Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

Het algemene doel van dit experiment is om hoogwaardige verrijkte stomata-bewakercellen voor te bereiden voor fysiologische, biochemische en moleculaire analyses, zoals transcriptomics, proteomics en metabolomics. Hallo, mijn naam is Sheldon Lawrence. Ik ben een afstudeerstudent in het lab van Dr. Chen in de afdeling Biologie aan de Universiteit van Florida.

Vandaag laat ik u zien hoe u bewakercellen kunt isoleren uit plantenbladweefsel die nuttig materiaal zijn voor het bestuderen van zowel de fysiologie als de biologie van stomata. Deze methode wordt beschouwd als een nieuwe methode voor het isoleren van bewakercellen. Het maakt specifiek de verrijking van intacte bewakercellen mogelijk en levert betrouwbare monsters voor de studie van signaalprocessen in stomata-cellen.

De toepassing van deze methode kan worden uitgebreid tot Brassicaceae-planten en andere plantensoorten met slechts kleine aanpassingen aan het protocol. De demonstratie is belangrijk omdat de belangrijkste stap voor het verrijken van de bewakercellen een uitdaging kan zijn. Om te beginnen, selecteert u volwassen, vijf weken oude Arabidopsis-planten.

Verwijder voorzichtig een blad met een scalpel, door het blad aan de basis af te snijden. Neem twee stukjes plakband en plaats het uitgesneden blad ertussen. Oefen voorzichtig druk uit op beide kanten terwijl u ervoor zorgt dat de uiteinden van de plakbandstukken niet aan elkaar hechten.

Dit kan worden gedaan door een vinger ertussen te steken. Verwijder voorzichtig de twee stukken plakband uit elkaar en laat de schil die van de abaxiale kant van het blad is genomen, onmiddellijk drijven in stomata-openingsbuffer. Nadat alle schillen zijn verzameld, plaatst u ze onder het licht.

Laat ze daar twee uur staan. Neem verschillende schillen en plaats ze op microscoopglaasjes. Gebruik een lichtmicroscoop, pas de lenzen aan om de bewakercellen te bekijken en zorg ervoor dat ze open zijn.

Plaats de schillen in 50 ml van de celwandverteringsenzymoplossing. Drijf en incubeer ze bij 26 graden Celsius. Verwijder na 20 minuten de schillen uit de enzymoplossing en spoel twee keer kort met gedeïoniseerd water en plaats ze in verse stomata-openingsbuffer.

Maal de schillen in een mortel met vloeibaar stikstof, met een stamper. Voer vervolgens fenolextractie uit zoals beschreven in de tekst. Nadat de schillen in een mortel met een stamper zijn gemalen, brengt u het extract, samen met de schillen over naar een Oak Ridge centrifugeerbuis en schudt u een uur op een schudler bij vier graden Celsius.

Precipiteer de fenol geëxtraheerde eiwitten door vijf volumes ijskoud 0,1 mol ammoniumacetaat in 100% methanol toe te voegen. Na het bezinken van het eiwit een nacht bij 20 graden Celsius, oogst u het eiwit door centrifugatie en voert u pelletwashes uit zoals beschreven in de tekst. Breng het pellet opnieuw op in één milliliter koud aceton en breng het over in een microcentrifugebuisje van twee milliliter.

Na centrifugatie gooit u de acetonsupernatant weg en laat u de pellet gedurende tien minuten drogen. Los het eiwitmonster op in een oplosbuffer. Na het mengen en centrifugeren, verzamelt u de supernatant en meet u de eiwitconcentratie.

Voer een SDS-PAGE-gel uit. Visualiseer de afzonderlijke eiwitbanden en observeer de relatieve eiwitkwaliteit. Dit is een representatieve afbeelding van Arabidopsis-bewakercellen voor en na enzymvertering van de mesofylcellen en epidermale cellen.

De levensvatbaarheid van de bewakercellen voor en na het verwijderen van mesofylcellen en epidermale cellen kan worden waargenomen met behulp van fluoresceïnediacetaat, dat enzymatische activiteit en celmembraanintegriteit meet. Zoals u kunt zien, zijn de bewakercellen nog steeds levensvatbaar na het afpellen en de enzymvertering. Dit voorbeeld illustreert de beweging van stomata van Arabidopsis als reactie op ABA-behandeling.

Bewakercellen reageren op behandeling en de stomata-apertuur neemt meer dan 50% af na 30 minuten behandeling met ABA. Hier is een tijdsverloop van de beweging van stomata. Daarnaast wordt een representatieve afbeelding van de stomata-apertuur op elk tijdstip getoond.

Eiwitdetectie, scheiding en relatieve abundantie wordt waargenomen door SDS-PAGE. De banden zijn duidelijk en onderscheiden. Er zijn vier biologische replica's opgenomen om de reproduceerbaarheid van eiwitextractie uit deze methode te benadrukken.

We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we probeerden om moleculaire veranderingen in bewakercellen in realtime te correleren met de beweging van stomata. Eenmaal beheerst, kan een eiwitmonster van stomata-bewakercellen binnen enkele uren worden bereid en kan het worden gebruikt in meerdere experimenten. Het is belangrijk om te onthouden geen grote hoeveelheid schade toe te brengen aan de bewakercellen tijdens het afpellen en hanteren.

Volgens deze methode kunnen andere technieken worden toegepast om bewakercelsignalering te onderzoeken, zoals isobare labelering om de redoxrespons van eiwitten in planten in normale en stressomstandigheden te bestuderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intacte en levensvatbare bewakercellen kunt isoleren en verrijken, evenals hoogwaardig eiwit kunt extraheren dat geschikt is voor downstream-studies.