).</li>
<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy%3A+achievements+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction.</a> Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).</li>
<li>Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable+Recombinant+Collagen+I+Peptide-Based+Macroporous+Microcarrier+Allows+Superior+Expansion+of+C2C12+and+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Supports+Deposition+of+Mineralized+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix.</a> Tissue Eng Part A. , (2017).</li>
<li>Davidenko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+crosslinking+for+tailoring+collagen-based+scaffolds+stability+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics.</a> Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).</li>
<li>Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+culture+on+porous+biopolymer+microcarriers+in+a+spinner+flask+for+bone+tissue+engineering%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study.</a> Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).</li>
<li>Bae, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23152325">Building Vascular Networks.</a> Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23(2012).</li>
<li>Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+bone+regeneration+in+a+critical+sized+defect+using+2-N%2C+6-O-sulfated+chitosan+nanoparticles+incorporating+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2.</a> Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).</li>
<li>Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li>
<li>Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medium+perfusion+on+cell-seeded+three-dimensional+bone+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro.</a> Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).</li>
<li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularised+human+tissue+models%3A+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).</li>
<li>Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+human+airway+mucosa+model+based+on+a+SIS+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold.</a> Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).</li>
<li>Moll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+of+a+Human+3D+in+vitro+Tumor+Test+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System.</a> J. Vis. Exp. (78), e50460(2013).</li>
<li>Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioreactor+system+for+interfacial+culture+and+physiological+perfusion+of+vascularized+tissue+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents.</a> Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).</li>
<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26848/">Blood vessels and endothelial cells.</a> Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).</li>
<li>Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24237862">A systems biology view of blood vessel growth and remodeling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).</li>
<li>Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upcyte%C2%AE+Microvascular+endothelial+cells+repopulate+decellularized+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).</li>
<li>Nietzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+Metastases+Including+Tumor+Stroma%3A+A+New+Technique+to+Generate+a+Three-Dimensional+Colorectal+Cancer+Model+Based+on+a+Biological+Decellularized+Intestinal+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).</li>
<li>Göttlich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combined+3D+Tissue+Engineered+In+Vitro%2FIn+Silico+Lung+Tumor+Model+for+Predicting+Drug+Effectiveness+in+Specific+Mutational+Backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds.</a> J. Vis. Exp. (110), e53885(2016).</li>
<li>Stratmann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+3D+lung+cancer+model+based+on+a+biological+tissue+matrix+combined+with+a+Boolean+in+silico+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model.</a> Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).</li>
<li>Groeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+vascularized+skin+equivalent+for+as+an+alternative+to+animal+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation.</a> Altex. 33 (4), 415-422 (2016).</li>
<li>Plunkett, N., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactors+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+and+Health+Care%22%5BJournal%5D)">Bioreactors in tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).</li>
<li>Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X14000278">A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers.</a> Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986(2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een hoofddoel van microcarrier is de uitbreiding van cellen met behoud van hun differentiatie zodat u cellen naar de plaats van noodzaak. De vertegenwoordigde methode introduceren RCP microcarriers waar cellen konden toevoegen, vermenigvuldigen en koloniseren de microcarriers met hoge celdichtheid. Dit werd waargenomen door live/dead kleuring, waarin meer dan 90% van levensvatbare cellen werden ontdekt, terwijl slechts een paar dode cellen werden verkregen na 7 dagen van dynamische culturen. Ook bevestigd de beelden van ...

Een algemeen probleem in weefsel waterbouwkundige toepassingen is moeten opleveren van de massa van een hoge cel met het fenotype van de juiste differentiatie op de locatie van. De toepassing van microcarriers aan te pakken dit probleem begon in 1967 met toenemende betekenis toe op gebieden zoals orthopedische weefselengineering voor grootschalige generatie van huid, botten, kraakbeen en pezen1. Zij toestaan dat de behandeling van aanhangend culturen op manieren gelijkend op dat van schorsing culturen2 door cellen op microscale driedimensionale (3D) substraten uit te vouwen. Daardoor ervaren cellen een homogene voedingsstoffen levering en cel-matrix interacties dat leiden tot beter onderhoud van in vivo3,4 differentiatie, die vaak verloren na verloop van tijd in 2D5 benaderingen. Een hogere oppervlak-te-volumeverhouding - uiteindelijk zal leiden tot hogere cel opbrengsten6,7, hogere gas en nutriënten wisselkoersen vergelijken met statische systemen8, de mogelijkheid om te reguleren en de cultuur onderworpen aan fysieke prikkels9, en de mogelijkheden voor schaalvergroting van de uitbreiding proces7 zijn verdere voordelen. Verschillende functies zoals diameter, dichtheid, porositeit, oppervlakte lading en hechting eigenschappen10,11 onderscheid maken tussen de verschillende commercieel beschikbare micro - en macro-dragers. Één van het belangrijkste voordeel is echter hun potentieel als microtissues levering aan site defect of vraag.
Voor toepassingen van de technologie van de microcarrier in bot weefselengineering, we geïllustreerd in een vorige verslag12 de productie van een nieuwe microcarrier type bestaat uit een recombinant collageen ik peptide (RCP, commercieel beschikbaar als Cellnest). Deze nieuwe microcarrier kunt de GMP-conforme een schaal voor de productie van de steiger en cel, als nodig is voor de levering van de cel in een klinische scenario. In dit verband kunt afstemming van de stabiliteit van de steiger, aantasting van het tarief en oppervlakte-eigenschappen door middel van de juiste keuze van een geschikt crosslinking strategie passen de techniek om de geselecteerde toepassing, cell type van belang of target weefsel13. In het bijzonder maakt de potentiële tewerkstelling van deze microcarrier als een injecteerbare cel expresbezorgingssysteem voor therapeutische toepassing14 ze bijzonder interessant in een klinische setting.
In deze paper illustreren we daarom de kweken procedure voor de isolatie en de uitbreiding van de menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (hBMSCs) en menselijke dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs) op collageen ik-gebaseerde recombinant Peptide gebaseerde microcarriers, en hun bereiding voor levering in een klinische setting. Daarnaast beschrijven we aanvullende protocollen nuttig voor het onderhoud van de levensvatbaarheid van de cellen op innesteling.
Levensvatbaarheid van de cellen na implantatie is in feite sterk afhankelijk van vascularisatie15,16,17, die zorgt voor een uitwisseling van zuurstof en voedingsstoffen en afvalstoffen verwijdering vergemakkelijkt. Bioreactoren vormen één aanpak vascularisatie uitdagingen in de weefselkweek en handhaven van de levensvatbaarheid van de cellen, via perfusie van kweekmedium verstrekken waardoor zuurstof en voedingsstoffen18. We illustreren hier, een in vitro -methode om te evalueren van het vermogen van de migratie van microvasculaire endotheliale cellen van de RCP microcarriers een biomatrix en hun vermogen om bij te dragen aan de DOVO vascularisatie en angiogenese. Deze biomatrix is een decellularized segment van varkens jejunum genoemd BioVaSc (biologische gevacuoliseerd steiger), rijk aan collageen en elastine en bewaard met vasculaire structuren, waaronder een voeding slagader en een zuig ader19 dat is geweest implantatie kwesties20aangevraagd.

<table><tbody><tr><td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>20395.01</td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533,001</td><td></td></tr><tr><td>Analytische balans Kern EG 2200-2NM</td><td>Kern &amp; Sohn GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbaat-2-fosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor</td><td>Leraar weefselkunde en regeneratieve geneeskunde, Wuerzburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helderveldmicroscoop Axiovert 40C</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellnest</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (15 mL, 50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenre-oplossing 0,4%</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>47254.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Gewijzigd, zonder calciumchloride en magnesiumchloride</td></tr><tr><td>Eosine 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177.01000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T171.4</td><td>Gedenatureerd</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FCS)</td><td>Bio&amp;SELL</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>niet hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop BZ-9000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haematoxyline</td><td>Morphisto</td><td>10231.01000</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>Reagenskwaliteit, &ge;99%</td></tr><tr><td>Incubator voor bioreactor</td><td>Leraar weefselkunde en regeneratieve geneeskunde, Wuerzburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Cell Double Staining Kit</td><td>Fluka</td><td>04511KT-F</td><td></td></tr><tr><td>Magneetstomerplaat</td><td>2Mag</td><td>80002</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>10X</td></tr><tr><td>Microplaatlezer Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naald 21G 16mm</td><td>VWR</td><td>613-5389</td><td></td></tr><tr><td>Papaïne van papajalatex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>Gelyofiliseerd poeder, &ge; 10 eenheden/mg eiwit</td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quanti-iT PicoGreen dsDNA-testkit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P087</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope Supra 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide-oplossing 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Spinnerkolven (25 mL)</td><td>Wheaton</td><td>356879</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 1 mL</td><td>VWR</td><td>720-2561</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekkolven (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)</td><td>TPP Techno Plastik Products AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF-Mv</td><td>Lifeline cell technology</td><td>LL-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinante collageen ik peptide microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een bioreactor model

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Weefseltechnologie is een veelbelovend gebied, gericht op het ontwikkelen van oplossingen voor de toenemende vraag op de weefsels en organen voor transplantatiedoeleinden. Het proces voor het genereren van dergelijke weefsels is complex en omvat een passende combinatie van specifieke celtypes, steigers en fysieke of biochemische prikkels om te leiden van de celgroei en differentiatie. Microcarriers vormen een aantrekkelijk instrument uit te breiden van cellen in een driedimensionale (3D) communicatie, omdat ze hogere oppervlak-volume ratio's geven en de in vivo situatie vergeleken met traditionele tweedimensionale methoden nauwer wordt nagebootst. Het vaatstelsel, de levering van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen en het waarborgen van de verwijdering van het afval, vormt een belangrijke bouwsteen wanneer weefsels genereren ontworpen. In feite, mislukken de meeste constructies na wordt geïmplanteerd te wijten aan het ontbreken van vasculaire ondersteuning. In deze studie, presenteren we een protocol voor endothelial cel expansie op recombinante collageen gebaseerde microcarriers onder dynamische omstandigheden in spinner kolf en bioreactoren en leggen we uit hoe u kunt bepalen in dit de levensvatbaarheid van de cellen van de instelling en functionaliteit. Daarnaast stellen wij een methode voor de levering van de cel voor vascularisatie doeleinden zonder extra detachement stappen die nodig zijn. Bovendien bieden wij een strategie om te evalueren van de cel vascularisatie potentiële in een bioreactor perfusie op een decellularized biologische matrix. Wij zijn van mening dat het gebruik van de gepresenteerde methoden kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe cel-gebaseerde therapieën voor een groot scala aan weefsel technische toepassingen in de klinische praktijk.

Zoals blijkt uit figuur 1A, verkregen we hoge aantal levensvatbare cellen op de RCP microcarriers na 7 dagen van cultuur, bepaald door het leven/dood kleuring. Deze resultaten werden bevestigd door SEM analyse, waarbij volledig gekoloniseerde microcarriers werden waargenomen rond de poriën, deels overgrowing hen (figuur 1B). Aan de andere kant, resulteerde experimenten waarin cellen waren niet gelijkmatig ontpit in verschillende ...

Wij stellen voor een cel expansie protocol betreffende macroporeuze microcarriers en hun gebruik als levering systeem in een bioreactor perfusie om het zonebeheer van een matrix decellularized weefsel. Wij omvatten ook verschillende technieken om te bepalen van celproliferatie en levensvatbaarheid van cellen gekweekt op microcarriers. Bovendien tonen we functionaliteit van cellen na bioreactor culturen.

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Het algemene doel van deze procedure is om de cellen uit te breiden op een hoge beschikbare oppervlakte en deze cellen vervolgens te leveren op plaatsen met een defect of waar zij klinisch nodig zijn. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van weefsel engineering te beantwoorden, zoals celuitbreiding, celbezorging en vascularisatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de cellen kunnen uitbreiden en ze kunnen leveren, zonder een oogststap, naar defectplaatsen, op een biocompatibele manier.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat werkende microdragers en bioreactoren in eerste instantie gecompliceerd kunnen lijken vanwege de vele stappen die erbij komen kijken. Bij het helpen met de procedure zal Jihyoung Choi, een promovendus uit ons laboratorium, behulpzaam zijn. Een dag voor de experimenten, zet de spinner flessen op en bereid ze voor op sterilisatie door autoclaving.Wickel de spinner flessen afzonderlijk rond de zijkappen met aluminiumfolie om besmetting tijdens het uitpakken te voorkomen. Wikkel de flessen met één tot twee lagen aluminiumfolie voor het autoclaven om besmettingsrisico's na sterilisatie te minimaliseren. Laat de doppen van de spinner flessen los en steriliseer ze, indien mogelijk, in een rechtopstaande positie.Weeg vervolgens de benodigde hoeveelheid RCP macroporeuze microdragers in 20 milliliter Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing. Laat ze minimaal een uur hydrateren voordat u ze door autoclaving warmte steriliseert. Gebruik het bioreactorsysteem dat in de tekstprotocol wordt genoemd om gevasculariseerd weefselequivalenten te produceren.Deze bioreactor bestaat uit een vat waarin de biomatrix wordt geplaatst, een medium reservoir en een drukfles. Verbind het vat met het medium reservoir en de drukfles via siliconen slangen. Laat de doppen los en plaats het systeem in een autoclave kunststof zak.Sluit de zak goed en plaats deze in een tweede autoclave kunststof zak voordat u het door autoclaving steriliseert. Laat de gesteriliseerde RCP macroporeuze microdragers naar de bodem zinken en spoel ze met 10 milliliter kweekmedium. Herhaal dit proces drie keer.Spoel ook de spinner flessen met 10 milliliter kweekmedium. Voeg vervolgens 30 milligram RCP macroporeuze microdragers per spinner fles toe aan acht milliliter kweekmedium. Breng de RCP macroporeuze microdragers in de spinner flessen in evenwicht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 30 minuten voordat u de cellen zaait.Zaai vervolgens een half miljoen menselijke beenmerg afgeleide mesenchymatische stromale cellen, of humane dermale microvasculaire endotheelcellen per spinner fles in twee milliliter kweekmedium. Plaats de spinner flessen op een roerplaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en begin met roeren op 90rpm gedurende vijf minuten. Laat vervolgens rusten gedurende 55 minuten voor een totale statische dynamische incubatie van een uur.Herhaal deze incubatiecyclus vier keer. Voeg nu 10 milliliter celkweekmedium per spinner fles toe. Begin vervolgens met continu roeren op 95rpm terwijl u incubeert bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Een dag voordat u begint met de bioreactor culturen, snijd de biomatrix longitudinaal aan de antimesenteriale zijde open en bevestig deze in een eerder gedesinfecteerde polycarbonaat frame. Nadat u de cellen hebt losgemaakt en geteld, gebruikt u een twee milliliter spuit om 10 miljoen HDMECs in duizend microliter kweekmedium te injecteren via de bewaarde vaten van de biomatrix. Injecteer ongeveer 700 microliter via de arteriële inlaat en ongeveer 300 microliter via de veneuze uitlaat.Incubeer de biomatrix met geïnjecteerde cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie uur om celhechting mogelijk te maken. Na incubatie moet de verbinding van de biomatrix met de bioreactor door twee personen worden gemaakt, waarbij moet worden gezorgd dat de arteriële en veneuze pedikels correct met de mediumstroom zijn verbonden. Vul het bioreactorsysteem met 350 milliliter vasculair endotheliale groeifactor, 1% penicilline streptomycine en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Plaats het frame in het vat van de bioreactor. Verbind vervolgens de arteriële en veneuze pedikels zorgvuldig met het vat. Start de perfusie door het bioreactorsysteem aan te sluiten op een peristaltiekpomp.Stel de druk in op 10 millimeter kwikkolom amplitude plus min één. Verhoog de druk stapsgewijs elke uur totdat u een druk van 100 millimeter kwikkolom amplitude plus min twintig bereikt. Meng 330 microliter 0,4% Collagen R-oplossing, 170 microliter 0,1% azijnzuur en 50 microliter medium M199 in een 15 milliliter Falconbuis.Houd het mengsel op ijs. Neem vervolgens de RCP microdragers uit de spinner flessen. Verwijder het kweekmedium volledig.Voeg vervolgens het volume natriumhydroxide toe dat nodig is om het collageenmengsel te neutraliseren. Zodra het is geneutraliseerd, meng het mengsel onmiddellijk met de RCP microdragers. Het is belangrijk om de gelering van het collageengel voor te laten gaan voordat u met de mediumstroom begint.Anders zal het gel loskomen en de microdragers worden weggespoeld vanuit het lumen van de biomatrix. Voeg het collageen gel RCP microdragermengsel toe aan het lumen van de biomatrix. Laat het gedurende 30 minuten geleren.Verbind vervolgens de bioreactor met de peristaltiekpomp en stel de druk in op 100 millimeter kwikkolom amplitude plus min twintig. Voer uiteindelijk analyses en uitlezingen van bioreactor culturen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve resultaten van celproliferatie op microdragers worden getoond door live dode kleuring waarin veel levende cellen kunnen worden waargenomen op de microdragers na zeven dagen dynamische culturen.Deze resultaten werden bevestigd door scanning elektronenmicroscopie analyse die volledig gekoloniseerde microdragers liet zien na zeven dagen dynamische culturen. HDMECs behielden hun functionaliteit na zeven dagen dynamische culturen op RCP microdragers. Hier onthult helderveldmicroscopie uitlopers die groeien vanaf de gekoloniseerde microdragers wanneer ze worden

recombinant-collagen-i-peptide-microcarriers-for-cell-expansion-their

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een belangrijke hindernis in de huidige stamceltherapie is het bepalen van de meest effectieve methode om deze cellen te leveren aan gastheer weefsels. Hier beschrijven we een chitosan-gebaseerde levering methode die is efficiënt en eenvoudig in aanpak, terwijl vet-afgeleide stamcellen om hun multipotent te behouden.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Weefselmanipulatie omvat vaak in vitro expansie om autologe voor weefselregeneratie creëren. Deze studie geeft een werkwijze voor weefselexpansie, regeneratie, reconstructie en in vivo werd ontwikkeld om de verwerking van cellen en biologische materialen buiten het lichaam te minimaliseren.

Gehakt Tissue in Compressed Collageen: A-cel met Biotransplant voor Single-geënsceneerde Reconstructieve Repair

We presenteren een protocol om cellen afgeleide matrices rijk aan extracellulaire matrix eiwitten te verkrijgen, met behulp van macromoleculaire Crowders (MMC). Bovendien presenteren we een protocol dat MMC in 3D organotypische co-kweek huid generatie, die kweektijd vermindert behoud looptijd construct omvat.

Verbetering van 2D- en 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Leer celuitbreiding op macroporeuze microcarriers voor weefselengineering met een perfusiebioreactor. Deze methode maakt biocompatibele celafgifte mogelijk zonder oogststap voor klinische toepassingen.

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model (Video) | JoVE Journal

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Meer video's verkennen