Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Het algemene doel van deze procedures is om een natuurlijke orale toedieningsmethode te demonstreren. Voor gen-specifieke dsRNA's, om RNA-interferentie in vivo en insectenplagen te induceren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over hoe biomoleculen in insecten kunnen worden afgeleverd, om de effecten van RNAi-gebaseerde moleculaire biopesticiden te verduidelijken en om insecten in het milieu te bestrijden.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat deze levering door genuitschakeling via nucleïnezuur kan worden toegepast op zowel plantensapvoedende als knaag-insecten. Hoewel de methoden hier de levering van dubbelstrengs RNA aan hemiptera-plagen demonstreren, zoals de bruine gespikkelde stinkwants, harlekijnwants en Aziatische citruspsyllid. Ze kunnen op andere insecten worden toegepast.

Om het protocol te starten, selecteer vroege 4e stadium bruine gespikkelde stinkwants, of BMSB-nimfen, uitgekomen uit het eimassa, en laat ze 24 uur voorafgaand aan het dsRNA-voer vasten. Selecteer vervolgens slanke, gecertificeerde biologische groene bonen en was ze vijf minuten met 0,2% natriumhypochlorietoplossing. Volg met drie dubbelgedestilleerd H2O-wasbeurten en laat de bonen aan de lucht drogen.

Zodra ze droog zijn, knip de groene bonen vanaf het kelk uiteinde tot een totale lengte van 7,5 centimeter af met een schone scheermes. Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een dop-loos, twee milliliter micro-centrifugebuisje dat 300 microliters controleoplossing bevat. Maak verdunningsreeksen van de in vitro gesynthetiseerde lac Z, JHAMT of VGDSRNA's, door 5 microgram of 20 microgram en 300 microliters RNA's, DNA's-vrij water te verdunnen om uiteindelijke concentraties van respectievelijk 0,017 microgram per microliter of 0,067 microgram per microliter te verkrijgen.

Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een dop-loos, twee milliliter micro-centrifugebuisje dat 300 microliters dsRNA-oplossing bevat. Wikkel en verzegel de randen van de micro-centrifugebuisjes, waarbij de ondergedompelde bonen worden omsloten om verdamping van de dsRNA-oplossing te voorkomen en om te voorkomen dat de dieren de micro-centrifugebuis binnenkomen. Plaats de buisjes rechtop bij kamertemperatuur gedurende drie uur, om de dsRNA-oplossing door middel van capillaire actie door de groene boon te laten laden.

Plaats de buisjes in schone polypropyleen kweekvaten en plaats 3 verhongerde 4e stadium BMSB-nimfen in de kweekvaten. Behandel drie insecten per kweekvat. Elk bevat drie groene bonen met groen voedselkleurstof of dsRNA-oplossing.

Houd de insecten op 25 graden Celsius en 72% relatieve luchtvochtigheid, onder een 16L, 8D fotoperiode in een incubator. Laat de insecten vijf dagen lang voeren op de groene bonen die gedompeld en geabsorbeerd zijn in dsRNA, en vul ze na drie dagen aan met vers voer van dsRNA-behandelde groene bonen. Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water gedurende twee tot drie dagen voor gebruik, om de grond uit te laten drogen tot vochtig, maar niet volledig droog.

Gebruik een met de hand gepompte spuitfles om 200 milliliter dsRNA-oplossing op het onderste bladerdak aan te brengen. Bemonster de nieuwe groei van eerder gekapt bomen na 25 tot 40 dagen door ongeveer 10 bladeren te verzamelen van de toppen van vier takken. Extraheer het totale RNA en analyseer het door middel van RT-PCR en qPCR op de aanwezigheid van de toegepaste dsRNA-trigger.

Spray op vergelijkbare wijze topisch 10 milliliter dsRNA op het onderste gebied van een zaailing of klein potje met boombladeren. Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water gedurende twee tot drie dagen voor gebruik, om de grond uit te laten drogen tot vochtig, maar niet volledig droog. Voeg vervolgens een liter dsRNA-oplossing toe aan de grond van grote potplanten.

Voeg na een uur een liter water toe. Breng 100 milliliter dsRNA-oplossing aan op de grond van potten met bomen van één meter hoog in gedeeltelijk droge bodems. Laat de planten de dsRNA-oplossing ontvangen als een gronddrench, om gedurende 30 minuten te weken.

Breng vervolgens een zuivere water-only behandeling aan om de opname door de wortels te bevorderen. Selecteer citruszaailingen, nieuwe of ongeveer 3,5 jaar oude planten om dsRNA te injecteren met behulp van de stamtap, ook bekend als de staminjectiemethode. Wikkel de koperen punt van elke injector vier tot zes keer met een 0,6 centimeter brede strook plafondfolie om lekkage nabij de punt te voorkomen.

Vul vervolgens de boomstaminjecteurs met zes milliliter dsRNA-oplossing verdund met DNA's, RNA's-vrij water. Boor gaten in de citrusplanten met een boortje van 10 milliliter en zorg ervoor dat je niet meer dan twee centimeter, of ongeveer de helft van de diameter van de stam, overschrijdt. Injecteer vervolgens de oplossing in de boomstam en laat de injector zes tot tien uur in de stam om absorptie van de dsRNA-oplossing mogelijk te maken.

Laat de insecten voeren op de stekken van behandelde bomen op 3, 10 en 30 dagen na de behandeling. Giet 30 gram klei-absorbens in een 50 milliliter conische buis tot de 35 milliliter markering. Giet 20 milliliter dsRNA-oplossing verdund in DNA's, RNA's-vrij water in de buis om alle absorberende stof nat te maken.

Dek de conische buis af, kant de buis om lucht te helpen verwijderen en plaats de buis rechtop en laat deze een tot twee minuten staan terwijl de klei-deeltjes de oplossing absorberen. Voeg voldoende dsRNA-gedrenkte klei toe aan de grondmix om een pot van een gallon te vullen. Meng en draai de grond met de hand om de dsRNA-gedrenkte klei grondig door de grond te mengen.

Gebruik de grond om zaailingen die zijn geselecteerd voor de dsRNA-behandeling opnieuw te potten. Geef de grond water met 200 milliliter zuiver water, zonder d