Name: Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer orale afleveringsmethoden voor dubbelstrengig RNA om RNA-interferentie op te wekken in floëemvoedende Hemipteran insecten. Deze technieken helpen onderzoekers bij het bestuderen van gen-specifieke biopesticiden in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen dankbaar Donald Weber en Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) voor het verstrekken van BMSB en HB voor experimenten en onderhouden van de kolonies; en Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) en Jackie L. Metz (Universiteit van Florida, Fort Pierce, FL) voor onderhoud van de kolonie, bereiding van de monsters en analyses.

1. BMSB fokken
<ol><li>Achterzijde BMSB insecten per standaard lab praktijk en eerder beschreven63.</li>
	<li>ACS (D. citri) insecten op Citrus macrophylla in een kas (22 ° C) en het natuurlijke licht te verhogen. Gebruik van volwassen ACS, op ongeveer 5-7 dagen post eclosion.</li>
</ol>2. selectie van Gene regio's en In Vitro synthese van dsRNA
<ol><li>Selecteer specifieke genen aan BMSB van eerder gepubliceerde transcriptome profielen32.</li>
	<li>Zorgen dat de regio's van belang geselecteerd variëren tussen 200 tot 500 basenparen.</li>
	<li>Uitvoeren van polymerase-kettingreactie (PCR) met behulp van de voorwaarden die hieronder zijn beschreven voor het genereren van de fragmenten die zijn gekoppeld aan de geselecteerde gen van belang van genomic DNA. Zie tabel 1 voor de gen-specifieke oligonucleotides.<ol>
<li>PCR reactie: combineren In een tube van de PCR 0,25 mL, 5 µL van 10 X 4 µL van dNTP mengsel (elke 2.5 mM), PCR Buffer, 2 µL van DNA sjabloon (50 ng/µL), 2,5 µL van inleidingen 1 en 2 (10 µM), 0,25 µL van de polymerase van DNA (5 U/µL) , en DNase/RNase gratis water maximaal 50 µL.</li>
		<li>PCR voorwaarde: cyclus van de PCR-reactie om te versterken van de regio van belang bij 95 ° C gedurende 3 min, gevolgd door 30 cycli van 98 ° C voor 10 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72° C gedurende 1 min. Incubate de reactie bij 72 ° C gedurende een extra 10 min. zuiveren de PCR reactie met behulp van een zuivering kit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De verkregen PCR fragmenten verder versterken met specifieke primers gene geflankeerd door de T7 RNA polymerase promotor volgorde (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') genoemd als eerdere62.</li>
	<li>LacZ gen als een negatieve controle (mock) gebruiken voor RNAi. Opmerking: LacZ is een gen dat β-galactosidase versterkt van genomic DNA Escherichiacoli codeert (de inleidingen gebruikt zijn vermeld in tabel 1).</li>
	<li>In vitro transcriptie zodanig dat deze dsRNA als beschreven eerdere62uitvoeren</li>
	<li>Ontbinden en resuspendeer de resulterende dsRNA in 150 µL DNase/RNase gratis water, meten van de concentratie en opslaan bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>3. levering van dsRNA met sperziebonen
<ol><li>Selecteer vroeg 4th instar BMSB nimfen uitgebroed uit hetzelfde ei massa en verhongeren ze voor 24 h vóór dsRNA voeden.</li>
	<li>Selecteer slanke gecertificeerde biologische groene bonen (Phaseolus vulgaris L.) en wassen met 0,2% natriumhypochloriet-oplossing gedurende 5 minuten. Opmerking: Slanke groene bonen werden geselecteerd zodat de bonen kunnen gemakkelijk worden ondergebracht in de buizen 2 mL microcentrifuge.</li>
	<li>3 keer wassen met ddH2O en laat lucht droog.</li>
	<li>Trim de sperziebonen vanaf het einde van de kelk tot een totale lengte van 7,5 cm met behulp van een schone scheermesje.</li>
	<li>Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een tube van het GLB-minder 2 mL microcentrifuge met 300 µL van bedieningsoplossing (een 1:10 verdunning van groene voedselkleuring (ingrediënten: Water, propyleenglycol, Fd & C geel 5, Fd & C Blue 1 en Propylparaben als conserveermiddel)).</li>
	<li>Make verdunningen van het in vitro gesynthetiseerd LacZ, JHAMT of Vg dsRNAs door verdunnen 5 µg of 20 µg in 300 µL van RNase/DNase gratis water aan opbrengst eindconcentraties van 0.017 µg/µL of 0.067 µg/µL, respectievelijk.</li>
	<li>Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een tube van het GLB-minder 2 mL microcentrifuge met 300 µL van dsRNA oplossing (uit stap 3.6).</li>
	<li>Wikkel en verzegel de randen van de buizen van de microcentrifuge omsluiten de ondergedompeld bonen te vermijden van verdamping van de dsRNA-oplossing en om te voorkomen dat de dieren de microcentrifuge buis.</li>
	<li>Plaats deze buizen op een rechte manier bij kamertemperatuur gedurende 3 uur om de dsRNA oplossing worden geladen tijdens de green bean door capillaire werking.</li>
	<li>Plaats deze buizen in schone kweekvat (polypropyleen). Plaats drie uitgehongerd 4th instar BMSB nimfen in de kweekvat.</li>
	<li>Omgaan met drie dieren per cultuur vaartuig elk met drie groene bonen met groene voedsel kleuren of dsRNA oplossing. Het handhaven van de insecten op 25 ° C en 72% relatieve vochtigheid, onder een 16 L: 8D fotoperiode in een broedmachine.</li>
	<li>Toestaan dat de insecten te voeden op de groene bonen (ondergedompeld en geabsorbeerd met dsRNA) voor 5 dagen maar vullen met vers diëten van dsRNA behandeling groene parels na 3 dagen.</li>
</ol>4. real-time kwantitatieve (qPCR) analyse van gen expressie volgende RNAi gemedieerde Silencing in BMSB
<ol><li>Het meten van het effect van RNAi op de niveaus van transcript expressie door qPCR.</li>
	<li>Isoleren van totaal RNA van de dsRNA behandelde dieren en de cDNA62synthetiseren.</li>
	<li>Instellen van de reacties van de qPCR met een real-time PCR-systeem en de inleidingen die zijn vermeld in tabel 1. Gebruik de volgende qPCR fietsen voorwaarde: 95 ° C gedurende 10 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s, 60 ° C gedurende 1 min, samen met dissociatie stap met inbegrip van 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min, 95 ° C gedurende 15 s , en 60 ° C gedurende 15 s.</li>
	<li>Bepalen van de qPCR-normen: gebruik de seriële verdunning van cDNA bereid uit totaal RNA als een norm voor de kwantificering van een normale dier is geïsoleerd.</li>
	<li>Gebruik BMSB 18s RNA als een interne standaard om te corrigeren voor verschillen in RNA terugwinning van weefsels32.</li>
</ol>5. naalden Spray toepassing in grote ingemaakte citrusbomen en zaailingen
Opmerking: Planten van de citrus cultivar 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae) werden onderhouden in een kas onder natuurlijke licht en temperatuur, geteeld in 1.2 L containers. De planten waren constant gesnoeid ter bevordering van de groei van nieuwe naalden shoots, genaamd 'flush'. ACS verkiest te voeden en oviposition op de nieuwe groei van citrus64.
<ol><li>Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water voor 2-3 dagen voorafgaand aan het gebruiken om te laten de bodem uitdrogen te vochtig, maar niet helemaal droog.</li>
	<li>Met behulp van een hand pomp spray fles een 200 mL dsRNA oplossing (0,5 mg/mL) van toepassing op de lagere luifel (figuur 4A). Opmerking: Voorbereiding van de hierboven genoemde dsRNA oplossingen in DNase/RNase gratis water.</li>
	<li>Na het spuiten van toepassing, toestaan dat de toegepaste dsRNA-oplossing voor het volledig door de bladeren worden geabsorbeerd. Opmerking: Citrusbomen geabsorbeerd de toegepaste dsRNA, en vervolgens bladeren uit beide nieuwe groei of uit de takken die werden gedekt vóór toepassing, werden gehaald; de dsRNA was aantoonbaar met behulp van qPCR en toonde systemische beweging in de tree top luifel bladeren in 3-4 h44,45,46.</li>
	<li>Proef de nieuwe groei van eerder bekroond bomen na 25-40 dagen door het verzamelen van ongeveer 10 vanaf de toppen van vier takken vertrekt. Extract van de totale RNA en analyseren door omgekeerde transcriptie PCR (RT-PCR) en qPCR voor de aanwezigheid van de trekker van de toegepaste dsRNA gebruikend de inleidingen die in tabel 1 beschreven methoden46. Opmerking: De sample collectie, totaal RNA isolatie, RT-PCR, en qPCR werden uitgevoerd als eerder beschreven46.</li>
	<li>Op dezelfde manier spuiten topisch 10 mL dsRNA aan de lagere regio van een zaailing of kleine ingegoten boom gebladerte. Opmerking: Hemipteran insecten (ACS-landen en GWSS) kregen voeding toegang normaal bij 24 h, post behandelingen op nieuwe groei (bladeren) die had niet direct gespoten, of die weken later groeide, of hele planten. Dit produceerde insecten welke getest positief voor de dsRNA op 3, 6 en 10 dagen, post voeden.</li>
</ol>6. bodem/Root kletsnat toepassing in grote of kleine ingegoten citrusbomen en zaailingen
<ol><li>Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water voor 2-3 dagen voorafgaand aan het gebruiken om te laten de bodem uitdrogen te vochtig maar niet helemaal droog (Hiermee wordt luchtruim te houden van de vloeibare oplossing worden toegepast).</li>
	<li>Voeg 1 liter dsRNA oplossing (0,2 mg/mL) op de bodem van grote potplanten (ongeveer 2,5 m) en voeg 1 L water (chaser) na 1 h.</li>
	<li>100 mL dsRNA oplossing (1,33 mg/mL) op de bodem van 1 m hoog ingegoten bomen in gedeeltelijk droge bodems van toepassing.</li>
	<li>Toepassing voor kleine zaailingen, 10 mL dsRNA oplossing (1 mg/mL) op de bodem van de kegels of de kale wortels (figuur 4B, C).</li>
	<li>Laat de planten die de dsRNA oplossing toegepast als een bodem kletsnat ontvangt te genieten voor 30 min. Dan gelden de enige behandeling gewoon water om te helpen absorptie door wortels (20 mL voor planten in de gele containers), of 100 mL als grotere plant potten > 1 gallon. Opmerking: Topisch toegepast dsRNA aan gebladerte resulteerde in detectie op meest distale uiteinden van de takken binnen 3-6 h post behandelingen, tonen van systemische beweging door bomen. Nieuwe groei takken testte positief voor dsRNA bij 60-90 dagen post behandelingen. Stekken vindt u in een dsRNA bioassay44voeden met insecten (ACS-landen en GWSS).</li>
</ol>7. stam Tap (Tree Trunk injectie) toepassing in grote ingemaakte citrusbomen en zaailingen
<ol><li>Selecteer citrus zaailingen, nieuw, of ongeveer 3,5 jaar oude installaties voor het injecteren met behulp van de stengel dsRNA kraan (trunk injecties) methode.</li>
	<li>Boor gaten in de citrus planten met behulp van een boor en een 10 mm boor, verzorgen maximaal 2 cm, of ongeveer de helft van de diameter van de stam.</li>
	<li>Wikkel het koperen puntje van elke injector 4 - 6 keer met een brede strook van 0.6 cm (¼ inch) van de sluiting van de film om te voorkomen lekkage in de buurt van de tip.</li>
	<li>Vul de boomstam injectoren met 6 mL (1,7 mg/mL) dsRNA oplossing verdund in DNase/RNase gratis water (aangeduid als gekleurde oplossing hier).</li>
	<li>Injecteren van de oplossing in de stam van de boom en laat de injector in de kofferbak voor 6-10 h dat de absorptie van de dsRNA-oplossing. Laat de insecten te voeden op de stekken uit behandelde bomen op 3, 10 en 30 dagen na de behandeling. Opmerking: De dsRNA geïnjecteerd met de kofferbak injectie methode persistent gemaakt in de bomen voor een periode van 30-60 dagen41,42,44. Validatie voor RNAi werd uitgevoerd door qPCR met behulp van de inleidingen die zijn vermeld in tabel 1.</li>
</ol>8. dsRNA behandeld kleikorrels voor levering aan insecten door bodem
<ol><li>Giet de klei absorberend in een conische buis van 50 mL tot de maatstreep aan 35 mL (ongeveer 30 g Klei absorberende) op de buis.</li>
	<li>Giet 20 mL verdund in DNase/RNase gratis water (100 µg/mL) dsRNA-oplossing in de buis te bevochtigen van alle de absorberend. Cap de conische buis, uiteinde van de buis om te helpen verwijderen van de lucht, en de buis van het GLB.</li>
	<li>Plaats de buis rechtop en laat het staan voor 1-2 min voor de klei-deeltjes op te vangen van de oplossing.</li>
	<li>Voeg genoeg dsRNA doordrenkte klei in de bodem mix te vullen een pot 1 gallon.</li>
	<li>Meng en draai de bodem met de hand om grondig Meng de dsRNA doordrenkte klei in de bodem.</li>
	<li>Gebruik deze bodem te verpotten zaailingen geselecteerd voor de dsRNA-behandeling.</li>
	<li>De bodem met gewoon water zonder dsRNA 200 mL water. Na 30 min tot 1 h, volgen met 100 mL van gewoon water. Zet de plant op een normale water geven programma na 24 uur.</li>
	<li>Test 4-6 blaadjes van de behandelde potplanten met klei sorbents en dsRNA elke maand na de behandeling voor dsRNA door het verzamelen van de meest apicale bladeren van nieuwe plantengroei. Opmerking: Planten of stekjes uit deze behandelde planten worden gevoed met insecten na 24 h behandeling post en geweest kundig voor levering RNAi voor maximaal een jaar aan insecten (niet-gepubliceerde gegevens).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

RNAi heeft bewezen te zijn een belangrijk instrument voor het verkennen van biologische genfunctie en regelgeving, met een groot potentieel om te worden gebruikt voor beheer van insectenplagen19,68,69,70, 71. het ontwerp en de selectie van een geschikte gene(s) voor silencing in een bepaald insect soorten en de methode van levering van de bijbehorende dsRNA(s...

Hemipteran insecten omvatten enkele van de meest economisch belangrijke plagen van agriculturebecause van hun vermogen om te bereiken van verhoogde bevolkingsgroei en ziektes bij planten verspreiden. De BMSB, H. Kizil Irmak Stål, is een invasieve plaag die per ongeluk werd geïntroduceerd in het westelijk halfrond in Allentown, Pennsylvania uit Azië (China, Taiwan, Korea en Japan) met de eerste waarneming in 19961gemeld. Sinds de invoering ervan, BMSB is geconstateerd in 43 landen met de hoogste populaties in de Mid-Atlantische (DE, MD, PA, NJ, VA, en WV), alsook in Canada en Europa, en vormt een potentiële bedreiging voor de landbouw2. Als een polyfage plaag, kunnen BMSB teweeg brengen schade aan ongeveer 300 geïdentificeerde plant gastheren met inbegrip van hoogwaardige gewassen zoals appels, druiven, sierplanten, zaadgewassen, sojabonen en maïs. Schade veroorzaakt vooral vanwege de wijze van het voeden lacerate en flush genoemd waar het dier doorboort het gewas van de host met de naald-achtige stilet toegang te krijgen tot de voedingsstoffen uit de vaatbundels weefsels2,3. BMSB is ook een overdekt ongedierte zoals zij woonplaats in woonruimtes zoals scholen vinden kunnen en huizen tijdens herfst en winter2. Chemische stoffen en aeroallergens uitgebracht door BMSB werden gemeld aan illegale allergische reactie in fruit gewas werknemers. BMSB kunnen ook bijdragen tot de allergische ziekte leiden tot conjunctivitis, contactdermatitis en rhinitis in gevoelige personen4,5. Een ander hemipteran insect, de ACS, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), is een ernstige plaag van citrusvruchten, en stuurt het floëem-beperkte-bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) veroorzaken Huanglongbing (HLB), beter bekend als zoals citrus vergroening ziekte6,7. HLB werd voor het eerst gemeld uit Zuid-China en heeft zich verspreid naar 40 verschillende Aziatische, Afrikaanse, Oceanië, Zuid- en Noord-Amerikaanse landen7. Citrus "vergroening" is een wereldwijd probleem met het bedreigen van de economische en financiële verliezen als gevolg van verlies van citrusvruchten; Vandaar, beheer van ACS-landen wordt overwogen van het grootste belang ter voorkoming en bestrijding van HLB.
Maatregelen voor doeltreffende controle op deze insectenplagen gewoonlijk vereist de toepassing van chemische bestrijdingsmiddelen die relatief kort zijn geleefd. Chemische insecticide bestrijdingsstrategieën vaak gebrek aan veilige milieumanagement strategieën of gevoeligheid als gevolg van bestrijdingsmiddelen weerstand in8,9van de populaties van de pest is afgenomen. Vandaar, de biologische bestrijding van plagen met moleculaire biopesticides is een mogelijke alternatief, maar het gebruik ervan blijft wereldwijd bescheiden, en verschillende soorten parasitoïden (b.v. Trisolcus japonicus) kunnen ook gelden als natuurlijke biologische besturingselementen. RNAi is een potentieel opkomende technologie voor het beheer van invasieve insectenplagen met moleculaire biopesticides10. RNAi is een goed beschreven gene regelgevende mechanisme dat de effectieve posttranscriptional gen tot zwijgen brengen van endogene vergemakkelijkt evenals de invasie van dsRNAs in een reeks specifieke wijze, die uiteindelijk tot de regulering van de expressie van genen op het mRNA leidt niveau11,12. Kort, wanneer exogene dsRNA is geïnternaliseerd in een cel die het tot siRNAs wordt verwerkt door een lid van de superfamilie van de RNase III bidentate nuclease, Dicer, die is evolutionair bewaard in wormen, vliegen, planten, schimmels en zoogdieren13, genoemd 14 , 15. deze 21-25 nucleotide siRNA duplexen vervolgens worden afgewikkeld en geïntegreerd in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) RNAs begeleiden. Dit complex RISC-RNA kan Watson-Crick basis koppeling naar de complementaire doelgroep mRNA; Dit leidt uiteindelijk tot splitsing door de Argonaute proteïne, een multi-domein eiwit met een RNase H-achtige domein, die degradeert de bijbehorende mRNA en vermindert eiwit vertaling, waardoor posttranscriptional gene silencing16 , 17 , 18.
RNAi voor gewasbescherming vereist de invoering van dsRNA in vivo te zwijgen van het gen van belang, waardoor het activeren van de siRNA pathway. Verschillende methoden die zijn gebruikt voor dsRNA levering aan insecten en insecten cellen voor het opwekken van systemische RNAi omvatten voeding10,19, inweken van20,21, microinjection22, vervoerders zoals liposomen 23, en andere technieken24. RNAi was eerste aangetoond in Caenorhabditis elegans unc-22 genexpressie door brand zwijgen op te leggen en Mello25, gevolgd door knockdown in expressie van de Gekroesde genen bij Drosophila melanogaster26. Eerste functionele studies gebruikt microinjection dsRNA om in te leveren insecten, zoals Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. Kizil Irmak30en Lepidoptera insecten (herzien door Terenius et al. 31). microinjection is voordelig voor het leveren van een nauwkeurige en precieze dosis op de site van belangstelling voor het insect. Zij dergelijke septische lekke banden expressie van immuun verwante genen als gevolg van trauma32, vandaar uitlokken kunnen, uitgesloten zijn bruikbaarheid in de ontwikkeling van de agrarische biopesticides.
Een andere methode van het leveren van dsRNA in vivo is door inweken, waarbij inname of absorptie van dsRNA door schorsing van dieren of cellen in het algemeen in extracellulaire opslagmedium met dsRNA. Soaking is gebruikt voor het efficiënt opwekken van RNAi in Drosophila S2 weefselkweek cellen voor de remming van Downstream-van-Raf1 (DSOR1) mitogeen-geactiveerd proteïne kinase kinase (MAPKK)20, evenals in C. elegans om te zwijgen van de POS-1 gene33. DsRNA geleverd met inweken is echter minder efficiënt voor het opwekken van RNAi ten opzichte van microinjection20. RNAi gemedieerde monddood maken in een kauwen insect werd het eerst getoond in de westerse maïswortelboorder (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) door de dsRNA infusie in een kunstmatige agar dieet10. Eerdere rapporten hebben methoden om te leveren dsRNA toegediend in natuurlijke diëten specifiek voor geleedpotigen34samengevat. Deze methoden voor het afleveren wilden verder relatief effectief naar kunstmatige vormen van levering; zoals het geval van de tseetseevlieg (Glossina morsitans morsitans), waar gelijke knockdown van een immuun-gerelateerde gen werd waargenomen wanneer dsRNA werd geleverd via bloedmeel of microinjected35. Ook levering van dsRNA via druppels in licht bruin apple nachtvlinder (Epiphyas postvittana)36,37larven Koolmot (Plutella xylostella), evenals honing bijen38,39 geïnduceerde efficiënte RNAi. Meest effectieve RNAi experimenten in hemipteran hebben injectie van dsRNA40 gebruikt omdat mondelinge levering van dsRNA in hemipteran insecten lastig is omdat het moet worden geleverd door middel van de waardplant vascular weefsels. Effectieve RNAi werd ook waargenomen in de ACS-landen en glazig-gevleugelde scherpschutter dwergcicade (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA werd geleverd door middel van citrus en wijnstokken die had dsRNA geabsorbeerd in de vaatbundels weefsels via root kletsnat, naalden sprays, kofferbak injecties of absorptie door stekken41,42,43,44,45,46. Dit resulteerde ook in het eerste octrooi voor dsRNA tegen de ACS (2016, ons 20170211082 A1). Levering van siRNA en dsRNA gebruikend dragers zoals nanodeeltjes en liposomen zorgt voor stabiliteit en stijgingen van de geleverde dsRNA werkzaamheid zijn snel opkomende23,47,48,49 ,,50. Een nieuwe klasse van nanoparticle gebaseerde leverende voertuigen voor nucleïnezuren voor in vitro en in vivo die specifiek voor therapeutische toepassingen immense potentieel geven kunnen als geschikte levering51 vectorenwerd samengevat. Nanodeeltjes als een leveringsvoertuig voor dsRNA kan hebben nadelen zoals oplosbaarheid, hydrophobicity of beperkte bioaccumulatie52, maar een geschikt polymeer hulp levering deze nadelen kan compenseren. Ontwikkeling en het gebruik van het zelf leveren nucleotiden zijn ook genaamd 'antisense oligonucleotides', die één gestrande RNA/DNA duplexen46in opkomst.
Vitellogenesis bij geleedpotigen is een sleutel proces beheersing van de voortplanting en gereglementeerd door juvenile hormoon (JH) of ecdysone, welke zijn de belangrijkste inductoren van Vg synthese door het lichaamsvet; de Vg is uiteindelijk opgepikt door de ontwikkelingslanden oöcyt via Vg receptor gemedieerde endocytose53. VG is een groep polypeptiden gesynthetiseerd extraovarially, die essentieel is voor de ontwikkeling van het grote ei eidooier eiwit, vitellin54,55, en daarom is het belangrijk in de reproductie en veroudering56. VG heeft met succes in nematoden57 is het zwijgen opgelegd, alsmede in de honingbij (Apis mellifera) waar RNAi uitputting van Vg gemedieerde werd waargenomen in volwassenen en eieren22. RNAi gemedieerde posttranscriptional gen tot zwijgen brengen van Vg was getest omdat men dacht dat de uitputting zou leiden tot een waarneembare fenotypische effect zoals verminderde vruchtbaarheid en vruchtbaarheid, om te kunnen helpen bij het BMSB controle. De JHAMT-gen dat codeert voor de S-adenosyl-L-methionine (SAM)-afhankelijke JH zure O-methyltransferase, katalyseert de laatste stap van de JH biosynthese pathway58. In dit traject farnesyl pyrofosfaat (FPP) opeenvolgend van farnesol, omgevormd naar farnesoic zuur, gevolgd door conversie van methyl farnesoate naar JH door JHAMT. Dit traject is geconserveerd in insecten en andere geleedpotigen specifiek voor de metamorfose, een proces dat ontwikkelingsachterstand wordt gereguleerd door hormonen59,60,,61. In B. morisuggereren JHAMT genexpressie en de JH biosynthetic activiteit in de Corpora allata dat er sprake is van cruciaal belang voor de beëindiging van JH biosynthese58de transcriptionele onderdrukking van het JHAMT -gen. Daarom werden de genen JHAMT en Vg geselecteerd voor gerichte uitputting met behulp van RNAi. RNAi werd ook getest in citrusbomen voor controle van de ACS-landen en GWSS. Citrusbomen werden behandeld met dsRNA via root kletsnat, stammen van de kraan (trunk injecties), evenals naalden sprays met dsRNAs tegen insecten specifieke arginine kinase (AK) afschriften42,44. De actuele toepassing van dsRNA werd ontdekt over het bladerdak van citrusbomen, met vermelding van efficiënte levering via de planten vascular weefsels, en heeft geleid tot verhoogde sterfte in ACS-landen en GWSS41,42, 45.
In de huidige studie, hebben we een methode voor het bezorgen van natuurlijke dieet voor behandelingen zoals dsRNA vastgesteld. Deze nieuw ontwikkelde techniek werd later gebruikt voor de JHAMT en Vg silencing mRNA met behulp van gen-specifieke dsRNAs in BMSB nimfen als aangetoond eerder62. Deze nieuwe levering protocollen hier gedemonstreerd vervangt conventionele RNA levering systemen die gebruik maken van actuele sprays of microinjections. Groenten en fruit, stam kraan, bodem drenken en klei sorbents in kunnen worden gebruikt voor de levering van dsRNA, die is cruciaal voor de verdere ontwikkeling van biopesticide beheer op het gebied van ongediertebestrijding en pathogenen.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) insecten&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insecten&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>biologische groene bonen</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrusplanten</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumhypochlorietoplossing</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>groene kleurstof voor voedsel&nbsp;</td><td>McCormick &amp; Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma kamers&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta vat (Cultuur)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitfles</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

double-stranded rna orale afleveringsmethoden voor het opwekken van rna-interferentie in het floëem en hemipteran insecten plant-sap-voeding

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Floëem en plant sap voeding insecten invasie van de integriteit van gewassen en vruchten te halen voedingsstoffen, in het proces schadelijk voor voeding bestemde gewassen. Hemipteran insecten account voor een aantal economisch grote plagen van planten die leiden schade aan gewassen tot door het eten van floëem sap. De bruine marmorated hilare (BMSB), Halyomorpha Kizil Irmak (Wantsen: Schildwantsen) en de Aziatische citrus psyllid (ACS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) zijn hemipteran insectenplagen geïntroduceerd in Noord-Amerika, waar ze zijn een invasieve landbouw plaag voor hoogwaardige specialiteit, rij, en stapelvezels gewassen en citrusvruchten, evenals een overlast plaag wanneer ze binnenshuis aggregaat. Insecticide resistentie in vele soorten heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden van pest managementstrategieën. Double-stranded RNA (dsRNA)-gemedieerde RNA-interferentie (RNAi) is een gen silencing mechanisme voor functioneel genomisch studies met mogelijke toepassingen als een instrument voor het beheer van insectenplagen. Exogenously gesynthetiseerde dsRNA of Klein Mengend RNA (siRNA) kan leiden tot zeer efficiënte gene zwijgen door de afbraak van endogene RNA, dat homoloog aan die gepresenteerd. Effectieve en ecologische gebruik van RNAi als moleculaire biopesticides voor biocontrol van hemipteran insecten vereist de in vivo levering van dsRNAs via voeding. Hier tonen we methoden voor levering van dsRNA aan insecten: laden van dsRNA in groene bonen door onderdompeling en absorberen van gen-specifieke dsRNA met mondelinge bezorging via ingestie. We hebben ook niet-transgene plant levering benaderingen met behulp van naalden sprays, wortel kletsnat, kofferbak injecties evenals kleikorrels, die allemaal essentieel voor duurzame release van dsRNA kan worden geschetst. Efficiënte levering door oraal ingenomen dsRNA werd bevestigd als een effectieve dosering voor het opwekken van een aanzienlijke afname van de expressie van gerichte genen, zoals juvenile hormoon acid-O-methyltransferase (JHAMT) en vitellogenin (Vg). Deze innovatieve methoden vertegenwoordigen strategieën voor levering van dsRNA gebruiken in gewasbescherming en overwinnen van de uitdagingen op milieugebied voor gewasbescherming.

Plantaardige gemedieerde dsRNA levering via voeding in BMSB 4th instar nimfen werd getest voor de ontwikkeling van moleculaire biopesticides met behulp van RNAi voor invasieve insectenplagen. BMSBs feed via hun naald-achtige stylets door een mechanisme bekend als lacerate en leegmaken, waardoor aanzienlijke schade aan gewassen. Slanke biologische sperziebonen, P. vulgaris L., werden gebruikt om te testen of nutriënten of dsRNA kon worden verstuurd in vivo naar...

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Het algemene doel van deze procedures is om een natuurlijke orale toedieningsmethode te demonstreren. Voor gen-specifieke dsRNA's, om RNA-interferentie in vivo en insectenplagen te induceren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over hoe biomoleculen in insecten kunnen worden afgeleverd, om de effecten van RNAi-gebaseerde moleculaire biopesticiden te verduidelijken en om insecten in het milieu te bestrijden.Het grootste voordeel van deze techniek is dat deze levering door genuitschakeling via nucleïnezuur kan worden toegepast op zowel plantensapvoedende als knaag-insecten. Hoewel de methoden hier de levering van dubbelstrengs RNA aan hemiptera-plagen demonstreren, zoals de bruine gespikkelde stinkwants, harlekijnwants en Aziatische citruspsyllid. Ze kunnen op andere insecten worden toegepast.Om het protocol te starten, selecteer vroege 4e stadium bruine gespikkelde stinkwants, of BMSB-nimfen, uitgekomen uit het eimassa, en laat ze 24 uur voorafgaand aan het dsRNA-voer vasten. Selecteer vervolgens slanke, gecertificeerde biologische groene bonen en was ze vijf minuten met 0,2% natriumhypochlorietoplossing. Volg met drie dubbelgedestilleerd H2O-wasbeurten en laat de bonen aan de lucht drogen.Zodra ze droog zijn, knip de groene bonen vanaf het kelk uiteinde tot een totale lengte van 7,5 centimeter af met een schone scheermes. Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een dop-loos, twee milliliter micro-centrifugebuisje dat 300 microliters controleoplossing bevat. Maak verdunningsreeksen van de in vitro gesynthetiseerde lac Z, JHAMT of VGDSRNA's, door 5 microgram of 20 microgram en 300 microliters RNA's, DNA's-vrij water te verdunnen om uiteindelijke concentraties van respectievelijk 0,017 microgram per microliter of 0,067 microgram per microliter te verkrijgen.Dompel de gewassen en bijgesneden groene bonen in een dop-loos, twee milliliter micro-centrifugebuisje dat 300 microliters dsRNA-oplossing bevat. Wikkel en verzegel de randen van de micro-centrifugebuisjes, waarbij de ondergedompelde bonen worden omsloten om verdamping van de dsRNA-oplossing te voorkomen en om te voorkomen dat de dieren de micro-centrifugebuis binnenkomen. Plaats de buisjes rechtop bij kamertemperatuur gedurende drie uur, om de dsRNA-oplossing door middel van capillaire actie door de groene boon te laten laden.Plaats de buisjes in schone polypropyleen kweekvaten en plaats 3 verhongerde 4e stadium BMSB-nimfen in de kweekvaten. Behandel drie insecten per kweekvat. Elk bevat drie groene bonen met groen voedselkleurstof of dsRNA-oplossing.Houd de insecten op 25 graden Celsius en 72% relatieve luchtvochtigheid, onder een 16L, 8D fotoperiode in een incubator. Laat de insecten vijf dagen lang voeren op de groene bonen die gedompeld en geabsorbeerd zijn in dsRNA, en vul ze na drie dagen aan met vers voer van dsRNA-behandelde groene bonen. Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water gedurende twee tot drie dagen voor gebruik, om de grond uit te laten drogen tot vochtig, maar niet volledig droog.Gebruik een met de hand gepompte spuitfles om 200 milliliter dsRNA-oplossing op het onderste bladerdak aan te brengen. Bemonster de nieuwe groei van eerder gekapt bomen na 25 tot 40 dagen door ongeveer 10 bladeren te verzamelen van de toppen van vier takken. Extraheer het totale RNA en analyseer het door middel van RT-PCR en qPCR op de aanwezigheid van de toegepaste dsRNA-trigger.Spray op vergelijkbare wijze topisch 10 milliliter dsRNA op het onderste gebied van een zaailing of klein potje met boombladeren. Selecteer planten of zaailingen en geef ze geen water gedurende twee tot drie dagen voor gebruik, om de grond uit te laten drogen tot vochtig, maar niet volledig droog. Voeg vervolgens een liter dsRNA-oplossing toe aan de grond van grote potplanten.Voeg na een uur een liter water toe. Breng 100 milliliter dsRNA-oplossing aan op de grond van potten met bomen van één meter hoog in gedeeltelijk droge bodems. Laat de planten de dsRNA-oplossing ontvangen als een gronddrench, om gedurende 30 minuten te weken.Breng vervolgens een zuivere water-only behandeling aan om de opname door de wortels te bevorderen. Selecteer citruszaailingen, nieuwe of ongeveer 3,5 jaar oude planten om dsRNA te injecteren met behulp van de stamtap, ook bekend als de staminjectiemethode. Wikkel de koperen punt van elke injector vier tot zes keer met een 0,6 centimeter brede strook plafondfolie om lekkage nabij de punt te voorkomen.Vul vervolgens de boomstaminjecteurs met zes milliliter dsRNA-oplossing verdund met DNA's, RNA's-vrij water. Boor gaten in de citrusplanten met een boortje van 10 milliliter en zorg ervoor dat je niet meer dan twee centimeter, of ongeveer de helft van de diameter van de stam, overschrijdt. Injecteer vervolgens de oplossing in de boomstam en laat de injector zes tot tien uur in de stam om absorptie van de dsRNA-oplossing mogelijk te maken.Laat de insecten voeren op de stekken van behandelde bomen op 3, 10 en 30 dagen na de behandeling. Giet 30 gram klei-absorbens in een 50 milliliter conische buis tot de 35 milliliter markering. Giet 20 milliliter dsRNA-oplossing verdund in DNA's, RNA's-vrij water in de buis om alle absorberende stof nat te maken.Dek de conische buis af, kant de buis om lucht te helpen verwijderen en plaats de buis rechtop en laat deze een tot twee minuten staan terwijl de klei-deeltjes de oplossing absorberen. Voeg voldoende dsRNA-gedrenkte klei toe aan de grondmix om een pot van een gallon te vullen. Meng en draai de grond met de hand om de dsRNA-gedrenkte klei grondig door de grond te mengen.Gebruik de grond om zaailingen die zijn geselecteerd voor de dsRNA-behandeling opnieuw te potten. Geef de grond water met 200 milliliter zuiver water, zonder d

double-stranded-rna-oral-delivery-methods-to-induce-rna-interference

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

In dit protocol beschrijven we twee strategieën die tegelijkertijd in honingbijen te onderdrukken twee genen (dubbel gen knockdown). Dan presenteren we hoe de proboscis extensie respons (PER) test om het effect van de dubbele gen knockdown op honingbij smaak perceptie bestuderen gebruiken.

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Dit manuscript toont de uitputting van de genexpressie in de middendarm van de Duitse kakkerlak via orale inname van double-stranded RNA ingekapseld in liposomen.

Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

Het huidige protocol beschrijft een methode om voldoende speeksel van priemzuigende insecten te verzamelen met behulp van een kunstmatig medium. Dit is een handige methode voor het verzamelen van insectenspeeksel en het bestuderen van speekselfunctie op insectenvoedingsgedrag en vectoroverdraagbare virusoverdracht.

Tweelaagse membraansandwichmethode voor Laodelphax striatellus Speekselcollectie

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

Hier introduceren we een gedetailleerde soaking-methode van RNA-interferentie in Bursaphelenchus xylophilus om de studie van genfuncties te vergemakkelijken.

Toepassing van RNA-interferentie in de dennenaaltjes, Bursaphelenchus xylophilus

De manipulatie van RNA-interferentie (RNAi) vormt een formidabele uitdaging bij veel sluipwespen met een kleine grootte, zoals Trichogramma-wespen . Deze studie schetste een efficiënte RNAi-methode in Trichogramma denrolimi. De huidige methodologie biedt een robuust model voor het onderzoeken van genregulatie in Trichogramma-wespen .

RNA-interferentie in de ei-sluipwesp, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de afgifte van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes in larven van zijderups Bombyx mori om genuitschakeling te induceren door inslikken.

Larvale RNA-interferentie in zijderups Bombyx mori door Chitosan/dsRNA-afgifte van nanodeeltjes

Leer orale afleveringsmethoden voor dubbelstrengig RNA om RNA-interferentie op te wekken in floëemvoedende Hemipteran insecten. Deze technieken helpen onderzoekers bij het bestuderen van gen-specifieke biopesticiden in vivo.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding (Video) | JoVE Journal

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Meer video's verkennen