Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α
14 juni 2018
Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de aard, regulatie en biologische impact van de interferon-geïnduceerde reacties in verschillende ziekteomgevingen, inclusief auto-immuniteit en infecties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gepatenteerde gevoeligheid. Deze techniek heeft een groot potentieel voor het ontdekken van biomarkers om de patiëntenzorg bij vele ziekten te verbeteren, omdat het cytokinen kan meten met een ongekende gevoeligheid.
Een belangrijke stap met deze benadering was het neutraliseren van activiteiten die gerelateerd zijn aan patiënten met auto-immuun polyindocrien systeem type één. Om te beginnen, laad 280 miljoen paramagnetische kralen in een microfugebuis, met aantekening van het volume. Drai vervolgens de kralen kort en plaats de buis een minuut op een magnetische scheider.
Verwijder en gooi de verdunningsoplossing weg, waardoor de kralen worden geïsoleerd. Was vervolgens de kralen twee keer met BWB en twee keer met BCB. Voeg voor elke wasbeurt 200 microliter toe en vortex de buis gedurende vijf seconden.
Scheiden vervolgens de kralen van de oplossing met behulp van de magnetische scheider. Na één minuut scheiding, gooi de verdunning weg. Voeg vervolgens 190 microliter BCB per kralenvolume toe.
Vortex vervolgens kort de buis, draai de buis kort en zet de gewassen kralen op ijs. Om de kralen te activeren, combineer één milliliter koude BCB met 10 milligram EDC en vortex tot de oplossing homogeen is. Werk snel en veilig wanneer u EDC gebruikt, vanwege de inherente instabiliteit en equinus-oplossing.
Voeg vervolgens 10 microliter koude, verdunde EDC per kralenvolume toe aan de kralensuspensie en vortex de kralen kort. Plaats vervolgens de kralen op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Om antilichamen aan de kralen te koppelen, vortex en puls eerst de geactiveerde kralen.
Plaats vervolgens de kralen gedurende een minuut in een magnetische scheider en gooi de BCB-supernatant weg. Verwijder vervolgens de buis uit de magneet en was de kralen twee keer met 200 microliter BCB. Vortex vervolgens, pulseer en scheid magnetisch de kralen om de buffer te verwijderen.
Voeg vervolgens snel 200 microliter koude, buffer-uitgewisselde antilichaam toe aan de geactiveerde kralen. Na het vortexen van de kralen in oplossing, zet de suspensie op de shaker bij kamertemperatuur gedurende twee uur bij 1.000 RPM. Begin met het geven van de antilichaam-gecoate kralensuspensie een pulserende draai en gebruik vervolgens de magnetische kolom om de buffer te verwijderen.
Controleer vervolgens de concentratie van het eiwit in de buffer. Gebruik een spectrafotometer met laag volume. Op dit punt zijn de antilichamen gekoppeld aan de kralen en elke waarde boven nul betekent dat de kralen verzadigd zijn met antilichamen.
Was vervolgens de kralen met 200 microliter BWB, zoals uitgevoerd bij alle eerdere wasbeurten. Transfer vervolgens de supernatant naar een nieuwe buis en controleer de eiwitconcentratie. Kwantificering van eiwitten die van de kralen worden afgegeven, maakt de meting van antilichaamkoppeling mogelijk.
Was vervolgens de kralen opnieuw met 200 microliter BWB. Voeg vervolgens 200 microliter bead-blocking buffer toe, vortex de buis gedurende vijf seconden en breng deze over naar de shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na 30 minuten worden de kralen geblokkeerd.
Was ze vervolgens één keer met 200 microliter BWB, gevolgd door twee keer wassen met 200 microliter bead diluent buffer voor elke wasbeurt. Bewaar vervolgens de gecoate en geblokkeerde kralen in 200 microliter bead diluent buffer bij vier graden Celsius. Dit gedeelte van de video suggereert strategieën voor het aanpassen van de testomstandigheden met behulp van de single molecule array analyzer software in de eigen bierconfiguratie.
Begin met het testen van verschillende combinaties van gecoate antilichaamkralen en biotinyleringsdetectieantilichaam in beide antilichaamcombinaties. Test vervolgens combinaties van de drie verschillende gecoate antilichaamconcentraties met twee verschillende biotinyleringsverhoudingen voor detectie- en gecoate antilichamen en vice versa. Kies vervolgens de combinatie die het laagste detectieniveau biedt en gebruik deze voor verdere stappen.
In dit geval geeft een verhouding van 30 op één biotin tot antilichaam het beste detectielimiet. Vergelijk vervolgens een twee-stappen configuratie met een drie-stappen configuratie. Drie-stappen configuraties hebben drie verschillende incubatiestappen.
Een met het gecoate antilichaam, een met het detectieantilichaam en een laatste, derde voor de SBG-enzymlabeling. Twee-stappen configuraties combineren de gecoate en detectie-incubaties. Voer de single-molecule array analyzer uit met behulp van de geselecteerde gecoate en detector antilichaamconcentraties en verhoudingen in de twee- en drie-stappen configuraties, vooraf geconfigureerd in de analyzer, volgens de instructies van de fabrikant.
Kies vervolgens de configuratie die de hoogste gevoeligheid mogelijk maakt en bewaar deze voor toekomstige stappen. In dit geval geeft de twee-stappen configuratie op elk testpunt iets hogere gevoeligheid. Optimaliseer vervolgens de concentraties van het detectorantilichaam en de SBG.
Test drie verschillende concentraties detectorantilichaam met drie verschillende concentraties SBG. Kies de concentraties die de hoogste gevoeligheid geven en bewaar ze voor toekomstige stappen. In dit geval hebben 0,3 microgram per milliliter antilichaam en 150 pica molaire SBG het optimale detectieniveau met lage achtergrondniveaus met gelukkige medium amplitude.
Voor aanvullende optimalisatie stappen, raadpleeg het tekstprotocol. Daarin staan procedures voor het optimaliseren van testspecificiteit en reproduceerbaarheid en een test voor eiwitconcurrentie. Met behulp van een test die is geoptimaliseerd om 13 subklassen van interferon-alpha te detecteren, werden plasma en serum geanalyseerd bij SLE-patiënten, JDM-patiënten en gezonde controles.
Hoge niveaus van interferon-alpha-eiwit werden gedetecteerd in beide ziektecohorten. De stippellijn geeft het detectieniveau aan van een conventionele, commercieel verkrijgbare Eliza die het interferon-alpha-eiwit niet zou detecteren in deze
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het ontwikkelen en valideren van een single molecule array digitale ELISA-test, die ultra-gevoelige detectie van alle IFN-伪 subtypes in menselijke monsters mogelijk maakt. Deze methode is bijzonder nuttig voor het begrijpen van de interferon-geïnduceerde reacties in verschillende ziektecontexten.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Biomarker Ontdekking
Achtergrond
- Interferon-alpha speelt een cruciale rol in immuunresponsen.
- Bestaande methoden missen de gevoeligheid die nodig is om lage niveaus van cytokines te detecteren.
- Dit onderzoek heeft tot doel de detectiecapaciteiten te verbeteren voor betere patiëntenbehandeling.
- Auto-immuniteit en infecties zijn belangrijke focusgebieden.
Doel van het onderzoek
- Om een zeer gevoelige test te ontwikkelen voor het detecteren van IFN-伪 subtypes.
- Om de biologische impact van interferonresponsen in ziekten te verkennen.
- Om biomarkerontdekking te vergemakkelijken voor betere klinische resultaten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van paramagnetische kralen voor antilichaam-conjugatie.
- Optimalisatie van testcondities met behulp van single molecule array analyzer-software.
- Testen van verschillende combinaties van antilichamen voor gevoeligheid.
- Analyse van plasma- en serummonsters van patiënten en controles.
Belangrijkste resultaten
- Hoge niveaus van interferon-alpha werden gedetecteerd bij SLE- en JDM-patiënten.
- De test toonde superieure gevoeligheid in vergelijking met conventionele ELISA.
- Optimale omstandigheden voor antilichaamkoppeling en detectie werden vastgesteld.
Conclusies
- De ontwikkelde test biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van interferonresponsen.
- Het heeft potentiële toepassingen in het diagnosticeren en beheersen van auto-immuunziekten.
- Verdere optimalisatie kan de specificiteit en reproduceerbaarheid verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Ultra-sensitive quantification of human interferon-α (IFN-α) at attomolar concentrations addresses a critical gap in cytokine biomarker detection for autoimmune and infectious disease research. This digital ELISA platform enables detection of all 13 IFN-α subtypes, supporting translational biomarker discovery and mechanistic de-risking in early-stage biopharma pipelines. The validated assay enhances predictive confidence for target engagement and disease monitoring, directly impacting portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of IFN-α to interrogate cytokine-driven disease mechanisms.
- Supports functional target validation by distinguishing IFN-α subtypes in human samples.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
- Improves predictive confidence in pathway modulation and target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, reproducible digital ELISA platform for high-sensitivity cytokine detection.
- Standardizes assay configuration and antibody selection for robust downstream workflows.
- Enables quantitative, cross-cohort comparison of IFN-α levels in diverse biological matrices.
- Prepares biological systems for reliable compound screening and biomarker evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling detection in patient-derived samples.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in autoimmune and infectious disease models.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate therapies targeting IFN-α pathways.
- Enhances disease-relevant system modeling by capturing low-abundance cytokine dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This digital ELISA method integrates from early discovery through translational research, enabling hypothesis testing, target validation, and biomarker-driven decision-making across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for IFN-α–mediated responses.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for quantitative cytokine measurement.
- Analytics: Delivers attomolar sensitivity and multiplexed subtype detection for robust data outputs.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling biomarker alignment in patient samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-sensitivity platform for diverse cytokine and biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes ultra-sensitive cytokine quantification with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, conjugation, and digital ELISA instrumentation.
- Demands access to single molecule array analyzers and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay parameters and data interpretation.
- Adaptable to various biological matrices but dependent on antibody specificity and sample quality.
- Practical limitations include optimization of assay configuration and validation for each new target.
