Name: Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer een verbeterde tape-peel methode voor de isolatie van intacte huidmondjes-bewaardercellen uit plantenbladweefsel. Deze techniek levert betrouwbare monsters voor fysiologisch en biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Daniel Chen vanaf de digitale Video productie Team van Buchholz High School voor hulp bij het bewerken van de video. Dit onderzoek op stomatal guard cellen, proteomics en metabolomica in het lab Chen heeft gesteund door subsidies van de ons National Science Foundation (0818051, 1158000 en 1412547). Wenwen Kong wordt ondersteund door de Raad van de beurs van China. Dr. Qiuying Pang wordt ondersteund door de China Scholarship Raad en nationale Natural Science Foundation van China (31570396).

1. het kweken van planten
<ol><li>Kiemen de zaden in potten mengsel. Planten groeien in een groei-kamer met een lichtsterkte van 140 µmol fotonen m−2 s −1 en een fotoperiode van 8 h licht bij 22 ° C en 16u donker bij 18 ° C voor 2 weken.</li>
	<li>Zaailingen van vergelijkbare grootte afzonderlijk overplanten in 4" diameter potten met de grond en groeien voor een extra 3 weken in dezelfde voorwaarden in stap 1.1 beschreven. Opmerking: Planten met leidingwater twee keer per week Water de bodem om vochtig te houden.</li>
</ol>2. voorbereiding van verrijkte stoma
<ol><li>Verwijder de bladeren van 5 - weken oude A. thaliana planten individuele met een scalpel.</li>
	<li>Elk blad aan twee stukjes plakband duidelijk, koppelen met één stuk vast te houden aan de abaxial (onderkant) en het andere stuk aan adaxial (bovenste) van het blad. Laat de tape op het blad voor 5 s.</li>
	<li>Gentle peel apart de twee stukken van tapes met behulp van de wijsvinger en de duim op elke hand te scheiden van de abaxial kant met bestrating en guard cellen en de adaxial kant met mesophyl cellen.</li>
	<li>Plaats de schillen van de abaxial kant van de bladeren in 60 mL stoma openen buffer (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, aangepast aan de pH 6.2 met 1 M KOH) in 40 mm × 12 mm grootte Petri gerechten zoals ze zijn verzameld.<ol>
<li>Herhaal de bovenstaande stappen totdat alle monster schillen zijn verzameld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de petrischalen met het schillen in de kamer van de groei onder lichte voorwaarden zoals beschreven in stap 1.1. Laat de schillen onder het licht voor 2 h stoma volledig te openen.</li>
	<li>Plaats schillen in een 150 mm x 20 mm petrischaal met 50 mL celwand verteren enzym mengsel (0,7% cellulase R-10, 0,025% macerozyme R-10, 0,1% (g/v) Polyvinylpyrrolidon-40 en 0,25% (m/v) bovien serumalbumine in 55% basisoplossing (0.55 M sorbitol, 0.5 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, ascorbinezuur 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic zuur (MES) op pH 5.7 aangepast met 1 M KOH).</li>
	<li>Schud de schillen op een wederzijdse shaker in een petrischaal bij 50 rpm voor 20 min.</li>
	<li>Verwijder schillen uit enzym oplossing met een pincet, na 20 min. de schillen overbrengen in een petrischaal 150 x 20 mm grootte met 50 mL water.</li>
	<li>Met behulp van een pipet overdracht, spoel schillen voor 15 s tweemaal met 10 mL water voor het verwijderen van alle resterende enzym-oplossing.</li>
	<li>Gebruik pincet om schillen in een petrischaal van 150 x 20 mm grootte met 50 mL verse stoma openen buffer zoals gebruikt in stap 2.4. Incubeer gedurende 1 h in lichte voorwaarden zoals beschreven in stap 1.1 om de stoma te herstellen.</li>
</ol>3. Abscisic zuur (ABA) behandeling en stoma verkeer Assay
<ol><li>In een petrischaal 150 x 20 mm grootte. Incubeer de schillen van de verrijkte stoma bij 30° C gedurende 15 min in 50 mL van de stomatal opening buffer of 50 mL van de stomatal opening buffer met een eindconcentratie van 10 µM ABA voor de juiste behandeling keer.</li>
	<li>Plaats schillen op een shaker 50 rpm voor 5, 15 en 30 min. Na elk tijdsinterval een peeling verwijdert met een pincet en de beeldvorming stappen in stap 3.3.</li>
	<li>Neem beelden van stoma vóór ABA behandeling en tijdens de verschillende tijdstippen na ABA behandeling met een lichte Microscoop.<ol>
<li>Neem een peeling en plaats het op een microscoopglaasje van glas.</li>
		<li>Plaats van de dia in het werkgebied van de Microscoop en het werkgebied zodanig aanpassen dat het imago van de schil kan worden gevisualiseerd.</li>
		<li>Aanpassen van de boete en focus op de Microscoop om een duidelijk beeld van de guard cellen cursus.</li>
		<li>Neem verschillende beelden van meerdere stoma bij 40 X vergroting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meten van 60 stomatal openingen ImageJ8gebruikt.</li>
	<li>Berekent de standaardfout en betekenis op een p-waarde < 0.05 van de 60 stomatal diafragma metingen.</li>
</ol>4. eiwit extractie en afscheiding van de SDS-pagina
<ol><li>Slijpen van de schillen voor 15 s in genoeg vloeibare stikstof ter dekking van de schillen met behulp van een gekoeld mortier en een stamper.</li>
	<li>Per 50 schillen, voeg 3 mL van Tris verzadigd fenol (pH 8,8) en 3 mL eiwit extractie buffer (0,9 M sacharose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-Mercaptoethanol, 10 µL van 1 mM protease en phosphatase remmer) met een pipet op de mortel en vervolgens vermalen de schillen voor 5 addi operationele minuten in een zuurkast.</li>
	<li>Overdracht van het extract met behulp van een precisiepipet en de schillen met behulp van metalen pincet naar een Oakridge Centrifugeer buis en agitate in een roteerapparaat bij 50 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de schillen uit de Oakridge centrifugebuis en Centrifugeer het extract bij 5.000 x g gedurende 10 minuten. Breng de hoogste fenolische fase aan een nieuwe schone micro-centrifuge buis met behulp van een precisiepipet.</li>
	<li>Neerslag de fenol geëxtraheerd eiwitten door 5 volumes ijskoude ammoniumacetaat op 0,1 M in 100% methanol toe te voegen. Vortex kort en na een nacht bebroeden bij-20 ° C.</li>
	<li>Bij 20.000 x g bij 4 ° C gedurende 20 minuten centrifugeren, decanteren van het supernatant door gieten het langzaam uit de buis en behouden van de eiwit-pellet in de buis.</li>
	<li>Wassen van de eiwit-pellet tweemaal met 0,1 M ammoniumacetaat in methanol, en vervolgens tweemaal met 80% aceton en eenmaal met 100% koude aceton. Opmerking: Wast zijn gedaan door het toevoegen van 10 mL opgegeven reagens aan de buis van eiwit. Agitate in een roteerapparaat bij 50 t/min gedurende 5 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 15.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Giet het reagens uit de buis behoud alleen de eiwit-pellet.</li>
	<li>1 mL van 100% koude aceton toevoegen aan de pellet en resuspendeer door pipetteren langzaam op en neer.</li>
	<li>Breng de eiwitten via Pipetteer een 2 mL micro-centrifuge buis dan Centrifugeer bij 20.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijderen van de aceton door het decanteren uit buis en droog de pellet in de zuurkast gedurende 10 minuten.</li>
	<li>De proteïne in een micro-centrifuge buis met 200 µL van ontbinding buffer (8 M ureum, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl bij pH 8,5) ontbinden en vortex voor 30 min. Centrifuge bij 20.000 x g bij 15 ° C gedurende 20 min en verzamelen de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis.</li>
	<li>Kwantificeren van de eiwitconcentratie na de eiwit kwantificering protocol9.</li>
	<li>EiwitSteekproeven voor eiwit scheiding door de Elektroforese van het gel na het protocol10gebruiken.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Guard cellen zijn een modelsysteem voor het bestuderen van signaaltransductie mechanismen in planten en het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de bereiding van de monsters in de studie gebruikt het meest geschikt is om biologische vragen te beantwoorden. Ondanks de toenemende interesse in guard cellen binnen de onderzoekswereld plant, er is geen universele methode op hoe voor te bereiden stomatal guard-cellen die het mogelijk de stomatal beweging en de Fysiologie maken evenals de moleculaire veranderingen worden bestu...

Stoma spelen een belangrijke rol in de algemene fysiologie en fitness van planten. Deze kleine plant specifieke structuren worden gevormd door twee gespecialiseerde epidermale cellen bekend als bewaker cellen en meest overvloedig zijn gevonden op het abaxial oppervlak van bladeren. Stoma zijn noodzakelijk voor de uitwisseling van gassen tussen de fabriek en de atmosfeer, evenals de controle van waterverlies door transpiratie. Guard cellen regelen stoma diafragma door de integratie van verschillende externe (bijvoorbeeld, licht, vochtigheid, pathogen contact, kooldioxide niveaus) en interne (bv., endogene hormonen) prikkels1,2. In de afgelopen 20 jaar uitgegroeid tot dit celtype een modelsysteem voor studeren cel signalering processen in planten. Deze cellen vormen een klein deel van het totaal aantal cellen in een blad; om te onderzoeken hun unieke mobiele, biochemische en moleculaire eigenschappen in een eencellige manier, het is dus noodzakelijk om hen te isoleren van andere celtypes van het blad. In het verleden betrokken guard cel studies zijn vaak de voorbereiding van guard cel protoplasten (GCP)3,4,5. Dit meestal vereist het gebruik van grote hoeveelheden van celwand vernederende enzymen en/of mechanische storingen via mengen en heeft bewezen om dure en tijdrovende worden als het over het algemeen vele uren duurt te bereiden een steekproef GCP, vaak tijden met weinig rendement. Wat nog belangrijker is, doordat guard cellen als volledige paren fungeert aan stoma diafragma te regelen, kan het gebruik van GCP worden gezien als een kunstmatige systeem aan het bestuderen van de guard cel signalering.
Hier hebben wij een methode ter voorbereiding van de stoma waarin intact guard cellen zijn verrijkt en onderhouden van fysiologische reacties op prikkels ontwikkeld. Deze methode werd geïnspireerd door een methode die werd gebruikt voor het isoleren van de mesophyl cel protoplasten6,7. In onze werkwijze, zijn stoma bereid duidelijk plakband eerst scheiden de meerderheid van de mesophyl cellen zijn verbonden met de adaxial laag van het blad vanaf de abaxial laag met de bestrating en guard cellen. Dit wordt gedaan door het aanbrengen van een stukje tape aan elke kant van het blad en peeling hen uit elkaar. De cellen uit de abaxial laag zijn toegestaan om te herstellen onder licht in een buffer van de stoma-opening. Later worden de overgebleven cellen van de bestrating verwijderd met behulp van een kleine hoeveelheid celwand vernederende enzymen, guard cel die zijn verrijkt achterlaat op de tape.
In deze eenvoudige methode, stomatal guard-cellen die zowel levensvatbare en responsieve kan snel en efficiënt worden voorbereid houdend van minder dan een uur te verkrijgen van verrijkte stomatal guard cellen van 50 schillen met minimale kosten. De methode hier legt minder schade aan de plantencellen dan eerdere methoden waar protoplasten worden bereid. Bovendien, materiaal dat wordt opgevangen uit deze methode opbrengst wenselijk eiwit bedragen. Vooral omdat het blad niet aan het mengen onderworpen is of langdurige spijsvertering tijden en guard cellen intact blijven, zullen de resultaten van studies nauwer relevant zijn voor die van een natuurlijke guard celbiologie. Met deze methode kunnen stomatal bewegingen in real-time worden gecorreleerd met wijzigingen op het moleculaire niveau. Dus zou de kennis die opgedaan uit studies met behulp van deze methode voorbereiding zijn belangrijk voor een vollediger begrip van guard cel signalering.
We gebruikten de plant Arabidopsis thaliana als een model; Dit protocol kan echter worden toegepast op de verrijking van stomatal guard cellen bij andere plantensoorten zoals Brassica napus met kleine wijzigingen in de tijd van de spijsvertering. Als een bewijs van concept, hebben wij aangetoond dat stomatal guard cellen verrijkt via deze methode levensvatbare en reageren op stimuli, zoals blijkt uit de fluoresceïne DIACETAAT (FDA) assay en studies met behulp van het plantenhormoon abscisic zuur (ABA), respectievelijk. Daarnaast hebben we aangetoond dat eiwitten van hoge kwaliteit geïsoleerd uit deze cellen guard worden kunnen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol van dit proces.

<table><tbody><tr><td>Stainless Steel Surgical Scalpel</td><td>Feather&nbsp;</td><td>&nbsp;NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Microscope&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp;PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein Quantitation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Diacetate (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Abscisic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Companies&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Coomassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

stoma tape-peel: een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de guard cel

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

De studie van guard cellen is essentieel om de kennis van de specifieke bijdragen van dit celtype aan de algehele functie van planten. Echter is het vaak moeilijk om te isoleren en aldus het bestuderen van hen vaak biedt een uitdaging.
Deze studie stelt een stomatal bewaker cel verrijking methode. Het protocol maakt gebruik van plakband om guard cellen isoleren en haal eiwitten uit de cellen. Deze methode verbetert de integriteit en de opbrengst van guard cel in isolatie en biedt een betrouwbare steekproef voor de studie van cel signalering processen en hoe zij aan stomatal verkeer fenotypen correleren. Bij deze methode, waren de bladeren van de plant opgedeeld tussen de twee gedeelten van de tape en geschild uit elkaar om te verwijderen van de abaxial kant. Dit protocol werd toegepast op Arabidopsis blad weefsel te isoleren guard cellen. De cellen werden behandeld met fluoresceïne DIACETAAT (FDA) om te bepalen van de levensvatbaarheid en abscisic zuur (ABA) te beoordelen van stoma verkeer naar aanleiding van ABA. Tot slot bewijst dit protocol nuttig voor de voorbereiding van verrijkte stomatal guard cellen en isoleren van eiwitten. De kwaliteit van de cellen en eiwitten verkregen hier inschakelen fysiologische en andere biologische studies.

Een representatief beeld van Arabidopsis guard cellen vóór en na vertering van de mesophyl en epidermale cellen is afgebeeld in Figuur 1. Levensvatbaarheid van de cellen van de Guard vóór en na de verwijdering van mesophyl en epidermale cellen kan worden waargenomen met behulp van FDA enzymatische activiteit en integriteit van de celmembraan (figuur 1B en 1 D) te meten. Figuur 2 illu...

Dit protocol beschrijft een methode voor te bereiden van verrijkte stomatal guard cellen die nuttig is voor fysiologische en andere biologische studies.

Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Het algemene doel van dit experiment is om hoogwaardige verrijkte stomata-bewakercellen voor te bereiden voor fysiologische, biochemische en moleculaire analyses, zoals transcriptomics, proteomics en metabolomics. Hallo, mijn naam is Sheldon Lawrence. Ik ben een afstudeerstudent in het lab van Dr. Chen in de afdeling Biologie aan de Universiteit van Florida.Vandaag laat ik u zien hoe u bewakercellen kunt isoleren uit plantenbladweefsel die nuttig materiaal zijn voor het bestuderen van zowel de fysiologie als de biologie van stomata. Deze methode wordt beschouwd als een nieuwe methode voor het isoleren van bewakercellen. Het maakt specifiek de verrijking van intacte bewakercellen mogelijk en levert betrouwbare monsters voor de studie van signaalprocessen in stomata-cellen.De toepassing van deze methode kan worden uitgebreid tot Brassicaceae-planten en andere plantensoorten met slechts kleine aanpassingen aan het protocol. De demonstratie is belangrijk omdat de belangrijkste stap voor het verrijken van de bewakercellen een uitdaging kan zijn. Om te beginnen, selecteert u volwassen, vijf weken oude Arabidopsis-planten.Verwijder voorzichtig een blad met een scalpel, door het blad aan de basis af te snijden. Neem twee stukjes plakband en plaats het uitgesneden blad ertussen. Oefen voorzichtig druk uit op beide kanten terwijl u ervoor zorgt dat de uiteinden van de plakbandstukken niet aan elkaar hechten.Dit kan worden gedaan door een vinger ertussen te steken. Verwijder voorzichtig de twee stukken plakband uit elkaar en laat de schil die van de abaxiale kant van het blad is genomen, onmiddellijk drijven in stomata-openingsbuffer. Nadat alle schillen zijn verzameld, plaatst u ze onder het licht.Laat ze daar twee uur staan. Neem verschillende schillen en plaats ze op microscoopglaasjes. Gebruik een lichtmicroscoop, pas de lenzen aan om de bewakercellen te bekijken en zorg ervoor dat ze open zijn.Plaats de schillen in 50 ml van de celwandverteringsenzymoplossing. Drijf en incubeer ze bij 26 graden Celsius. Verwijder na 20 minuten de schillen uit de enzymoplossing en spoel twee keer kort met gedeïoniseerd water en plaats ze in verse stomata-openingsbuffer.Maal de schillen in een mortel met vloeibaar stikstof, met een stamper. Voer vervolgens fenolextractie uit zoals beschreven in de tekst. Nadat de schillen in een mortel met een stamper zijn gemalen, brengt u het extract, samen met de schillen over naar een Oak Ridge centrifugeerbuis en schudt u een uur op een schudler bij vier graden Celsius.Precipiteer de fenol geëxtraheerde eiwitten door vijf volumes ijskoud 0,1 mol ammoniumacetaat in 100% methanol toe te voegen. Na het bezinken van het eiwit een nacht bij 20 graden Celsius, oogst u het eiwit door centrifugatie en voert u pelletwashes uit zoals beschreven in de tekst. Breng het pellet opnieuw op in één milliliter koud aceton en breng het over in een microcentrifugebuisje van twee milliliter.Na centrifugatie gooit u de acetonsupernatant weg en laat u de pellet gedurende tien minuten drogen. Los het eiwitmonster op in een oplosbuffer. Na het mengen en centrifugeren, verzamelt u de supernatant en meet u de eiwitconcentratie.Voer een SDS-PAGE-gel uit. Visualiseer de afzonderlijke eiwitbanden en observeer de relatieve eiwitkwaliteit. Dit is een representatieve afbeelding van Arabidopsis-bewakercellen voor en na enzymvertering van de mesofylcellen en epidermale cellen.De levensvatbaarheid van de bewakercellen voor en na het verwijderen van mesofylcellen en epidermale cellen kan worden waargenomen met behulp van fluoresceïnediacetaat, dat enzymatische activiteit en celmembraanintegriteit meet. Zoals u kunt zien, zijn de bewakercellen nog steeds levensvatbaar na het afpellen en de enzymvertering. Dit voorbeeld illustreert de beweging van stomata van Arabidopsis als reactie op ABA-behandeling.Bewakercellen reageren op behandeling en de stomata-apertuur neemt meer dan 50% af na 30 minuten behandeling met ABA. Hier is een tijdsverloop van de beweging van stomata. Daarnaast wordt een representatieve afbeelding van de stomata-apertuur op elk tijdstip getoond.Eiwitdetectie, scheiding en relatieve abundantie wordt waargenomen door SDS-PAGE. De banden zijn duidelijk en onderscheiden. Er zijn vier biologische replica's opgenomen om de reproduceerbaarheid van eiwitextractie uit deze methode te benadrukken.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we probeerden om moleculaire veranderingen in bewakercellen in realtime te correleren met de beweging van stomata. Eenmaal beheerst, kan een eiwitmonster van stomata-bewakercellen binnen enkele uren worden bereid en kan het worden gebruikt in meerdere experimenten. Het is belangrijk om te onthouden geen grote hoeveelheid schade toe te brengen aan de bewakercellen tijdens het afpellen en hanteren.Volgens deze methode kunnen andere technieken worden toegepast om bewakercelsignalering te onderzoeken, zoals isobare labelering om de redoxrespons van eiwitten in planten in normale en stressomstandigheden te bestuderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intacte en levensvatbare bewakercellen kunt isoleren en verrijken, evenals hoogwaardig eiwit kunt extraheren dat geschikt is voor downstream-studies.

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.

Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl   van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe voor het opwekken van geclusterde stoma in zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling behandeling met een suiker-bevattende middellange oplossing en hoe waarnemen van intracellulaire structuren zoals chloroplasten en microtubuli in de geclusterde guard cellen met behulp van confocale laser microscopie.

Een inductie systeem voor geclusterde stoma door suiker oplossing onderdompeling behandeling in Arabidopsis thaliana zaailingen

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dit protocol presenteert een vergelijkende methode om huidmondjes- en epidermale kenmerken bij twee verschillende soorten te beoordelen met behulp van epidermale peelings, clearingtechnieken en AI-ondersteunde beeldanalyse. Het doel is om een hoog-doorvoerbare, reproduceerbare kwantificatie van cellulaire structuren die ten grondslag liggen aan de functie van huidmondjes mogelijk te maken voor landbouwtoepassingen en breed plantenonderzoek.

Karakterisering van huidmondjes en epidermale kenmerken met behulp van peelings, clearing en AI-gebaseerde beeldanalyse

Leer een verbeterde tape-peel methode voor de isolatie van intacte huidmondjes-bewaardercellen uit plantenbladweefsel. Deze techniek levert betrouwbare monsters voor fysiologisch en biochemisch onderzoek.

Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

Meer video's verkennen