Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken
20 mei 2018
Momenteel is de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie immunefluorescentie kleuring op vaste cellen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Dit protocol gepresenteerd hierin voorziet in een alternatieve methode van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken.
Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van proliferatiemarkers van belang te analyseren door immunocytochemische en histologische analyses van ingebedde weefselklonten van tromboplastine-plasmacellen. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vraag over de klinische pathologie van celblokkering door de weefsels te beantwoorden. Het belangrijkste voordeel van deze alternatieve methode voor immunocytochemische analyse van in paraffine ingebedde celklonen is de technische eenvoud van de procedures.
Wanneer een 100 millimeter schotel met HeLa-celcultuur confluentie bereikt, vervang het supernatant met 10 milliliter HeLa-celcultuurmedium zonder FBS en plaats de schotel terug in de celcultuurincubator. Na 48 uur, was de cellen met twee milliliter PBS gevolgd door incubatie in twee milliliter 0,25% EDTA plus trypsine gedurende twee tot drie minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Wanneer de cellen zijn losgelaten, stopt u de reactie met vijf milliliter compleet medium en brengt u de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis.
Verzamel de cellen door centrifugatie gevolgd door twee wasbeurten in twee milliliter koud PBS per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, vervang het supernatant met één milliliter 95% ethanol en meng het pellet door middel van vortexing. Plaats vervolgens de gefixeerde cellen op ijs.
Om een paraffine-celblok te bereiden, na het verzamelen van EDTA-plasma van gezond donorbloed, centrifugeer de monsters en breng 200 tot 400 microliter supernatant plasma-aliquots over naar afzonderlijke microfugebuisjes. Voeg vervolgens ongeveer 200 microliter plasma, ongeveer 200 microliter tromboplastine en ongeveer 200 microliter 025 molaire calciumchloride toe aan de gefixeerde HeLa-cellen. Laat de mengsels gedurende tien minuten bij kamertemperatuur cellen kluiten vormen, was vervolgens de klonten twee keer met één milliliter PBS en laat de klonten volledig uitlekken op afzonderlijke stukken formaline bevochtigd filterpapier na de tweede wasbeurt.
Wickel de klonten in het filterpapier en gebruik een pincet om de klonten in afzonderlijke weefselcassettes in het midden van vier andere stukken formaline bevochtigd papier te plaatsen. Plaats vervolgens de weefselcassettes in glazen potten met 50 milliliter gebufferde formaline voor overnachtige formaline fixatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend laadt u de cassettes in een weefselprocessor voor overnacht waterverwijdering en gefixeerde celconditioning.
Ten minste een uur voor het einde van de verwerkingsprocedure, zet u een verwarmde inbeddingsstation aan om de paraffine te smelten. Wanneer de inbeddingsstation en de klont klaar zijn, bevestigt u de aanwezigheid van gesmolten paraffine in de metalen mal en brengt u een gevormde celklont over in de paraffine. Plaats een nieuwe weefselcassette zonder deksel in de metalen mal en bedek de cassette met meer gesmolten paraffine.
Laat de paraffine gedurende 30 tot 60 seconden in een koude plaat stollen. Scheid vervolgens de weefselcassette van de metalen mal. Om secties voor immunocytochemische analyse voor te bereiden, lokaliseert u de celklont in een paraffine-celblok en gebruikt u een microtoom om het blok in drie tot vier micrometer dikke plakjes te snijden.
Plaats paraffine secties op met zout beklede glazen slides en plaats de slides in een oven van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Wanneer de secties aan de slides hechten, ontparaffiniseert u de slides in 15 milliliter xyleen gedurende vier minuten gevolgd door dehydratie van de secties met sequentiële twee minuten dalende ethanol incubaties. Na de 80% ethanol incubatie, spoelt u de secties in stromend water gedurende 10 minuten en kookt u de slides in een pot met 40 milliliter tris-EDTA retrievable buffer gedurende 30 minuten.
Aan het einde van de incubatie, was de antigeen retrieved slides onder stromend water gevolgd door een 10 minuten incubatie in 95% ethanol bij vier graden Celsius. Na luchtdroging, gebruikt u een hydrofobe pen om het celkleuringsgebied op elke slide te omcirkelen. Was de slides in TBS-T gevolgd door incubatie in waterstofperoxide blok gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om eventuele resterende peroxidase activiteit te verwijderen.
Was de slides drie keer in TBS-T gedurende twee minuten per wasbeurt, label vervolgens de secties met 100 microliter primaire antilichaam mix uit de immunocytochemische kleurkit van belang gedurende één uur gevolgd door vijf twee minuten TBS-T wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, incubeer de slides in primaire antilichaam versterker uit de kit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie, was de secties vier keer in TBS-T met toevoeging van ongeveer 200 microliter secundair antilichaam gelabeld met paardenradenzymperoxidase na de laatste wasbeurt voor een 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur.
Was de versterkte secties vijf keer in verse TBS-T gevolgd door de toevoeging van 100 microliter diaminobenzidine oplossing per sectie gedurende drie minuten. Was de slides twee keer in TBS-T en label de secties met 100 microliter hematoxiline oplossing gedurende één minuut. Was vervolgens de slides nog een keer in TBS-T en incubeer de slides in 95% ethanol gedurende twee minuten gevolgd door één duik in verse 95% ethanol en twee duiken in 100% ethanol.
Incubeer de ethanol gedehydrateerde secties in 40 milliliter xyleen in een glazen pot gedurende vijf minuten en laat de slides drogen. Monteer vervolgens een dekglas op elke slide en observeer de monsters onder een lichtmicroscoop. Hematoxyline en eosinekleuring van het in paraffine ingebedde weefsel zoals zojuist gedemonstreerd, toont voornamelijk intacte kernen en cytoplasma wat wijst op een uitstekende morfologische behoud van de celmonsters door deze methode.
Slecht voorbereide celklonen vertonen echter een slechte morfologie en onregelmatige kleuring, zelfs als de monsters goed gekleurd zijn. Cytoskelet geassocieerd eiwit twee wordt typisch waargenomen binnen de gecondenseerde chromatine, mitotische spoel en cytoplasma. Alleen de cellen met cytoskelet geassocieerd eiwit twee kleuring in de gecondenseerde chromatine zijn mitotische cellen, terwijl er weinig cytoskelet geassocieerd eiwit
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor immunocytochemische analyse van proliferatiemarkers met behulp van in paraffine ingebedde celblokken. Het protocol legt de nadruk op technische eenvoud, terwijl het betrouwbare morfologische informatie verschaft.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunocytochemie
- Histologische analyse
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Immunofluorescente kleuring wordt veelvuldig gebruikt voor de analyse van eiwitexpressie.
- Alternatieve methoden kunnen het proces vereenvoudigen terwijl de nauwkeurigheid behouden blijft.
- Inzicht in celproliferatie is cruciaal in de klinische pathologie.
- In paraffine ingebedde celblokken maken gedetailleerde morfologische studies mogelijk.
Doel van de studie
- Om proliferatiemarkers in celculturen te analyseren.
- Om een vereenvoudigd protocol te bieden voor immunocytochemische analyse.
- Om het morfologisch behoud van celmonsters te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Celkweek en behandeling met tromboplastine-plasma.
- Bereiding van paraffine-celblokken uit gefixeerde cellen.
- Snijden van paraffineblokken voor immunocytochemische analyse.
- Kleuring en microscopie om celmorfologie en markerexpressie te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonbare effectieve preservering van de celmorfologie.
- Identificatie van mitotische cellen door middel van specifieke eiwitkleuring.
- Aantoonbare correlatie tussen kleuringspatronen en celproliferatie.
- Nadruk op de voordelen van het gebruik van paraffine-ingebedde monsters.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbaar alternatief voor het bestuderen van celproliferatie.
- De technische eenvoud vergroot de toegankelijkheid voor onderzoekers.
- Behoudt hoogwaardige morfologische gegevens naast de analyse van eiwitexpressie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Immunocytochemie op in paraffine ingebedde celblokken biedt een technisch eenvoudig alternatief voor immunofluorescentiekleuring voor de analyse van eiwitexpressie, terwijl de morfologische informatie behouden blijft. Deze aanpak ondersteunt de validatie van targets en de ontwikkeling van assays door een betrouwbare detectie van proliferatiemarkers in gekweekte cellen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk te maken. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-fasen door de architecturale context te behouden naast kwantitatieve gegevens over de eiwitexpressie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de detectie van proliferatiemarkers zoals CKAP2 en Ki-67 in gedefinieerde cellulaire contexten.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door eiwitexpressiepatronen te correleren met mitotische activiteit en reacties op serumuitsluiting.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden door de subcellulaire lokalisatie van cytoskelet-geassocieerde eiwitten in gecondenseerd chromatine en cytoplasma te behouden.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door consistente paraffine-inbedding en coupesnijden van celclots.
- Operationele waarde: Adresseert assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde tromboplastine-plasmastolselvorming en histologische verwerking.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de geschiktheid voor screening door het genereren van kwantitatieve output van DAB-gebaseerde immunocytochemische kleuringen die compatibel zijn met lichtmicroscopische analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door correlatie van in vitro kleuringspatronen met die waargenomen in in paraffine ingebed kankerweefsel.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het behouden van een morfologische getrouwheid die vergelijkbaar is met immunohistochemische kleuring in weefsels.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicoreductie door evaluatie van gewijzigde kweekcondities (bijv. serumvrije pre-incubatie) mogelijk te maken, terwijl architecturale informatie behouden blijft.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode bevindt zich binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie, ter ondersteuning van hypothesetoetsing en de ontwikkeling van assays die zijn afgestemd op biomarkers, uitsluitend wanneer proliferatiemarkers relevant zijn voor het therapeutische doelwit.
- Ontdekkingsbiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing ondersteunt via de detectie van mitotische cellen door CKAP2- en Ki-67-kleuring in gecondenseerd chromatine.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay door gestandaardiseerde doorsneden (3-4 μm) en antigeenherstel met tris-EDTA-buffer voorafgaand aan de immunocytochemische kleuring.
- Analytica: Benadrukt metingen zoals de signaalintensiteit van het DAB-chromogeen en hematoxyline-tegenkleuring, waarmee vergelijking van eiwitexpressie over verschillende experimentele condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door aan te tonen dat het kleuringspatroon vergelijkbaar is met immunohistochemische analyse in paraffine-ingebed kankerweefsel.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor meerdere proliferatiemarkers en cellijnmodellen buiten HeLa-cellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door betrouwbare detectie van proliferatiemarkers met behoud van subcellulaire lokalisatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via tromboplastine-plasmastolling en geautomatiseerde weefselverwerking.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit in celcyclusanalyse via duale marker-validatie.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door het mogelijk maken van de beoordeling van compound-effecten op de mitotische index onder gedefinieerde kweekcondities.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in histologische technieken, antilichaamvalidatie en lichtmicroscopie.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een microtoom, weefselprocessor, verwarmd inbedstation en faciliteiten voor de omgang met xyleen.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor stolselvorming, sectieadhesie en consistentie van het kleuringsprotocol tussen laboratoria.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen, met name voor het optimaliseren van de celdichtheid en stolselvorming in niet-HeLa cellijnen.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal: slecht geprepareerde celblokken vertonen een gebrekkige morfologie en onregelmatige labeling, zelfs bij correcte kleuring.
