Name: Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een snelle methode voor het beoordelen van cytotoxische T-lymfocyten generatie met CFSE-gekleurde OT-I T-cellen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het evalueren van adjuvantia voor vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dank verschuldigd aan onze technische medewerkers: U. Bröder en H. Shkarlet, die ons hebben geholpen tijdens de experimentele procedures. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de EU (UniVax, het contract nr. 601738 en TRANSVAC2, contract nr. 730964) en een subsidie van Helmholtz Association (HAI-IDR). Het onderzoek heeft geen invloed op de financieringsbronnen ontwerpt, generatie van het manuscript of de beslissing tot indient voor publicatie.

Alle muizen gebruikt in deze studie werden van de C57BL/6-achtergrond. Alle dieren werden gehouden onder omstandigheden pathogenen vrije. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de normatieve van de Duitse dierenbescherming wet (TierSchG BGBl. IK S 1105; 25.05.1998) en zijn goedgekeurd door de lagere Saksen Commissie de ethiek van dier experimenten en het Bureau van de staat (lagere Saksen staat Office van bescherming van de consument en voedselveiligheid), onder nummer van de vergunning 33,4-42502-04-13/1281 en 162280.
1. CFSE-verkleuring van de OT-ik T cellen en adoptief overdracht
Opmerking: OT-ik muizen zijn transgenically gegenereerde dieren die uitdrukking geven aan een T-cel receptor (TCR) met vaste α en β-ketens die elkaar de immuno-dominante peptide van eicellen herkennen, SIINFEKL10,11. Dientengevolge, deze muizen hebben een aanzienlijk hoge aantal SIINFEKL-specifieke CD8+ T cellen (97%)12 in vergelijking met normale of eicellen-gevaccineerde muizen (≤ 1%),13.
<ol><li>Isolatie van traceerbaar CD8+ T cellen van OT-ik muizen uiting van T-lymfocyten-specifieke Thy1een (Thy1.1)-allel:<ol>
<li>Euthanaseren van 6-9 weken oud OT-ik muizen door CO2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie14. Ontleden van de milt en de grote lymfklieren (alleen voor inguïnale, de axillaire en de cervicale paren) door het snijden van de huid met een chirurgische schaar, los van de huid van het lichaam met behulp van chirurgische Tangen en pincet en plaats ze in petrischalen (60 x 15 mm) elk met een 100 µm porie mesh cup weefsel slijpen en cel vrijlating.</li>
		<li>Petrischalen (elk met één net kopje) in 3-5 mL van volledige RPMI medium (RPMI 1640 10% v/v FCS, 100 U/mL penicilline, 50 µg Mo/mL streptomycine) gehouden op het ijs bijhouden.</li>
		<li>Prak de organen met behulp van een zuiger van de spuit of een soortgelijk steriele instrument (vooraf snijden is niet nodig) en de resulterende eencellige suspensie in 15 mL centrifuge buizen te verzamelen.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Wassen van de cellen in 10 mL koude PBS door centrifugeren en lyse van de erytrocyten van de milt door opnieuw het opschorten van de pellet in 1 mL/milt van ammoniumchloride buffer (ACK buffer, verkrijgbare). Incubeer de cellen gedurende 1,5 minuten op ijs en vervolgens de cellen met 10 mL koude PBS wassen door middel van centrifugeren (zoals eerder gedaan).</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in de dezelfde buis in 1 mL PBS (pH 7,2) met 5% foetale runderserum voor magnetische isolatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor het uitvoeren van magnetische isolatie, gaat u verder met de negatieve selectie van CD8+ T cellen met behulp van een magnetische isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant of protocollen15gepubliceerd.</li>
	<li>Voor het uitvoeren van CFSE kleuring, eerst het aantal CD8+ T cellen verkregen OT-ik muizen door middel van een geautomatiseerde cel itemlogboeken (particle counter). Vlek 1-5 x 107 cellen/mL in een volume van 1-5 mL met 5 µM CFSE in PBS gedurende 7 minuten bij 37 ° C, beschermd tegen licht in een tube van 15 ml falcon.</li>
	<li>Doven de kleuring van de CFSE door een gelijk volume (1:1) foetale runderserum toe te voegen aan de cellen, en hen uit te broeden voor extra 7 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht. De cellen met 10 mL PBS tweemaal wassen.</li>
	<li>Met behulp van een geautomatiseerde cel counter cellen tellen. Het celaantal intraveneus injecteren van 3-5 x 106 cellen/muis in 100 µL instellen op 3-5 x 107 cellen/mL PBS (i.v.) via de ader van de staart.</li>
	<li>Immobiliseren standaardinteracties staart ader injecties, de muizen in passende fixeren. Warm de rug en staart van de muizen te worden geïnjecteerd met behulp van een rood-licht lamp, geplaatst tussen 20 tot 25 cm afstand van de muizen voor 1-3 min. toe staart ader vasodilatatie. Opmerking: Hiermee kunt u gemak ader detectie en beheer van de celsuspensie.</li>
	<li>Zorgen (met de hand geplaatst tussen de muizen en de lamp) dat het niet is te warm voor de muizen en wanneer de staart aderen duidelijk zichtbaar zijn, gaat u verder met injectie. Het injecteren van de cellen in de ader van de laterale of dorsale staart met behulp van een spuit van 1mL met een 25-meter naald16.</li>
</ol>2. immunisatie (Endo-vrije OVA +/-adjuvans)
<ol><li>Plaats de muizen getransplanteerde met OT-ik cellen (stap 1.7, Figuur 1) in een kamer van anesthesie en beheren van Isofluraan in zuurstof door een verdoving machine14.</li>
	<li>Wanneer de muis volledig in slaap onder verdoving is, neem het uit de kamer en het scheren van de vacht van de muis op het gebied over de gluteus superficialis (laterale onderrug) met behulp van een elektrische haar trimmen machine, om te kunnen uitvoeren van een schone injectie met een goede weergave van de module.</li>
	<li>50 µL van het vaccin, s.c. op de geschoren gebied met behulp van een 25-meter-naald te injecteren.</li>
</ol>3. isolatie van lymfocyten en vlekken Stroom Cytometry p.a.
<ol><li>Isolatie van lymfocyten en splenocytes<ol>
<li>De gevaccineerde muizen euthanaseren inademing CO2 gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
		<li>Pak de zuig en de verre lymfklieren en de milt en plaats ze in afzonderlijke petrischalen met 100 µm porie mesh cups weefsel slijpen en cel vrijlating. Stappen 1.1.2 via 1.1.3.</li>
		<li>Giet het supernatans dat na het centrifugeren en resuspendeer de cel pellets in hetzelfde volume van restant PBS (ca. 100 µL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kleuring voor stroom cytometry analyse<ol>
<li>Bereiden een master mix met de kleuring antistoffen in de concentraties afgebeeld in tabel 1, dus opbrengst een 2 x geconcentreerd kleuring mix in een centrifugebuis van 15 mL. Genoeg volume voor master mix hebben van 100 µL per monster te bereiden. Meng de cellen en de master mix 1:1 en laat het bij 4° C gedurende 30 minuten inwerken. Opmerking: De uiteindelijke kleuring volume per monster moet 200 µL (100 µL van cel pellet + 100 µL van antilichaam master mix).</li>
		<li>Wassen de cellen tweemaal door middel van centrifugeren, zoals beschreven in 1.1.3, toevoegen van 10 mL PBS, tweemaal.</li>
		<li>Resuspendeer de gekleurde cellen in 0,5-1 mL PBS voor de verwerving en overdracht de schorsing aan stroom cytometer buizen. Altijd Houd de monsters op ijs en beschermd tegen licht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Stroom Cytometry
<ol><li>Altijd vooraf filteren de celsteekproeven 70-100 µm filters gebruiken.</li>
	<li>Enkele kleuring compensatie besturingselementen voorbereiden op de fluorophores gedetailleerd in tabel 1 (kralen of cellen). Opmerking: Compensatie moet worden uitgevoerd in cytometer of analyse software17,18,19 en toegepast op alle monsters.</li>
	<li>Volg de gating strategie afgebeeld in Figuur 2. Kort, gate populaties in voorwaartse scatter hoogte vs. voorwaartse scatter gebied (figuur 2A), en opnieuw kant scatter breed vs. kant scatter gebied (SSA, figuur 2B) om uit te sluiten van de paren.</li>
	<li>Poort de bevolking uit figuur 2B door BV 650 (auto-fluorescentie) vs. FITC (CFSE) om te discrimineren waar CFSE gekleurd cellen uit hoge auto-belichting fluorescerende cellen. Kralen of cellen gekleurd met antilichaam geconjugeerd met BV 650 in compensatie besturingselementen bevatten. Dit perceel (figuur 2C) van BV 650 vs. FITC wordt gebruikt om de poort van de OT-ik CFSE cellen gekleurd.</li>
	<li>De bevolking van Figuur 2 C voor Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) poort om te onderscheiden cellen afgeleid van donor vs. ontvangende muizen. Opmerking: Cellen afgeleid van OT-ik donor muizen zijn Thy1.1+ (CD90.1), terwijl WT (C57BL/6, geadresseerden) muizen-afgeleide cellen Thy1.2+ (CD90.2) (figuur 2D zijn). Sommige laboratoria hebben OT-ik muizen in een Thy1.2 achtergrond en WT (C57BL/6) in een Thy1.1. In dit geval moet u een antilichaam tegen Thy1.2 gebruiken voor OT-ik cel gating.</li>
	<li>Opnieuw gate CD8+ cellen uit Thy1.1+ bevolking door het op een poort bestaande uit BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (figuur 2E).</li>
	<li>Weergeven van de bevolking in figuur 2E met behulp van de weergave van een histogram van de CD8 omheinde+ cellen weergegeven: CFSE (FITC), 530/15 kanaal - blauwe laser-, gate de verspreide bevolking door intensiteiten van 102 tot het niveau waar de onverdeelde controle populaties zijn (intensiteiten ~ 105, afhankelijk van de doeltreffendheid van de kleuring van de CFSE en de instelling van de spanning op de stroom cytometer) (figuur 2F).</li>
	<li>Het maken van een extra poort (niet weergegeven in figuur 2) plotting FITC vs. L/D marker (450/20 kanaal, UV-laser) teneinde dode cellen parallel aan de evaluatie van de proliferatie.</li>
	<li>Verwerven ten minste 5000 gebeurtenissen voor de besturingselementen van de compensatie en 10.000 evenementen (gate E, Figuur 2) van de monsters bij een stroom cytometer. Uitvoeren van de cytometer bij lage of middelgrote flow (niet hoger dan debieten van 20.000 evenementen/s).</li>
</ol>

<ol><li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li>
<li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD8%2B+T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8%28%2B%29-T-cell+responses+to+DNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li>
<li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+CD8%28%2B%29+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li>
<li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective%2C+immunopathogenic%2C+and+immunoregulatory+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li>
<li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines%3B+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li>
<li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+vaccine-enhanced+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li>
<li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFN+and+not+TNF%2C+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li>
<li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-%283%27%2C5%27%29-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate%3A+strong+Th1%2FTh2%2FTh17+promoting+mucosal+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I%3A+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li>
<li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive%2C+acutely+activated%2C+and+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+of+CD8%2B+T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li>
<li>Otto, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtto%2C+K+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li>
<li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).</li>
<li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li>
<li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li>
<li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li>
<li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+immunology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+CD8%28%2B%29+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion%3A+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li>
<li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li>
<li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li>
<li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8%2B+T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li>
<li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li>
<li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity%3A+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Moderne vaccins zijn ideaal composedof gezuiverd antigeen en hulpstoffen, met de mogelijke toevoeging van een levering systeem zoals liposomen, virusachtige deeltjes, nanodeeltjes of live vectoren. Een belangrijk aspect bij het ontwerpen van een vaccin is om te kiezen van de juiste adjuvans volgens de klinische behoeften. Deel van het toepassingsgebied zou kunnen inhouden ten gunste van een humorale vs. cellulaire immuunrespons (of beide), de verkiezing van een lokale vs. een systemische immuunrespons (of beide) en het s...

Cytotoxische T-lymfocyten (CTL) inducerende vaccins zijn belangrijke therapeutische interventies die zijn ontwikkeld ter bestrijding van bepaalde soorten kanker1. CTL zijn ook belangrijk voor profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen2. Bovendien, CTL zijn een van de paar immuun afweermechanismen functioneel actief in risicogroepen zoals pasgeborenen3,4 , wie ook afhangen van CTL ter bestrijding van vroege leven infecties5. In dit verband resulteerde vaccins tegen het respiratoir syncytieel Virus (RSV) die zijn ontwikkeld met adjuvans die niet CTL Reacties (aluin uitlokken doet) in een complete mislukking van het vaccin leidt tot ernstige complicaties op infecties bij zuigelingen6. Deze negatieve effecten van vaccinatie kunnen worden teruggedraaid door een CD8+ T cel reactie7. Wij hebben eerder aangetoond dat de belangrijkste cytokines (type ik interferon) ontlokte door sommige stimulator van interferon genen (STING) agonisten essentieel voor de reacties van de CTL gegenereerd door deze hulpstoffen8, gedeeltelijk zijn door het meten van de proliferatie van OT-ik T cellen na vaccinatie en het gebruik van deze resultaten als een maatregel van CTL inducerende mogelijkheden waargenomen uitgebreid vaccinatie schema's9. De meting van de proliferatie van OT-ik CD8+ T cellen in een wild type (WT) C57BL/6 ontvangende muis door carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) kleurstof verdunning is een robuuste schatting van het vermogen van de adjuvante van een vaccin voor het genereren van Kruis-priming van SIINFEKL, (de immuno-dominante peptide van ovoalbumine, eicellen). Variaties van deze techniek worden veel gebruikt voor de beoordeling van de proliferatie van OT-ik CD8+ en OT-II CD4+ T cellen. Bijvoorbeeld, is het gebruikt in de afwezigheid van geselecteerde cytokinen (KO muizen) of voor het meten van de doeltreffendheid van het vaccin na antigeen in dieren WT recall. We een korte protocol (4 dagen experiment) bedacht waarin na passieve overdracht van CFSE gebeitste OT-ik CD8+ T cellen, een onderhuidse (SC) immunisatie bestaande uit één dosis van 50 µg endotoxine-vrije eicellen aangevuld met test hulpstoffen wordt beheerd (Figuur 1). De follow-up van de resultaten 48 h na de vaccinatie biedt een betrouwbare bewijs van hoedanigheid van de adjuvante voor het genereren van CTL reacties. Door deze strategie is het mogelijk om te beoordelen van de potentie van de lokale immuunrespons in de zuig lymfeklier na immunisatie, alsmede de omvang van het antwoord door het meten van de activiteit van de CTL in de milt (of verre lymfeklieren).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD</td><td>Special Order</td><td>Flow Cytometer</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td>Proliferatiekleurstof</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magneetafscheidingskralen en antilichamen voor negatieve selectie van onaangeroerde CD8 T-cellen.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Molecular Probes</td><td>L23105</td><td>Dode celmarker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Celteller. Z2 Geautomatiseerde deeltjes-/celteller</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos(Germany)</td><td>321000</td><td>Ovalbumine endotoxine vrij getest.</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&micro;m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Celzeef (100 &micro;m porie maasbekers).</td></tr><tr><td>Sample Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Steekproefbuisjes voor Z2 geautomatiseerde teller</td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Bedrijf is nu Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 achtergrond, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Inbreed in onze dierfaciliteit. Bedrijf van waar aangeschaft is nu Envigo</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon rondbodempolystyreenbuisjes</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Conische centrifugeerbuisjes</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), pH 7.2</td></tr><tr><td>Red lamp (heating lamp)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td><td>405096</td><td>Verwarming infrarood lamp (100 watt)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Isofluraangenezuur (250 mL fles).</td></tr><tr><td>Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isofluraangenezuurmachine.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Basismedium met Glutamine (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Foetaal bovien serum, gecertificeerd, hitte geïnactiveerd, Amerikaanse oorsprong</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Ammonium Chloride Potasium (ACK) Volledig Bloed Lysis Buffer, geschikt voor erytrocyt lysis in milt suspensies ook</td></tr><tr><td>Plastic Petri Dishes</td><td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Niet-behandeld</td></tr><tr><td>Cell Clump Filter</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&reg; 50 &mu;m, steriele</td></tr></tbody></table>

snelle in vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische t-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Dat de generatie van neutraliserende antilichamen belangrijk, maar niet voldoende voor adjuvante selectie is, zo blijkt uit de evaluatie van moderne subeenheid vaccins. Hulpstoffen met zowel de humorale als de cellulaire immuno-stimulerende mogelijkheden die kunnen bevorderen van cytotoxische T-lymfocyten (CTL) Reacties zijn daarom dringend noodzakelijk. Dus, trouwe monitoring van adjuvante kandidaten, die cross-priming induceren en vervolgens verbeteren CTL generatie vertegenwoordigt een cruciale stap in de ontwikkeling van een vaccin. Hier presenteren we een aanvraag voor een methode die SIINFEKL-specifieke gebruikt (OT-ik) T-cellen om te controleren de Kruis-presentatie van het model antigeen ovoalbumine (OVA) in vivo in aanwezigheid van verschillende adjuvans kandidaten. Deze methode geeft een snelle test om te selecteren met de beste mogelijkheden voor cross-priming hulpstoffen. De proliferatie van CD8+ T cellen is de meest waardevolle indicatie van cross-priming en het wordt ook beschouwd als een correlaat van adjuvans-geïnduceerde Kruis-presentatie. Deze functie kan worden geëvalueerd in verschillende immuun organen zoals lymfklieren en de milt. De omvang van de CTL generatie kan ook worden gecontroleerd, waardoor inzichten over de aard van een lokale (drainage lymfeklier voornamelijk) of een systemische aanpak (verre lymfeklieren en/of milt). Deze techniek verder maakt het mogelijk meerdere wijzigingen voor het testen van de drugs die specifieke Kruis-presentatie-trajecten kunnen remmen en biedt ook de mogelijkheid om te worden gebruikt in verschillende stammen van conventionele en genetisch gemodificeerde muizen. Kortom, zal de toepassing die wij hier presenteren nuttig voor vaccin laboratoria in industrie of academici die ontwikkelen of aanpassen van chemische hulpstoffen voor vaccin onderzoek en ontwikkeling zijn.

Om te testen de behandelingen met behulp van een andere combinatie van hulpstoffen (ADJ1 en ADJ2), hebben we het productievermogen CTL beoordeeld door het meten van de proliferatie van adoptively overgedragen OT-ik CD8+ T cellen door stroom cytometry (Figuur 2). Hiervoor, we eerder gekleurd geïsoleerde cellen uit de zuig lymfklieren en de milt (tabel 1). Door het meten van de proliferatie van CD8+ T cellen in de lymfklie...

Wij presenteren hier een aanvraag voor een standaard immunologische techniek (CFSE gekleurd OT-ik proliferatie) willen snel controleren adjuvans-gemedieerde cytotoxische T lymfocyten (CTL) generatie in vivo. Deze snelle inschatting van CTL capaciteiten is nuttig voor de ontwikkeling van profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen, alsmede therapeutische kanker vaccins.

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Het algemene doel van dit experiment is om de mogelijkheid van adjuvants van belang te bepalen om cytotoxische T-lymfocyten te genereren door de adoptief overgedragen CFSE-gekleurde OT1 CD8 positieve T-celproliferatie in de drainerende lymfeklieren en milten van geïmmuniseerde ontvangende dieren te monitoren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het vaccinologieveld te beantwoorden, zoals de potentie van een adjuvant om een cytotoxiciteitscelrespons te genereren. Het grootste voordeel van deze techniek is dat u niet alleen de CTL-capaciteit van een adjuvant kunt bepalen, maar ook of dit lokaal of systemisch is en dat u dit in slechts vier dagen kunt doen.Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door een technicus in ons lab, Elena Reinhard. Om dij 1.1 positieve CD8 positieve T-cellen van OT1 muizen te isoleren, oogst eerst de milt en inguinale, axillaire en cervicale lymfeklieren volgens standaardprotocollen en plaats alle organen in een 100 micrometer porie maasfilter in een 60 millimeter Petri schotel met drie tot vijf milliliters compleet medium op ijs per muis zodra ze worden verzameld. Oogst niet in grote OT1-milten of lymfeklieren omdat de T-cellen uit

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die&gt; 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Het doel van dit protocol is dat voor de opsporing van in vivo antigeen-specifieke doden van een cel in een lymfkliertest model.

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Hier bieden we een demonstratie van het model van de cutane terugroepen zuig blister. Het model biedt een eenvoudige toegang tot het bestuderen van de menselijke in vivo adaptieve immuunresponsen, bijvoorbeeld in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC's) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Leer een snelle methode voor het beoordelen van cytotoxische T-lymfocyten generatie met CFSE-gekleurde OT-I T-cellen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het evalueren van adjuvantia voor vaccinontwikkeling.

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling (Video) | JoVE Journal

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

Meer video's verkennen