Name: Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer immunocytochemische analyse van proliferatiemarkers in paraffine-ingebouwde celblokken. Deze technisch eenvoudige methode behoudt de morfologie van gekweekte cellen en ondersteunt klinisch pathologisch onderzoek naar eiwitexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door onderzoekssubsidies aan K.-M.H. uit de nationale Cancer Center, Korea (1510121) en de National Research Foundation, Korea (nr. NRF-2015R1A2A2A04007432).

Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).
1. monstervoorbereiding (30 min)
<ol><li>Voor de cultuur van HeLa cellen (CCL-2, ATCC), door 10 mL volledige DMEM medium (foetale runderserum 10%, 1% pen-strep) in een schotel van 100 mm cultuur te gebruiken. Ter voorbereiding van serum-uitgehongerd HeLa cellen, incubeer confluente HeLa cellen in DMEM zonder foetale runderserum 48 uur, zoals wordt beschreven in een eerdere studie11.</li>
	<li>Als u wilt loskoppelen van de cellen, wassen ze met 2 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en voeg 2 mL 0,25% EDTA trypsine per 100 mm cultuur schotel. Vervolgens, Incubeer gedurende 2-3 min in een CO2 incubator bij 37 ° C.</li>
	<li>Voeg 5 mL van volledige DMEM medium op de cultuur dish deactiveren trypsine en de vrijstaande cellen overbrengen in een tube van 15 mL. Centrifugeer dan de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten om te vormen van een pellet.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en wassen van de pellet tweemaal met 2 mL koude PBS door centrifugeren bij 300 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Na verwijdering van de bovendrijvende substantie, 1 mL 95% ethanol toevoegen aan de cel pellet, en meng de cel pellet met ethanol door vortexing. Houden de vaste cellen op ijs totdat de cel-blok voorbereiding.</li>
</ol>2. cel-blok voorbereiding (1 h 30 min)
<ol><li>Voor de bereiding van bevroren plasma aliquots, verzamelen EDTA-plasma uit gezonde donor bloed centrifuge op 13.000 x g voor 10 min. verzamelen het supernatant plasma en aliquot 200-400 µL, elk in microfuge buizen. De aliquots bij-80 ° C bewaren tot gebruik. Wanneer het bevroren plasma aliquots klaar bent, halen ze en ontdooien van het plasma door incubatie bij 37 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer de vaste cellen bij 700 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Meng de cel pellet met 2 druppels (ongeveer 200 µL) van de plasma, 2 druppels thromboplastin en 2 druppels van 0,025 M calciumchloride. Dan meng ze door pipetteren.</li>
	<li>Laat het mengsel vormen een cel stollen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, zoals weergegeven in figuur 2A. Vervolgens wassen de cel clot met PBS twee keer door gieten en PBS Pipetteer te verwijderen. De representatieve wit cel clot is afgebeeld in figuur 2B.</li>
	<li>Bevochtig een stuk filtreerpapier met formaline, en wikkel de klonter van de cel met het vooraf bevochtigd koffiefilter. Plaats vervolgens de gestold mengsel met een pincette in een weefsel cassette zoals weergegeven in figuur 2C.</li>
	<li>Plaats de cassette weefsel in een glazen pot met 50 mL gebufferd formaline (10% formaline in PBS) 's nachts bij 4 ° C voor fixatie van formaline.</li>
</ol>3. de weefsels verwerking en paraffine insluiten ('s nachts)
<ol><li>Laden van de weefsel cassette met de formaline-vaste cel-clot overnachting in een weefsel processor zoals eerder beschreven11. De verwerking van het weefsel is voor verwijdering van water en conditionering van vaste cellen voorafgaand aan paraffine insluiten. Uitvoeren voor onderzoek zonder weefsel verwerking, het weefsel veredeling zoals aangegeven in tabel 1.</li>
	<li>Zet op de verwarmde insluiten station, en 60 minuten later, te controleren dat er gesmolten paraffine in de metalen mal daarin is (figuur 2D).</li>
	<li>Nemen van de opgemaakte cel clot van de weefsel cassette en plaats deze in de gesmolten paraffine binnen de metalen mal.</li>
	<li>Plaats de nieuwe cassette van het weefsel zonder het deksel in de metalen mal met de cel in het midden van de gesmolten paraffine stollen, en giet meer gesmolten paraffine in het weefsel cassette en op de metalen mal. Dan, laat de paraffine stollen in de koude plaat voor 30-60 seconden.</li>
	<li>De cassette van het weefsel van de metalen mal scheiden. Het blok van de cel paraffine is dan klaar voor immunocytochemie. De ingesloten cel clot in het blok van paraffine-ingebedde cel wordt aangegeven door de pijl in figuur 2E.</li>
</ol>4. voorbereiding van de dia's van immunocytochemie (1 h)
<ol><li>Controleren van het gebied voor de cel clot in het blok van de cel paraffine, en het blok van de cel snijd in plakjes met diktes van 3-4 µm gebruikend microtome. Zetten de paraffine secties silane-gecoat glas dia's, zoals aangegeven in figuur 2F.</li>
	<li>Plaats de sectie dia's in een oven van 37 ° C gedurende 30 minuten om de secties die voldoen aan de dia's.</li>
</ol>5. immunocytochemie van cel blokken (6 h)
Opmerking: Voor immunocytochemische kleuring op cel-blok secties, verschillende kits kunnen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen). Alle dergelijke kits hebben verschillende gevoeligheden en kenmerken afhankelijk van hun wijzigingen.
<ol><li>Incubeer de secties in 50 mL xyleen voor 4 min aan de paraffinize.</li>
	<li>Incubeer de dia's in 100% ethanol voor 2 min voor uitdroging, en twee keer in ethanol 95%, en in 80% ethanol gedurende 2 minuten. Verwijder vervolgens de ethanol in stromend water gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Voor antigeen ophalen, plaatst u de dia's in een pot met 40 mL Tris-EDTA ophalen buffer, pH 9.0, en kook in een fornuis voor 30 min.</li>
	<li>De dia's onder stromend water wassen, en hen uit te broeden in ethanol van 95% gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Vervolgens, markeert de cel-kleuring gebied op de dia's met een pen van de Pap voor gemakkelijke identificatie.</li>
	<li>Wassen van de dia's in een Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,2% tween-20 (TBS-T), en uit te broeden in het blok van waterstofperoxide (Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 15 min. enige overblijfsel peroxidase activiteit verwijderen. Vervolgens de dia's in TBS-T wassen drie keer voor elke 2 min.</li>
	<li>Bereid verdunde antilichaam-oplossing door het verdunnen van primair antilichaam in het blok eiwit (Zie Tabel van materialen). Bijvoorbeeld, de CKAP2 primair antilichaam kan worden verdund 1:100, en de Ki-67 antilichaam 1:500. Vervolgens de dia's in 100 µL van verdunde antilichaam oplossing voor 1 h uit te broeden.</li>
	<li>Na het wassen in TBS-T vijf keer voor elke 2 min, de dia's in de primair antilichaam enhancer in de kit voor 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker uit te broeden.</li>
	<li>Na het wassen in TBS-T viermaal voor elke 2 min, voeg 2 druppels HRP polymeer (een secundair antilichaam aangeduid met mierikswortelperoxidase), en de dia's bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Na het wassen in TBS-T vijf keer voor elke 2 min, voeg 100 µL van diaminobenzidine (DAB) oplossing (Zie Tabel of Materials), en de dia's gedurende 3 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Na het wassen in TBS-T twee keer, voeg 100 µL van de Haematoxyline oplossing (het mengsel van 100 µL van de haematoxyline en 600 ÂµL van gedistilleerd water), en de dia's voor 1 min uit te broeden.</li>
	<li>Na het wassen uitdrogen de dia's in TBS-T een keer door broeden in 95% ethanol voor 2 min, eenmaal dompelen in 95% ethanol en dompelen in 100% ethanol twee keer. Vervolgens de dia's in 40 mL xyleen in een glazen pot gedurende 5 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Wanneer de dia's zijn droge van xyleen, mount de respectieve coverslips.</li>
	<li>Observeer de kleuring patronen met behulp van de lichte microscopie.</li>
</ol>

<ol><li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419424">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/10/1703">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23299451">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4(2013).</li>
<li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li>
<li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li>
<li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+block+cytology%3A+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li>
<li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value%2C+feasibility%2C+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li>
<li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8390929">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li>
<li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein%2C+CKAP2%2C+with+microtubule-stabilizing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li>
<li>Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+%28TMAP%29%2Fcytoskeleton+associated+protein+2+%28CKAP2%29+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li>
<li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CKAP2+%28cytoskeleton-associated+protein2%29+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107(2017).</li>
<li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients%3A+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li>
<li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li>
<li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining%3A+The+fluorescent+antibody+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li>
</ol>

Alle auteurs hebben verklaard geen belangenconflicten.

Immunefluorescentie kleuring op vaste gekweekte cellen is momenteel de methode van keuze voor bepaling van eiwit expressie gehalte in cellen met behoud van morfologische informatie1. Immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken kan echter een uitstekend alternatief. De gedetailleerde procedures voor de bereiding van paraffine-ingebedde cel blokken en immunocytochemie zijn beschreven in dit protocol, en wij hopen dat het de toepassing van immunocytochemie in cel studies kan vergemakkelijken.
Immunocytochemie heeft verschillende voordelen ten opzichte van immunefluorescentie kleuring. Vers gekweekte cellen immunefluorescentie kleuring voor cellen gewoonlijk vereist, maar cel paraffineblokken houdbaar bij kamertemperatuur voor meerdere jaren13. Bovendien kunt immunocytochemie op cel blokken intracellulaire expressiepatronen verkennen door gebruik te maken van het zelfde antilichaam gebruikt in routine immunohistochemistry op menselijke weefsels4. Bovendien vindt het de veranderingen in eiwitniveaus of posttranslationele modificaties hetzij door cellen met verschillende drugs of onder verschillende cultuur voorwaarden11vooraf aan het broeden.
In tegenstelling tot de voordelen van immunocytochemische kleuring, de voorbereiding van paraffine-ingebedde cel blokken kost tijd en is kostbaar14. Ook de meeste onderzoekslaboratoria niet veel ervaring in deze techniek, en technische fouten onder dergelijke omstandigheden gelden. De meest voorkomende fouten zijn arme behoud van cel morfologie en arme of onregelmatige immunocytochemische kleuring op de paraffine cel blok secties. Deze en de meeste anderen kunnen worden vermeden door het maken van cel blokken onder de beste omstandigheden van de cel en gebruiken van genoeg oplossing vormen van cel stolsels.
Als een demonstratie van het huidige protocol, cel blokken waren voorbereid op HeLa cellen, en voor twee markeringen van de proliferatie, CKAP2 en Ki-67, zoals eerder gemeld11immunocytochemische kleuring werd uitgevoerd. De cellen werden gemanipuleerd door incubatie in media met en zonder foetale runderserum immunocytochemie, en het effect van serum honger kon worden waargenomen. Deze blokken bereid paraffine-ingebedde cel kunnen worden gebruikt voor een groot aantal antilichamen, omdat veel glijbanen kunnen bereid worden uit een blok van de cel met behulp van alleen een 4-5 µm dik cel-sectie block per dia. Daarom kunnen expressiepatronen overeenkomt met twee verschillende voorwaarden met verscheidene verschillende antilichamen worden geëvalueerd. De immunokleuring patronen voor CKAP2 en Ki-67 in kanker weefsels reeds gemeld9,10,11,12, en de immunocytochemische kleuring resultaten kan gemakkelijk behandeld worden, omdat de kleuring patronen waren vrij gelijkaardig aan die van immunohistochemistry.
Kortom, kunnen immunocytochemische kleuring op cel paraffineblokken een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring; Bovendien, het kan worden gemakkelijk en betrouwbaar ingezet bij het basisonderzoek voor expressie profilering in cellijnen behoud van morfologische informatie.

In de meeste laboratoria, worden paraffine-ingebedde cel blokken niet vaak gebruikt. Integendeel, vaste gekweekte cellen, niet paraffine-ingebedde cellen, zijn werkzaam in subcellular localisatie studies. Voor deze vaste gekweekte cellen, is fluorescentie in plaats van chromogeen gebruikt. Immunefluorescentie kleuring is daarom op dit moment de methode van keuze voor eiwit expressie gehaltebepaling in onderzoek cel culturen1dienst. Dia's voorbereid immunefluorescentie kleuring, kunnen echter alleen onder immunefluorescentie microscopie, waaruit zou kunnen beelden heel anders dan die vermeld onder vliegtuig microscopie2worden waargenomen. Daarnaast behoud van dia's voor immunefluorescentie kleuring vereist bescherming tegen fel licht en fluorescerende signalen worden zwakker met herhaalde blootstelling voor imaging te wijten aan het verlies van de fluorescent signaal3. Resultaten van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken zijn vrij gelijkaardig aan die van immunohistochemistry op weefsels paraffine-ingebedde4, en ze kunnen gemakkelijk worden omgezet in klinische informatie. Immunocytochemie kan dus een uitstekend alternatief. Echter, cel-blok voorbereiding niet populair geweest in fundamenteel onderzoekslaboratoria. In dit protocol, vervolgens cel-blok voorbereiding en immunocytochemische kleuring worden geleverd ter bevordering van het gebruik van deze methode op het gebied van celkweek studies.
Cel-blok voorbereiding en immunocytochemie zijn geen unieke methoden, en zij hebben al van klinische diagnose toegepast op fundamenteel onderzoek4,5. Hoewel verschillende cel-blok voorbereiding methoden zijn gemeld4,is6 het thromboplastin-plasma methode eenvoudig, rendabel en gemakkelijk aan te passen. Daarom, in het protocol gepresenteerd in deze paper, de thromboplastin-plasma methode4,5,6,7,8 wordt gebruikt voor bereiding van paraffine-ingebedde cel blokken.
In de huidige studie, werden de gedetailleerde procedures voor het opstellen van thromboplastin-plasma cel blokken en de methode van de immunocytochemie twee proliferatie markeringen in dienst gedemonstreerd. Een marker is cytoskelet-geassocieerde proteïne 2 (CKAP2), die onlangs werd gerapporteerd als een mitotische marker9,10,11; de andere is Ki-67, die de bekendste proliferatie marker12 is. Het representatieve stelsel is afgebeeld in Figuur 1.

<table><tbody><tr><td>HeLa Cellen</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&nbsp;CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethenol</td><td>GD Chem</td><td>DJ16016</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylinen</td><td>Agilent</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB Quanto Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision LP detectie Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PBQ141209, LPB141209, LPH141210</td><td>Kit voor immunocytochemie; bevat eiwitblok</td></tr><tr><td>TintoRetriever Drukpan</td><td>Bio SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-gebufferde zoutoplossing</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corporation</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>Tromboplastine</td><td>Neoplastin Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA herstelpuffer</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ultra vision peroxide blok H2O2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>Montage Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>Pap-Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>PAA Laboratories</td><td>H21-002</td><td></td></tr><tr><td>Formaline</td><td>Daejung</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>15 ml buis</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>weefselverwerkingscassette</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>100 mm kweekschalen</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Glazen plaat</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Marienfeld</td><td>2262817</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Zar</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Class II Laminar Flow Hood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1300 series A2</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel Processor</td><td>Leica BioSystem</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine inbeddingsstation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel Sectie Bad (Rond)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>Afzuigkap</td><td>Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunefluorescentie kleuring is momenteel de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie in celkweek systemen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Het protocol van immunocytochemische kleuring op cel paraffine-ingebedde blokken, hier vermelde is een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring op niet-paraffine-ingebedde vaste cellen. In dit protocol, een paraffine cel blok van HeLa cellen werd opgesteld op basis van de thromboplastin-plasma-methode en immunocytochemie werd uitgevoerd voor de beoordeling van twee markeringen van de proliferatie, CKAP2 en Ki-67. De kernen en cytoplasmatische morfologie van de HeLa cellen werden goed bewaard gebleven in de cel-blok dia's. Tegelijkertijd waren de CKAP2 en Ki-67 kleuring patronen in de immunocytochemie vrij gelijkaardig aan degenen in immunohistochemische kleuring in paraffine kanker weefsels. Met gewijzigde cel-cultuur-voorwaarden, met inbegrip van pre-incubatie van HeLa cellen in serumvrij omstandigheden, kan het effect met behoud van de architectonische informatie worden geëvalueerd. Kortom, is immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring.

In een haematoxyline en-eosine-gebeitste dia uit de cel paraffine-ingebedde blok (figuur 3AB) zijn de meeste van de kernen en het cytoplasma van de cellen intact, suggereert dat de morfologische behoud uitstekend met de huidige protocol is ( Figuur 3A). In de immunocytochemische kleuring, werd positieve CKAP2 kleuring waargenomen in gecondenseerde chromatine, mitotische spindel en cytoplasma (Figuur 4), als eerder gemeld10. Ki-67 kleuring werd waargenomen in de celkernen, als verwachte (Figuur 4). Alleen de cellen met CKAP2 vlekken in gecondenseerde chromatine mitotische cellen (Zie de pijlen in figuur 4AB) waren. Vele CKAP2-positieve cellen werden getoond in de zeer mitotische HeLa cellen die was opgesteld na een incubatie in volledige medium (figuur 4A). Ter vergelijking waren er weinig CKAP2-positieve cellen in de serum-uitgehongerd HeLa cellen (figuur 4B). Allermeest naar de hoogst mitotische HeLa cellen werden Ki-67 positief (figuur 4C). Productiestappen, bleef het Ki-67-positieve tarief in de serum-uitgehongerd HeLa cellen zo hoog als ~ 50% (Figuur 4 d). Deze resultaten zijn zeer vergelijkbaar zijn met die van een vorige verslag11, hetgeen suggereert dat CKAP2 een meer betrouwbare proliferatie marker in kankercellen is dan Ki-67.
In slecht voorbereid cel blokken, de kernen zijn gescheiden van het cytoplasma, en er is ook, resultantly, arme morfologische behoud. Langer-dan-'s nachts incubatie van vaste cellen in een koelkast kan zulke slechte resultaten. Een ander belangrijk probleem is dat de cellen niet goed door immunocytochemie, ondanks de uitstekende morfologie worden gekleurd. Dit probleem zich vaker voordoet wanneer de cel clot klein is. De intensiteit van kleuring is meestal onregelmatige zoals weergegeven in figuur 3B; maar wanneer de cel clot groter is, is er veel minder kans op onregelmatige kleuring. Daarom in dit protocol verhoogd we de hoeveelheid plasma, thromboplastin en calciumchloride om te vormen van een grote cel clot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> Figuur 1: cel-blok voorbereiding regeling. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> Figuur 2: voorbeeld van paraffine cel-blok voorbereiding. (A) thromboplastin-plasma cel clot in buis. (B) TP cel clot na het wassen van de PBS. (C) cel clot op filterpapier bevochtigd. (D) weefsel-insluiting station met gesmolten wax. Metalen mal (pijl) houdt gesmolten wax voor stolling. (E) paraffine-ingebedde cel clot (pijl) ingebed in paraffine of paraffine-ingebedde cel blok. (F) dunne paraffine sectie op het middelste deel van een gecoate dia. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> Figuur 3: voorbereiding van de cel-blok en bevestiging van kwaliteit door de haematoxyline en eosine en immunokleuring. (A) de haematoxyline-en-eosine-gekleurd beeld van HeLa cellen in de sectie van een paraffine-ingebedde cel-blok. (B) onregelmatige kleuring van Ki-67 in immunocytochemie op een slecht voorbereid sectie paraffine-ingebedde cel-block. Schaal bars zijn (A) 100 en (B) 200 μm. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> Figuur 4: immunocytochemische kleuring op cel paraffine-ingebedde blok voor HeLa cellen. (A) CKAP2 kleuring zeer mitotische omstandigheden. (B) CKAP2 kleuring onder voorwaarden serum-uitgehongerd. (C) Ki-67 kleuring zeer mitotische omstandigheden. (D) Ki-67 kleuring onder voorwaarden serum-uitgehongerd. 100 μm schaal balken worden weergegeven. Lijn de pijlpunten uit geven aan CKAP2-positieve cellen. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Procedure</td>
			<td>Stappen</td>
			<td>Oplossing</td>
			<td>Tijd/temperatuur</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Uitdroging</td>
			<td>1</td>
			<td>70% alcohol</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>80% alcohol</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>95% alcohol</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% alcohol</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Clearing</td>
			<td>1</td>
			<td>Xyleen</td>
			<td>60 min/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Xyleen</td>
			<td>10 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Xyleen</td>
			<td>10 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Xyleen</td>
			<td>10 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT, kamertemperatuur</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Weefsel veredeling.

Momenteel is de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie immunefluorescentie kleuring op vaste cellen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Dit protocol gepresenteerd hierin voorziet in een alternatieve methode van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken.

Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van proliferatiemarkers van belang te analyseren door immunocytochemische en histologische analyses van ingebedde weefselklonten van tromboplastine-plasmacellen. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vraag over de klinische pathologie van celblokkering door de weefsels te beantwoorden. Het belangrijkste voordeel van deze alternatieve methode voor immunocytochemische analyse van in paraffine ingebedde celklonen is de technische eenvoud van de procedures.Wanneer een 100 millimeter schotel met HeLa-celcultuur confluentie bereikt, vervang het supernatant met 10 milliliter HeLa-celcultuurmedium zonder FBS en plaats de schotel terug in de celcultuurincubator. Na 48 uur, was de cellen met twee milliliter PBS gevolgd door incubatie in twee milliliter 0,25% EDTA plus trypsine gedurende twee tot drie minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Wanneer de cellen zijn losgelaten, stopt u de reactie met vijf milliliter compleet medium en brengt u de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis.Verzamel de cellen door centrifugatie gevolgd door twee wasbeurten in twee milliliter koud PBS per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, vervang het supernatant met één milliliter 95% ethanol en meng het pellet door middel van vortexing. Plaats vervolgens de gefixeerde cellen op ijs.Om een paraffine-celblok te bereiden, na het verzamelen van EDTA-plasma van gezond donorbloed, centrifugeer de monsters en breng 200 tot 400 microliter supernatant plasma-aliquots over naar afzonderlijke microfugebuisjes. Voeg vervolgens ongeveer 200 microliter plasma, ongeveer 200 microliter tromboplastine en ongeveer 200 microliter 025 molaire calciumchloride toe aan de gefixeerde HeLa-cellen. Laat de mengsels gedurende tien minuten bij kamertemperatuur cellen kluiten vormen, was vervolgens de klonten twee keer met één milliliter PBS en laat de klonten volledig uitlekken op afzonderlijke stukken formaline bevochtigd filterpapier na de tweede wasbeurt.Wickel de klonten in het filterpapier en gebruik een pincet om de klonten in afzonderlijke weefselcassettes in het midden van vier andere stukken formaline bevochtigd papier te plaatsen. Plaats vervolgens de weefselcassettes in glazen potten met 50 milliliter gebufferde formaline voor overnachtige formaline fixatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend laadt u de cassettes in een weefselprocessor voor overnacht waterverwijdering en gefixeerde celconditioning.Ten minste een uur voor het einde van de verwerkingsprocedure, zet u een verwarmde inbeddingsstation aan om de paraffine te smelten. Wanneer de inbeddingsstation en de klont klaar zijn, bevestigt u de aanwezigheid van gesmolten paraffine in de metalen mal en brengt u een gevormde celklont over in de paraffine. Plaats een nieuwe weefselcassette zonder deksel in de metalen mal en bedek de cassette met meer gesmolten paraffine.Laat de paraffine gedurende 30 tot 60 seconden in een koude plaat stollen. Scheid vervolgens de weefselcassette van de metalen mal. Om secties voor immunocytochemische analyse voor te bereiden, lokaliseert u de celklont in een paraffine-celblok en gebruikt u een microtoom om het blok in drie tot vier micrometer dikke plakjes te snijden.Plaats paraffine secties op met zout beklede glazen slides en plaats de slides in een oven van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Wanneer de secties aan de slides hechten, ontparaffiniseert u de slides in 15 milliliter xyleen gedurende vier minuten gevolgd door dehydratie van de secties met sequentiële twee minuten dalende ethanol incubaties. Na de 80% ethanol incubatie, spoelt u de secties in stromend water gedurende 10 minuten en kookt u de slides in een pot met 40 milliliter tris-EDTA retrievable buffer gedurende 30 minuten.Aan het einde van de incubatie, was de antigeen retrieved slides onder stromend water gevolgd door een 10 minuten incubatie in 95% ethanol bij vier graden Celsius. Na luchtdroging, gebruikt u een hydrofobe pen om het celkleuringsgebied op elke slide te omcirkelen. Was de slides in TBS-T gevolgd door incubatie in waterstofperoxide blok gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om eventuele resterende peroxidase activiteit te verwijderen.Was de slides drie keer in TBS-T gedurende twee minuten per wasbeurt, label vervolgens de secties met 100 microliter primaire antilichaam mix uit de immunocytochemische kleurkit van belang gedurende één uur gevolgd door vijf twee minuten TBS-T wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, incubeer de slides in primaire antilichaam versterker uit de kit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie, was de secties vier keer in TBS-T met toevoeging van ongeveer 200 microliter secundair antilichaam gelabeld met paardenradenzymperoxidase na de laatste wasbeurt voor een 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur.Was de versterkte secties vijf keer in verse TBS-T gevolgd door de toevoeging van 100 microliter diaminobenzidine oplossing per sectie gedurende drie minuten. Was de slides twee keer in TBS-T en label de secties met 100 microliter hematoxiline oplossing gedurende één minuut. Was vervolgens de slides nog een keer in TBS-T en incubeer de slides in 95% ethanol gedurende twee minuten gevolgd door één duik in verse 95% ethanol en twee duiken in 100% ethanol.Incubeer de ethanol gedehydrateerde secties in 40 milliliter xyleen in een glazen pot gedurende vijf minuten en laat de slides drogen. Monteer vervolgens een dekglas op elke slide en observeer de monsters onder een lichtmicroscoop. Hematoxyline en eosinekleuring van het in paraffine ingebedde weefsel zoals zojuist gedemonstreerd, toont voornamelijk intacte kernen en cytoplasma wat wijst op een uitstekende morfologische behoud van de celmonsters door deze methode.Slecht voorbereide celklonen vertonen echter een slechte morfologie en onregelmatige kleuring, zelfs als de monsters goed gekleurd zijn. Cytoskelet geassocieerd eiwit twee wordt typisch waargenomen binnen de gecondenseerde chromatine, mitotische spoel en cytoplasma. Alleen de cellen met cytoskelet geassocieerd eiwit twee kleuring in de gecondenseerde chromatine zijn mitotische cellen, terwijl er weinig cytoskelet geassocieerd eiwit

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Hier beschrijven we een methode om moleculaire heterogeniteit kwantificeren in histologische secties van tumor materiaal met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie, beeldanalyse, en een statistische maatstaf voor heterogeniteit. De methode is bedoeld voor gebruik in klinische biomarker ontwikkeling en analyse.

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

This video demonstrates a method for monitoring infected cell protein 0, ICP0 trafficking in herpes simplex virus-1 infection. Post-de novo synthesis, ICP0 translocates to the nucleus, later moving to the cytoplasm during infection progression. Immunofluorescence microscopy reveals and analyzes the protein's subcellular localization, offering insights into its trafficking across infection phases.

An Immunofluorescence Technique for Viral Protein Localization in Infected Cells

Hier wordt een nieuwe kwantitatieve fluorescentietest ontwikkeld om veranderingen in het niveau van een specifiek eiwit op centrosomen te meten door de fluorescentie-intensiteit van dat eiwit te normaliseren naar die van een geschikte interne standaard.

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.

Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpelletcontroles voor immunohistochemie.

Gestandaardiseerde verwerking voor formaline-vaste, paraffine-ingebedde cel pellet immunohistochemische controles

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Multiparameter fluorescentie immunohistochemie kan worden gebruikt om het aantal, relatieve verdeling en lokalisatie van immuuncellenpopulaties in de tumor micro-omgeving te beoordelen. Dit manuscript beschrijft het gebruik van deze techniek om T-cel subpopulaties in orofaryngeale kanker te analyseren.

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

Leer immunocytochemische analyse van proliferatiemarkers in paraffine-ingebouwde celblokken. Deze technisch eenvoudige methode behoudt de morfologie van gekweekte cellen en ondersteunt klinisch pathologisch onderzoek naar eiwitexpressie.

Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

Meer video's verkennen