Name: Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een ultrasensitive digitale ELISA ontwikkelen voor detectie van IFN-α subtypen in menselijke monsters. Deze methode optimaliseert antilichaamconjugatie en analyseert plasma van SLE- en JDM-patiënten voor biomarkeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DD en YJC erkentelijk voor steun van de ANR (Project IFNX, geen. CE17001002) en ImmunoQure AG voor het verstrekken van monoklonale antilichamen. Wij danken Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki en Pierre Quartier voor het verstrekken van klinische monsters. YJC erkent de Europese Onderzoeksraad (GA 309449: Fellowship aan YJC), en een overheidssubsidie beheerd door de National Research Agency (Frankrijk) onder de "Investeringen voor de toekomst" programma, rekening houdend met de verwijzing ANR-10-IAHU-01.

<ol><li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13465720">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li>
<li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pillars+Article%3A+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+London.+Ser.+B%2C+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li>
<li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li>
<li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li>
<li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha%2Fbeta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li>
<li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li>
<li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation%3A+The+type+I+interferonopathies%2C+a+conceptual+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+biological+assay+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li>
<li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li>
<li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li>
<li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis%3A+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li>
<li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+HeLa+Mx2+%2F+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+surface+expression+of+Fc%CE%B3+receptor+RI+%28+CD64+%29%2C+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li>
<li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858(2011).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+array+%28Simoa%29+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22R.+Soc.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li>
<li>Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. <a target="_blank" href="http://www.healthtech.com/uploadedFiles/Conferences/White_Papers/MXA/Scientific-Principles-of-Simo-Technology.pdf">Whitepaper 1.0</a>. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li>
<li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+%2F+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+%CE%B1+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li>
<li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236(2015).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification%3A+prospective+placebo-controlled+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li>
<li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+%28Simoa%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Neurofilament+Light%3A+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+%CE%B2+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer%27s+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers.+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li>
<li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296(2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li>
<li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).</li>
<li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li>
<li>Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).</li>
<li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li>
<li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+%28EBC%29+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108(2015).</li>
<li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li>
<li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Simoa+HD-1+Analyzer%3A+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li>
<li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully-automated%2C+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Proteome.+History%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin, beschreven we de ontwikkeling en validatie van een zeer reproduceerbaar, ultrasensitive enkel molecuul matrix digitale ELISA voor directe kwantificering van IFN-α eiwit in menselijke specimens (stappen samengevat in tabel 1). Een van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de bepaling is de keuze van antilichaam paar16, met de kenmerken in termen van kinetiek en epitoop bindende sleutel tot een succesvolle test. Het is belangrijk om te voorkomen dat het gebruik van gekoppelde monoclonal antilichamen die gericht het dezelfde epitoop of daardoor sterische belemmering. Polyclonal antilichamen kunnen worden gebruikt als detectie antilichamen te overwinnen dergelijke beperkingen. Als bij een bepaalde stap de gewenste gevoeligheid niet is bereikt, moeten verdere optimalisatie mogelijkheden worden overwogen. Hierbij kan het gebruik van alternatieve antilichaam paren, veranderingen in de parameters zoals eiwit type (bijvoorbeeld BSA < caseïne), pH (6.0-8,5), Ionische sterkte, buffercapaciteit (bijvoorbeeld NaCl en fosfaat concentraties), vervoerder kralen en/of aanwezigheid van oppervlakteactieve stoffen. Een groot aantal parameters worden con geoptimaliseerd bij het ontwikkelen van een enkel molecuul matrix assay. Echter over het algemeen voorwaarden die hoge signaal: achtergrond ratio's en minimale LODs geven zijn de voorkeur (Zie Figuur 1en Figuur 2 Figuur 3).
Met betrekking tot de specificiteit, de IFN-α-test toonde geen kruis reactiviteit voor elke andere IFNs getest (β, γ, λ1, λ2, ω) (figuur 4a) en was voor het opsporen van alle 13 IFN-α subtypen (figuur 4b) van. De test toonde echter een lagere affiniteit voor het subtype van IFN-alpha2, (figuur 4b en aanvullende tabel 4). Interessant is dat werden verschillende gevoeligheden voor de verschillende klassen van IFN-alpha2 (a, b, c) ook waargenomen, die veroorzaakt door verschillende productieprocessen of verschillende aminozuur sequenties worden kan, zoals de IFN-alpha2-subtypen zijn verkregen van verschillende commerciële leveranciers. Met deze uitzondering gaf alle soorten van de IFN-α zeer soortgelijke reacties. De specificiteit van de test werd verder aangetoond door de voorbehandeling van de monsters met de anti-IFN-α een kloon, die het signaal (Figuur 6 en aanvullende tabel 6) afgeschaft.
Een van de belangrijkste voordelen van deze technologie is dat elke analyt van belang gerichte16potentieel kan zijn. Bovendien kunnen verschillende biologische monsters worden getest, zoals serum, plasma, cerebrospinale vloeistof, cellulaire lysates, cultuur supernatant31 en zelfs adem32. Een verdunning 1:3 plasma wordt meestal uitgevoerd om te voorkomen dat potentiële verstopping van de Analysator van de matrix één molecuul. Echter de analyt van belang aanwezig kon zijn bij zeer lage concentraties in de relevante biologische steekproef en hogere concentraties van monster wellicht vereist (afhankelijk van de gevoeligheid van de test)33. Hoewel er potentieel is voor multiplexing met behoud van goede vingergevoeligheid34, is het een meer uitdagende proces en testen voor het meten van meer dan 6 eiwitten binnen de dezelfde experimenten hebben nog worden ontwikkeld35.
De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van cytokines en andere biologische relevante eiwitten bij dergelijke lage concentraties opent een hele nieuwe reeks van toepassingen33,36. Het is algemeen bekend dat talrijke proteïnen oefenen hun effecten zelfs bij zeer lage concentraties, die tot nu toe onder de limiet van de opsporing van de beste ELISAs-37 waren. Terwijl andere immunoassay technologieën voordelen ten opzichte van conventionele ELISA19 bieden, wij laten zien hier dat enkel molecuul matrix digitale ELISA een reproduceerbare en robuust platform voor de ultrasensitive detectie van lage concentratie cytokines in menselijke specimens. Als zodanig is deze technologie biedt enorme mogelijkheden voor de ontdekking van biomarker en verbeterde patiëntenbeheer van een breed scala van ziekten.

Type ik IFNs zijn een familie van cytokines die een centrale rol spelen in het orkestreren van antivirale immuunrespons. Ze werden voor het eerst ontdekt door Isaacs en Lindenmann 60 jaar geleden1,2 en het is nu bekend dat deze heterogene familie van polypeptiden bestaat uit 14 verschillende subklassen (13 IFN-α-subtypen en 1 IFN-β). Type ik IFNs essentieel zijn voor de goedkeuring van virale infecties, maar zijn ook betrokken bij de pathologie van een verscheidenheid van ziekten bij de mens Staten, met inbegrip van de auto-immune aandoeningen systemische lupus erythematosus (SLE), jonge dermatomyositis (JDM), en het type Ik interferonopathies in welk constitutieve type resultaten ik IFN-geïnduceerde signalering in pathologie3,4,5,6,7.
Studeren ik typ IFN proteïne niveaus in biologische monsters sinds de initiële identificatie uitdagende is als een "inmenging stof"1,2. Broodje Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) is momenteel de meest gebruikte methode voor de detectie van IFN-α eiwit. Ondanks het feit dat specifieke, eenvoudige en snelle, typ ik IFN ELISAs huidige belangrijke beperkingen, zoals beperkte gevoeligheid. Daarnaast vereist het meten van alle IFN-α-subtypen het gebruik van meerdere tests elk met hun eigen detectiecapaciteit en gevoeligheid. Hoewel er commerciële ELISAs die verschillende subtypen van IFN-α detecteren, de gevoeligheid is beperkt (1.95 pg/mL, 12,5 pg/mL en 12,5 pg/mL, respectievelijk) die is vaak onvoldoende IFN-α om proteÃ¯ne te ontdekken in biologische monsters. Om deze beperking ondervangen verschillende biologische proxy testen zijn ontwikkeld om te kwantificeren typ ik IFN door het meten van de geïnduceerde genexpressie of functionele activiteit8,9,10,11, 12 , 13 , 14. deze testen bieden echter niet een directe meting van het IFN-α-eiwit.
In deze studie was enkel molecuul matrix digitale ELISA technologie gebruikt om een assay voor het opsporen van één IFN-α eiwitmolecules. Digitale ELISA maakt gebruik van de dezelfde basischemie als conventionele ELISA, echter de reactie vindt plaats in matrices bestaat uit 50.000 individuele 46 femtoliter formaat wells15,16. Één eiwitmolecules zijn gevangen door antilichaam beklede paramagnetisch kralen en gemarkeerd met een biotinyleerd detectieantilichaam, gevolgd door de binding van een enzym-conjugaat, daar-β-galactosidase (SBG). Daarna worden de parels opgeschort met een fluorogenic enzym substraat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), in één-molecuul arrays. Reactie 2 miljard keer17, een hoge plaatselijke concentratie van fluorescent signaal wordt bereikt door het verlagen van het volume en enkel molecuul tellingen worden haalbaar is, zoals elke molecuul genereert een signaal dat kan nu betrouwbaar worden gemeten18. In wezen zijn enkel molecuul arrays geschikt voor het tellen van één immunocomplexes en bepaling van een gemiddeld aantal enzymen per kraal (AEB). Tellen van de microwells waarin een signaal wordt gedetecteerd toelaat kwantificering/digitalisering van eiwitmolecules, aangezien er een direct verband tussen eiwitconcentratie en de verhouding tussen immunocomplexed-kralen en parels aanwezig zijn in in totaal de femtoliter middelgrote kamers.
Yeung et al. een studie van de uitgebreide platformonafhankelijke evaluatie met behulp van negen verschillende technologieën en vier cytokine-immunoassay met als doel assay precisie, gevoeligheid en gegevens correlatie te vergelijken tussen de verschillende platformen19uitgevoerd. Een van de belangrijkste bevindingen van de studie was dat enkel molecuul arrays en enkel molecuul immunoassay tellen de hoogste gevoeligheid voor detectie van cytokines in menselijk serum binnen het concentratiebereik van sub-pg/mL gepresenteerd. Enkel molecuul matrix digitale ELISA cytokine testen zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van TNF-α en IL-6 bij ziekte van Crohn ziekte20, IFN-α in interferonopathy en auto-immuunziekten patiënten 7, en de verschillende post-translationally gewijzigd vormen van C-X-C motief chemokine 10 (CXCL10) in chronische hepatitis en gezonde donoren ontvangen sitagliptin21,22. Andere toepassingen omvatten meting van rodopsine bij patiënten met diabetische retinopathie23; de studie van de hersenen pathologieën via metingen van de serum/plasma van neurofilament licht24 en amyloid-β 1-42 peptide25, in het kader van multiple sclerose en de ziekte van Alzheimer, respectievelijk. Enkel molecuul matrix testen kunnen ook worden gebruikt voor detectie van de verbeterde pathogenen zoals karakterisering van de HIV viral reservoir26, en ook voor detectie van DNA27 en micro RNAs28. Een groot voordeel van de technologie van de matrix één molecuul is deze hoge veelzijdigheid, zoals een bepaling tegen elke analyt van belang kan worden ontwikkeld als een paar specifieke antilichaam beschikbaar is. Daarnaast zijn homebrew assay kits commercieel verkrijgbaar, waardoor de ontwikkeling van nieuwe testen, het protocol waarvan gedetailleerd in een gewijzigde vorm hieronder beschreven wordt.
Hier is een gedetailleerde beschrijving van de ontwikkelings- en valideringsfase stappen voor een enkel molecuul matrix assay dat resultaten gepresenteerd in verbeterde gevoeligheid voor IFN-α eiwit detectie. Antilichamen voor enkel molecuul matrix testen moet zeer specifieke, het vermijden van kruis-reactiviteit met de verwante proteïnen (met soorten specificiteit beschouwd indien van toepassing). In het ideale geval moeten antilichamen met een KD kleiner dan 10-9 M worden gekozen; hoge affiniteit zorgt voor een sterke binding met de productie van een hogere signaal. De kinetiek van de antilichaam-antigeen-bindend zijn ook belangrijk, en snel Kop en langzame Kaf zal gunst antigeen-antilichaam complexe vergadering. Beginnen met een paar van antilichaam dat een goede prestatie in klassieke ELISA, met een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) van 1-100 pg/mL heeft, verhoogt de kans voor het verkrijgen van een hooggevoelige enkel molecuul matrix assay. Chang en collega's uitgevoerd gedetailleerde kinetische studies van de Biomoleculaire interacties bij elke stap, stelt een geheel van vergelijkingen te voorspellen van analytische gevoeligheid18. Zij toonden aan dat enkel molecuul matrix digitale ELISA lijkt effectief binnen een brede waaier van antilichaam affiniteiten (KD ~ 10−11 - 109 M), evenals die signaal-generatie is meer afhankelijk van de op-rate van dergelijke antistoffen.
Voor het gebruik van hoge affiniteit Typ antilichamen die we van antilichamen geïsoleerd van patiënten met het syndroom van auto-immune polyendocrinopathy profiteerde 1/auto-immune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermale dystrofie (APS1/APECED)29. Om redenen die nog niet zijn begrepen, de grote meerderheid van de AIRE-deficiënte personen ontwikkelen een kernset van hoge-avidity antilichamen tegen alle IFN-α subtypen29en we kozen twee anti-IFN-α antilichaam klonen van complementaire bindende affiniteiten voor de verschillende IFN-α subtypes, zoals geraamd door IC50 waarden. De combinatie van deze unieke antilichamen van hoge-affiniteit met enkel molecuul matrix technologie ingeschakeld de directe kwantificering van IFN-α bij concentraties van attomolar (fg/mL). Dergelijke ultrasensitive IFN-α eiwit detectie zal bijdragen tot een beter begrip van de aard, de verordening en de biologische gevolgen van de reactie van IFN-geïnduceerde in andere ziekte instellingen.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-&alpha; antibody A (8H1 clone)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Niet commercieel verkrijgbaar</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; antibody B (12H5 clone)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Niet commercieel verkrijgbaar</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; antibody EBI-1 clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; antibody BMS216BK clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Niet een ELISA kit maar bulk abs</td></tr><tr><td>IFN &alpha;2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN &alpha;I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;2a</td><td>PeproTech</td><td>Niet langer beschikbaar</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha;WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda;1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda;2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN &omega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN &beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN &gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter assay</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Niet langer beschikbaar</td><td></td></tr><tr><td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kan niet apart besteld worden</td></tr><tr><td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Bead Wash Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kan niet apart besteld worden</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Bead Blocking Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kan niet apart besteld worden</td></tr><tr><td>Bead Diluent Buffer</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detector and Sample Diluent</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylation Reaction Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kan niet apart besteld worden</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Standaard laboratorium vortex mixer (MS2 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten (10, 20, 200 en 1000 &mu;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips (10, 20, 200 en 1000 &mu;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetische scheider die 1.7mL microcentrifuge tubes ondersteunt (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini tafelcentrifuge (Galaxy MinisStar)</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule array (Simoa) reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, Bead en Detector Barcode Labels</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Reagenbotten</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa specimen 96-well plates</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Discs</td><td>Quanterix</td><td>100001</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 2.0 conductive Tips</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Cuvettes</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG Reagent</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP Reagent</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Sealing Oil</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 Analyzer</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologieën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule array (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systemen</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling en validatie van een ultrasensitive enkel molecuul array digitale enzyme-linked immunosorbent assay voor menselijk interferon-α

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Het hoofddoel van dit protocol is voor het beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een interferon (IFN)-α enkel molecuul matrix digitale Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. Dit systeem maakt het kwantificeren van menselijke IFN-α eiwit met ongekende gevoeligheid, en met geen Kruisallergie voor andere soorten van IFN.
De eerste belangrijke stap van het protocol is de keuze van het antilichaam-paar, gevolgd door de vervoeging van het antilichaam van opname naar paramagnetisch kralen en biotinylation van de detectieantilichaam. Na deze stap, kunnen verschillende parameters zoals assay configuratie, detector antilichaam concentratie en samenstelling van de buffer worden gewijzigd tot optimale gevoeligheid is bereikt. Ten slotte, specificiteit en reproduceerbaarheid van de methode worden beoordeeld om te zorgen voor vertrouwen in de resultaten. Hier, ontwikkelden we een IFN-α enkel molecuul matrix assay met een limiet van detectie van 0,69 fg/mL met behulp van hoge-affiniteit autoantilichamen geïsoleerd van patiënten met biallelic mutaties in het auto-immune regulator (AIRE) eiwit veroorzaakt auto-immune polyendocrinopathy syndroom type 1/auto-immune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermale dystrofie (APS1/APECED). Bovenal ingeschakeld deze antilichamen detectie van alle 13 IFN-α-subtypen.
Deze nieuwe methode kan de detectie en kwantificering van IFN-α eiwit in menselijke biologische monsters bij attomolar concentraties voor de eerste keer. Een dergelijk instrument zullen zeer nuttig zijn bij het toezicht op de niveaus van deze cytokine in gezondheid en ziekte staten, de meeste met name infectie autoimmuniteit en autoinflammation.

Kortom bekleed een pan-IFN-α enkel molecuul matrix assay met een limiet van detectie van 0,69 fg/mL, met behulp van een 2-stap configuratie met capture kralen met 0,3 mg/mL anti-IFN-α een biotinyleerd antilichaam en anti-IFN-α B detectie antilichaam in een verhouding van biotine: antilichaam van 30 werd ontwikkeld. De gebruikte voor biotinyleerd detectieantilichaam en SBG concentraties waren 0,3 µg/mL en 150 uur, respectievelijk. Deze zeer specifieke assay voor het opsporen van alle 13 IFN-α-subtypen van is en kruis niet reageert met andere soort IFNs. Dus, terwijl het is niet mogelijk om te identificeren en kwantificeren van elke afzonderlijke soort IFN-α, alle van hen kan worden gedetecteerd en gemeten geven samen een waarde van de totale concentratie voor IFN-α, die bestaat uit de 13 verschillende subklassen.
Verkennen van de potentiële diagnostische waarde van deze nieuw ontwikkelde assay, IFN-α eiwitten in plasma en serum van gezonde individuen werden gemeten en vergeleken met monsters van patiënten met SLE en JDM. Zoals geïllustreerd in Figuur 7, werden hoge niveaus van IFN-α proteïne ontdekt in beide cohorten van de ziekte in vergelijking met gezonde controles. De stippellijn geeft de LOD voor een conventionele verkrijgbare ELISA, ter illustratie van hoe deze aanpak zou niet detecteren IFN-α eiwit in deze patiëntengroepen ondanks de bekende verenigingen van deze cytokine met deze fenotypen. Bovendien, IFN-α kan worden gekwantificeerd over 5 logs van omvang, ter illustratie van het brede dynamische bereik van de bepaling, met detecteerbare niveaus tussen 1-10 fg/mL bevestiging van de gevoelige aard van de test.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figuur 7: kwantificering van IFN-α eiwitten in plasma en serum van patiënten cohorten. Dit cijfer is gewijzigd van Rodero et al. 2017. de plasma van gezonde controles (n = 20) en patiënten met SLE (n = 72) en JDM (n = 43) werden getest met de pan-IFNα enkel molecuul matrix assay. Analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA-test (Kruskal-Wallis) en Dunns meerdere vergelijking tussen groepen te testen. Mediaan wordt afgebeeld. Stippellijn geeft LOD voor een verwijzing menselijke anti-IFN-α ELISA (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Overwegingen</td>
			<td>Referentie</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. antilichaam paar keuze</td>
			<td>Doel verschillende epitopen</td>
			<td rowspan="3">Tabel 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hoge affiniteit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kop snel / traag Kaf
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. antilichaam paar oriëntatie</td>
			<td rowspan="3">Kies voorwaarden met de laagste limiet van detectie</td>
			<td rowspan="3">Figuur 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. het vastleggen van antilichaam concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotine: Detector antilichaam verhouding</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs. 3-stap configuratie</td>
			<td>Kies voorwaarde met de hoogste verhouding van signaal: achtergrond</td>
			<td>Figuur 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. detector antilichaam concentratie</td>
			<td rowspan="2">Kies voorwaarden met de laagste limiet van detectie</td>
			<td rowspan="2">Figuur 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. specificiteit</td>
			<td>Kruisallergie beoordelen</td>
			<td rowspan="2">Figuur 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. gevoeligheid</td>
			<td>Erkenning van subtypen beoordelen (indien van toepassing)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproduceerbaarheid</td>
			<td>Beoordelen assay variabiliteit</td>
			<td>Figuur 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: overzicht van stappen voor ontwikkeling en optimalisatie van een enkel molecuul matrix assay. Deze tabel bevat een overzicht van de verschillende stappen die nodig zijn voor de ontwikkeling en de optimalisatie van een enkel molecuul matrix assay, vanaf de eerste keuze van antilichaam paar tot de beoordeling van de reproduceerbaarheid.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigeen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10,7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93,29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233,1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2,54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1,83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Pan-alpha antilichaam selectie. IC50 (ng/mL) bepaald met behulp van de interferon-gestimuleerd respons-element (ISRE)-Luciferase neutralisatie assay. Tabel wordt IC50 waarden voor mAbs gebruikt in één molecuul matrix assay voor alle IFN-α subtypen. 10.000 HEK 293 MSR cellen waren geplaatst in witte helft-gebied 96-wells-platen en omgekeerde-transfected met 50 ng vooraf gemengd ISRE-Firefly luciferase verslaggever en Renilla luciferase constructies met behulp van transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant. De constructie luciferase-uiten diende als een interne normalisatie-besturingselement. Cellen werden 's nachts geïncubeerd in verminderd Serum Medium aangevuld met niet-essentiële aminozuren van 0,1 mM, 1 mM natrium pyruvaat, 0,5% foetale runderserum bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde sfeer. Na een incubatieperiode van overnachting, werden cellen gestimuleerd gedurende 24 uur met medium dat mengsels van recombinante menselijke IFN-α met of zonder anti-IFN-α mAbs of besturingselement IgG, die had zijn gepreïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na 24u van stimulatie, werden dubbele luciferase verslaggever testen uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. «-» Niet bepaald. Sifalimumab is een volledig mens, immunoglobulin G1 κ monoklonaal antilichaam dat bindt en neutraliseert de meerderheid van IFN-α subtypen; Rontalizumab is een Latijnse monoclonal antilichaam tegen IFN-α. Aangepast van Meyer et al. 2016 en Rodero et al. 2017.
Aanvullende tabel 1: selectie van antilichaam oriëntatie, capture antilichaam concentratie op kralen en biotinylation verhouding. De twee verschillende mogelijke configuraties werden getest, met behulp van de anti-IFN-α-A als vangen antilichaam en anti-IFN-α B als detectie antilichaam (A), en vice versa (B). IFNα - 2c werd gebruikt als antigeen. Verschillende vangen antilichaam concentraties evenals biotine: antilichaam (B:A) ratio's werden ook voor beide configuraties getest. Verzadiging (Sat). Oranje: AEB waarden die werden gebruikt voor de berekening van de LOD; deze concentraties werden gezien als blanco als de waarden van de AEB bleef stabiel. LOD werd berekend als lege bedoel + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Test van 2 vs 3-stap configuratie. De 2 en 3 - stap configuraties werden beoordeeld met behulp van IFNα - 2c als antigeen. AEB worden ook als signaal/achtergrond rantsoenen (S/B) waarden weergegeven voor beide voorwaarden. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 3: Detector en SBG concentratie optimalisatie. Drie verschillende concentraties van biotinyleerd detector antilichaam (0.1, 0.3 en 0.6 µg/mL) samen met drie verschillende concentraties van SBG (50, 150 en 250 uur) werden beoordeeld. AEB waarden weergegeven voor de negen geteste voorwaarden. Oranje: AEB waarden die werden gebruikt voor de berekening van de LOD; deze concentraties werden gezien als blanco als de waarden van de AEB bleef stabiel. LOD werd berekend als lege bedoel + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 4: specificiteit en de gevoeligheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. Gemiddelde enzym per kralen waarden worden weergegeven wanneer IFN-β, IFN-λ1 IFN-λ2, IFN-ω en IFN-γ recombinante eiwitten werden getest (A), samen met de 16 subtypen van IFN-α (B). «-» Niet bepaald. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 5: reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. De gemiddelde waarden van het AEB voor alle onafhankelijke driemaal zijn komen opdagen bij een concentratie van 10.000 fg/mL. «-» Niet bepaald. Verzadiging (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 6: eiwit competitie assay. Gemiddelde enzym per kralen waarden voor alle omstandigheden getest weergegeven worden. Metingen werden gedaan in tweevoud. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de aard, regulatie en biologische impact van de interferon-geïnduceerde reacties in verschillende ziekteomgevingen, inclusief auto-immuniteit en infecties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gepatenteerde gevoeligheid. Deze techniek heeft een groot potentieel voor het ontdekken van biomarkers om de patiëntenzorg bij vele ziekten te verbeteren, omdat het cytokinen kan meten met een ongekende gevoeligheid.Een belangrijke stap met deze benadering was het neutraliseren van activiteiten die gerelateerd zijn aan patiënten met auto-immuun polyindocrien systeem type één. Om te beginnen, laad 280 miljoen paramagnetische kralen in een microfugebuis, met aantekening van het volume. Drai vervolgens de kralen kort en plaats de buis een minuut op een magnetische scheider.Verwijder en gooi de verdunningsoplossing weg, waardoor de kralen worden geïsoleerd. Was vervolgens de kralen twee keer met BWB en twee keer met BCB. Voeg voor elke wasbeurt 200 microliter toe en vortex de buis gedurende vijf seconden.Scheiden vervolgens de kralen van de oplossing met behulp van de magnetische scheider. Na één minuut scheiding, gooi de verdunning weg. Voeg vervolgens 190 microliter BCB per kralenvolume toe.Vortex vervolgens kort de buis, draai de buis kort en zet de gewassen kralen op ijs. Om de kralen te activeren, combineer één milliliter koude BCB met 10 milligram EDC en vortex tot de oplossing homogeen is. Werk snel en veilig wanneer u EDC gebruikt, vanwege de inherente instabiliteit en equinus-oplossing.Voeg vervolgens 10 microliter koude, verdunde EDC per kralenvolume toe aan de kralensuspensie en vortex de kralen kort. Plaats vervolgens de kralen op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Om antilichamen aan de kralen te koppelen, vortex en puls eerst de geactiveerde kralen.Plaats vervolgens de kralen gedurende een minuut in een magnetische scheider en gooi de BCB-supernatant weg. Verwijder vervolgens de buis uit de magneet en was de kralen twee keer met 200 microliter BCB. Vortex vervolgens, pulseer en scheid magnetisch de kralen om de buffer te verwijderen.Voeg vervolgens snel 200 microliter koude, buffer-uitgewisselde antilichaam toe aan de geactiveerde kralen. Na het vortexen van de kralen in oplossing, zet de suspensie op de shaker bij kamertemperatuur gedurende twee uur bij 1.000 RPM. Begin met het geven van de antilichaam-gecoate kralensuspensie een pulserende draai en gebruik vervolgens de magnetische kolom om de buffer te verwijderen.Controleer vervolgens de concentratie van het eiwit in de buffer. Gebruik een spectrafotometer met laag volume. Op dit punt zijn de antilichamen gekoppeld aan de kralen en elke waarde boven nul betekent dat de kralen verzadigd zijn met antilichamen.Was vervolgens de kralen met 200 microliter BWB, zoals uitgevoerd bij alle eerdere wasbeurten. Transfer vervolgens de supernatant naar een nieuwe buis en controleer de eiwitconcentratie. Kwantificering van eiwitten die van de kralen worden afgegeven, maakt de meting van antilichaamkoppeling mogelijk.Was vervolgens de kralen opnieuw met 200 microliter BWB. Voeg vervolgens 200 microliter bead-blocking buffer toe, vortex de buis gedurende vijf seconden en breng deze over naar de shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na 30 minuten worden de kralen geblokkeerd.Was ze vervolgens één keer met 200 microliter BWB, gevolgd door twee keer wassen met 200 microliter bead diluent buffer voor elke wasbeurt. Bewaar vervolgens de gecoate en geblokkeerde kralen in 200 microliter bead diluent buffer bij vier graden Celsius. Dit gedeelte van de video suggereert strategieën voor het aanpassen van de testomstandigheden met behulp van de single molecule array analyzer software in de eigen bierconfiguratie.Begin met het testen van verschillende combinaties van gecoate antilichaamkralen en biotinyleringsdetectieantilichaam in beide antilichaamcombinaties. Test vervolgens combinaties van de drie verschillende gecoate antilichaamconcentraties met twee verschillende biotinyleringsverhoudingen voor detectie- en gecoate antilichamen en vice versa. Kies vervolgens de combinatie die het laagste detectieniveau biedt en gebruik deze voor verdere stappen.In dit geval geeft een verhouding van 30 op één biotin tot antilichaam het beste detectielimiet. Vergelijk vervolgens een twee-stappen configuratie met een drie-stappen configuratie. Drie-stappen configuraties hebben drie verschillende incubatiestappen.Een met het gecoate antilichaam, een met het detectieantilichaam en een laatste, derde voor de SBG-enzymlabeling. Twee-stappen configuraties combineren de gecoate en detectie-incubaties. Voer de single-molecule array analyzer uit met behulp van de geselecteerde gecoate en detector antilichaamconcentraties en verhoudingen in de twee- en drie-stappen configuraties, vooraf geconfigureerd in de analyzer, volgens de instructies van de fabrikant.Kies vervolgens de configuratie die de hoogste gevoeligheid mogelijk maakt en bewaar deze voor toekomstige stappen. In dit geval geeft de twee-stappen configuratie op elk testpunt iets hogere gevoeligheid. Optimaliseer vervolgens de concentraties van het detectorantilichaam en de SBG.Test drie verschillende concentraties detectorantilichaam met drie verschillende concentraties SBG. Kies de concentraties die de hoogste gevoeligheid geven en bewaar ze voor toekomstige stappen. In dit geval hebben 0,3 microgram per milliliter antilichaam en 150 pica molaire SBG het optimale detectieniveau met lage achtergrondniveaus met gelukkige medium amplitude.Voor aanvullende optimalisatie stappen, raadpleeg het tekstprotocol. Daarin staan procedures voor het optimaliseren van testspecificiteit en reproduceerbaarheid en een test voor eiwitconcurrentie. Met behulp van een test die is geoptimaliseerd om 13 subklassen van interferon-alpha te detecteren, werden plasma en serum geanalyseerd bij SLE-patiënten, JDM-patiënten en gezonde controles.Hoge niveaus van interferon-alpha-eiwit werden gedetecteerd in beide ziektecohorten. De stippellijn geeft het detectieniveau aan van een conventionele, commercieel verkrijgbare Eliza die het interferon-alpha-eiwit niet zou detecteren in deze

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.

ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op...

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Het karakteriseren van T-cel-epitopen van pathogenen die lokale infecties veroorzaken, zoals het humaan papillomavirus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal circulerende T-cellen. Er wordt een methode beschreven waarbij zeldzame T-cellen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd, beginnend met een zeer klein aantal cellen.

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

This video demonstrates an imaging method to visualize in situ interferon-gamma (IFN-γ) secretion in the mouse spleen. Following bacterial infection and the induction of IFN-γ accumulation inside T cells and natural killer cells, the spleen is harvested from the mouse. Upon obtaining tissue sections, immunostaining is performed to visualize IFN-γ inside the cells.

Assay for the Identification of Interferon-Gamma Secretion in Murine Lymphoid Organs

This video demonstrates secreted embryonic alkaline phosphatase assay using HEK-Blue interferon-α/β reporter cells to quantify the type-I interferons (IFNs) released following stimulation of plasmacytoid dendritic cells by HIV-1 Infected CD4+ T cells.

Quantification of Bioactive Type-I Interferons using a Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay

Dit protocol beschrijft een qRT-PCR-assay met hoge doorvoer voor de analyse van type I en III IFN-expressiesignaturen. De assay onderscheidt verschillen van enkele basenparen tussen de zeer vergelijkbare transcripten van deze genen. Door batchassemblage en robotisch pipetteren zijn de assays consistent en reproduceerbaar.

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Leer een ultrasensitive digitale ELISA ontwikkelen voor detectie van IFN-α subtypen in menselijke monsters. Deze methode optimaliseert antilichaamconjugatie en analyseert plasma van SLE- en JDM-patiënten voor biomarkeronderzoek.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Meer video's verkennen