Name: Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer methoden om cytotoxische amyloïden te detecteren na infectie van pulmonale endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa. Dit betrouwbare protocol genereert herhaalbare data voor infectieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd in delen door NIH grants HL66299 Rd, RB en SL, HL60024 naar TS, en HL136869 op MF.

Alle dierlijke procedures werden herzien en goedgekeurd door de institutionele en Animal Care Comité van de Universiteit van Zuid-Alabama en werden uitgevoerd volgens alle federale, staats- en lokale regelgeving. Primaire culturen van rat pulmonaire microvasculaire endotheliale cellen (PMVECs) werden verkregen uit de cel cultuur Core faciliteit bij de Universiteit van Zuid-Alabama's Center for Lung Biology. Cellen werden opgesteld op basis van de eerder beschreven procedures16.
1. generatie van cytotoxische supernatant
Opmerking: Hier, wij gebruiken twee verschillende stammen van P. aeruginosa: PA103, die een intact type III secretie systeem geschikt heeft voor het overbrengen van de exoenzymes ExoU en ExoT naar doelcellen tijdens de infectie, en ∆PcrV, die het ontbreken van een type III secretie systeem en is niet in staat zijn van overdracht van exoenzymes naar doelcellen na inoculatie.
<ol><li>Strijk bacteriën op Vogel-Bonner (VB) agar platen17 en 's nachts groeien bij 37 ° C.<ol>
<li>Ter voorbereiding van platen, maken de volgende stockoplossing (Vogel-Bonner zouten; 10 x voorraad): 2 g MgSO4, 20 g citroenzuur (vrij zuur), 100 g K2PO4en 35 g NaH2PO4meten. DdH2O aan 1 L en autoclaaf gedurende 15 minuten met langzame uitlaat toevoegen.</li>
		<li>Plaats 7,5 g agar in 450 mL ddH2O en autoclaaf als hierboven.</li>
		<li>Na autoclaaf, plaatst u beide oplossingen in een waterbad van 50 ° C afkoelen.</li>
		<li>Voeg 50 mL van de 10 x VB zout stockoplossing aan de agar.</li>
		<li>Toevoegen van carbenicillin aan 400 µg Mo/mL (voor de stammen van P. aeruginosa wordt gebruikt) en meng goed door de kolf zwenken.</li>
		<li>Plaats 5 mL van de oplossing van de agar VB in individuele steriele cultuur gerechten, toestaan de agar stollen, en vervolgens opslaan bij 4 ° C tot de dag van bacteriële zaaien.</li>
		<li>Op de dag van bacteriële zaaien, vooraf een plaat tot 37 ° C warm en dan strijk bacteriën op het bord met een steriele lus. Plaats de plaat in een incubator 37 ° C's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer of PMVEC zuiverheid door positieve kleuring met fluorescerende Griffonia simplicifolia lectine en negatieve kleuring met fluorescerende Helix pomatia lectine (een marker voor arteriële endotheliale cellen). Aliquot cellen en bevriezing in vloeibare stikstof.</li>
	<li>Onderhouden van cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum voor experimenten, en groeien van cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2. Het gebruik van cellen op passages 5-15.<ol>
<li>Voor de opwekking van cytotoxische supernatant, plaat 2 x 106 cellen in individuele 150 cm gerechten en groeien voor 3-4 dagen totdat samenvloeiing is bereikt. Gebruik twee platen per experiment (zie hieronder).</li>
		<li>Voor analyse van cytotoxische supernatant, plaat 1 x 105 cellen in individuele putjes van een 6-well schotel en groeien voor vier dagen totdat samenvloeiing is bereikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om te produceren supernatant, was een van de twee 150 cm gerechten van PMVECs uit stap 1.3.1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing, trypsinize en vervolgens de cellen tellen (wij gebruiken een geautomatiseerde cel teller en volg de fabrikant protocol; Zie Tabel van materialen). Het andere gerecht van PMVECs met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) wassen en vervolgens besmetten met beide stam van P. aeruginosa bij een veelheid van infectie (MOI) van 20:1. Dit wordt als volgt bereikt:<ol>
<li>Voor P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/mL. Ter voorbereiding van deze tweevoudige verdunning, aan een wegwerp cuvette van 1 mL met toevoegen van 1 mL HBSS. Schraap genoeg bacteriën off van de plaat dat in stap 1.1 was bereid tot een OD-540 van 0,25 wordt bereikt wanneer gemeten met een spectrofotometer. De volgende stap zal zorgen voor een berekening van hoeveel bacteriën nodig zullen zijn.</li>
		<li>Nadat het aantal PMVECs in de cultuur-schotel is vastgesteld (stap 1.4 hierboven), bepalen van het juiste aantal bacteriën worden toegevoegd aan de tweede, niet-trypsinized cultuur-schotel met de PMVECs. Bijvoorbeeld, indien wordt vastgesteld dat de cultuur schotel van PMVECs 1.3 x 107 cellen bevat, dan bereiden 1.3 x 107 cellen x 20 bacteriën/cel x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 mL bacteriën.</li>
		<li>Verdun de 1.3 mL van bacteriën in HBSS tot een eindvolume van 20 mL, zodat de volledige oppervlakte van een 150 cm schotel vloeistof kan worden voorzien, dan de verdunde bacteriën toevoegen aan de plaat van PMVECs.</li>
		<li>Incubeer de PMVECs geënt met de bacteriën bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 4-5 h, totdat gaten kunnen worden gezien in de cel enkelgelaagde vormen wanneer de plaat wordt microscopisch waargenomen (Zie Figuur 1 voor goede niveau van kloof vorming).</li>
		<li>Verzamelen van het supernatant en Centrifugeer gedurende 10 min bij 2.000 x g in een tafelblad centrifuge cellulaire puin te verwijderen. Opmerking: Elk tafelblad centrifuge kunnen genereren voldoende g omzetten in pellet unlysed cellen en grote cel fragmenten kunnen worden gebruikt voor deze stap.</li>
		<li>Giet het supernatant in een injectiespuit met een 0,2 µm filter gekoppeld aan zijn einde, vervolgens het supernatant passeren door het filter te verwijderen van bacteriën.</li>
		<li>Gebruik een aliquoot gedeelte van het supernatans dat steriele om te testen van de cytotoxiciteit (zie 2.1) en de rest van het supernatant bij-80 ° C voor toekomstig gebruik te bevriezen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. analyse van cytotoxische supernatant
<ol><li>Bepaling van de cytotoxiciteit<ol>
<li>Groeien PMVECs in 6-well gerechten tot de samenvloeiing. Wash wells Voeg eenmaal HBSS, vervolgens 1,5 mL filter-gesteriliseerde supernatant (verzameld uit beide cellen PA103 - of ∆PcrV-geënt) aan individuele putjes. Steriele HBSS wordt als een negatieve controle aan een ander goed toevoegen.</li>
		<li>Plaats de plaat in de CO2 -incubator voor 21-24 h, en vervolgens waarnemen voor cel doden/cytotoxiciteit (zie volgende stap). Gebruik van supernatant die vertonen van de cytotoxiciteit voor verdere experimenten en negeren die geen cel doden vertonen.</li>
		<li>Kwantificatie van het doden van de cel<ol>
<li>Maatregel lactaat dehydrogenase (LDH) vrijlating uit dode cellen met behulp van commercieel beschikbare LDH test Kits en fabrikant aanbevolen procedures.</li>
			<li>Als alternatief, cel doden microscopisch ImageJ softwarematig te kwantificeren. Hiervoor opnemen van microscopische beelden en gebieden van de cultuur-schotel met intact cellen, dan kwantificeren regio's ontbreekt cellen (indicatief van celdood in een enkelgelaagde) met behulp van een aangepaste macro voor ImageJ (National Institutes of Health) (Zie aanvullende codering bestand ). Indien gewenst, voert u de stappen van de macro als volgt handmatig:<ol>
<li>Input beelden (RGB- of TIFF-formaat) in de macro en helderheid op 15% verzadigd pixels. Contrast-aangepast afbeeldingen dupliceren en uitvoeren van de opdracht "aftrekken achtergrond" om een contrastrijk beeld van zowel de cel als de kloof gebied binnen het gezichtsveld te krijgen.</li>
				<li>Aftrekken van dit beeld van de oorspronkelijke afbeelding en de resulterende afbeelding met de oorspronkelijke afbeelding met behulp van de calculator van het beeld "En"-functie te combineren. De resulterende afbeelding omzetten in zwart (hiaten) en wit (cellen) masker met de drempel-functie (minimaal 0, maximaal 5), en gebruik van de functie "binaire eroderen" verwijderen van ruis van het beeld.</li>
				<li>Het meten van de verhouding van zwart naar wit pixels binnen het resulterende beeld met behulp van de "gebied fractie" meting. Uitzetten en fractionele gebieden voor het tijdstip van elke behandeling wordt uitgedrukt als percentage van maximale gap omgeving.</li>
				<li>Berekenen van de middelen en vergelijken met one-way ANOVA met de Tukey post hoc test, met p -waarden minder dan 0,05 beschouwd als belangrijke.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunoblot analyse gebruiken om de aanwezigheid van amyloid oligomere tau en Aβ in supernatant van cultuur. Immunoblot analyses met behulp van standaardprocedures10,11,12, met uitzondering van concentreren cultuur supernatant ten minste 10-fold voordat de elektroforese uit te voeren.<ol>
<li>Te concentreren supernatant, 1-2 mL van het supernatans dat in een centrifugeren filter eenheid waarvan membraan een cut-off molecuulgewicht van 10 kDa heeft te plaatsen. Dan, plaats de filter eenheid in een tafelblad centrifuge en centrifuge op 2.000 x g totdat de vereiste mate van concentratie is bereikt (meestal 45-60 minuten).</li>
			<li>Bepalen van de hoeveelheid eiwit in de geconcentreerde supernatant11 en laadt gelijke hoeveelheden van monsters in individuele putjes van de gel.</li>
			<li>Stormloop gels, de eiwitten overbrengen in nitrocellulose, vervolgens sonde blots met A11 anti-amyloid antilichaam, T22 anti-oligomere tau antilichaam of MOAB2 anti-Aβ antilichaam gevolgd door passende secundaire antilichamen. De vlekken met behulp van standaard Chemoluminescentie procedures te ontwikkelen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gebruiken om te doen een thioflavin T-Assay, thioflavin T, fluorescentie (ThT) te kwantificeren amyloids in supernatant. Voor deze metingen, gebruik filter-gesteriliseerde supernatant.<ol>
<li>Bereiden een stockoplossing (50 x) van thioflavin T door schorsing van 8 mg thioflavin T (ThT) in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filtreer de oplossing door een 0,22 µm filter verwijderen deeltjes na mengen.</li>
			<li>Voor metingen, Voeg 20 µL van ThT voorraad aan 1 mL PBS in een cuvet van de spectrofotometer 1 mL. Plaats het verdunde monster af in een spectrofluorimeter.</li>
			<li>Het meten van de basislijn fluorescentie uitstoot met behulp van 425 nm excitatie en scannen van de uitstoot van de fluorescentie van 450-575 nm in stappen van 2 nm.</li>
			<li>Een time-lapse scannen met behulp van 425 nm excitatie en 482 nm emissie, met gegevens verworven elke 0,2 s voor 60 s.</li>
			<li>De eerste 20 s van de time-lapse scan meet fluorescentie in de lege cuvette. 20 s, de scan pauzeren en 10 µL van het supernatans dat filter-gesteriliseerde toevoegen aan de cuvette. Meng de cuvette door inversie en vervolgens plaats terug in de spectrofluorimeter.</li>
			<li>Hervatten van de tijd gebaseerde scan, verwerven de laatste 40 s van gegevens.</li>
			<li>Na voltooiing van de time-lapse scan, scannen een definitieve fluorescentie emissiespectrum met identieke instellingen, zoals wordt beschreven in 2.1.5.3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
<li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li>
<li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li>
<li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li>
<li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Med+Assoc%22%5BJournal%5D)">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li>
<li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
<li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Dis+Assoc+Disord%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie%3A+Uncertainties%2C+biology%2C+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

Geen verslag.

Hier, zijn eenvoudig in vitro methoden beschreven waarmee de demonstratie van de generatie van cytotoxische amyloids tijdens de infectie met een longontsteking veroorzaken organisme. Deze methoden omvatten een cel cultuur cytotoxiciteit assay, immunoblotting, kwantificatie van cel doden met behulp van een nieuwe microscopische methode en ThT bindend. Analyses van de cytotoxische agenten hebben aangetoond dat ze amyloid in de natuur (Figuur 2 en <strong class="xfig...

Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis geen kwijting1,2,3,,4,,5,6. In de meeste gevallen overlijden door een soort eind-orgaanfalen zoals renale, pulmonale, cardiale, of lever evenementen, evenals lijn5,6. De reden voor de verhoogde sterfte in deze populatie is nooit vastgesteld.
Longontsteking is geclassificeerd als zijnde hetzij communautaire verworven of ziekenhuizen opgelopen (nosocomiale) en agenten die longontsteking kunnen veroorzaken bevatten bacteriën, virussen, schimmels en chemicaliën. Een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale pneumonie is de bacterie Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa is een gram-negatieve organisme waarmee een type III secretie systeem overbrengt van verschillende effector moleculen, genoemd exoenzymes, rechtstreeks naar het cytoplasma van target cellen7,8. Tijdens de infectie van pulmonaire endotheliale cellen richten de exoenzymes verschillende intracellulaire eiwitten, met inbegrip van een endotheel vorm van de microtubulus-geassocieerde eiwit tau9,10,11,12 , leidt tot endothelial barrière verdeling resulterend in ernstige longoedeem, daalde pulmonaire functie en vaak dood.
Zoals eerder vermeld, hebben patiënten die de eerste longontsteking overleven sterftecijfers in de eerste 12 maanden na ziekenhuis kwijting verheven. Een potentiële mechanisme voor het verklaren van dit verschijnsel is dat een soort van langlevende toxine wordt gegenereerd tijdens de initiële infectie die tot slechte op lange termijn resultaat leidt. Twee opmerkingen ondersteunen deze mogelijkheid. Eerste, gekweekte pulmonaire endotheliale cellen die in eerste instantie worden behandeld met P. aeruginosa niet vermenigvuldigen voor tot een week nadat de bacteriën worden gedood door de antibiotica13. Tweede, langlevende prionen en agenten met prion kenmerken zijn aangetoond in verschillende menselijke en dierlijke ziekten, met name het zenuwstelsel14,15is gekoppeld.
Methoden voor de behandeling van de potentiële productie van langlevende cytotoxische agenten tijdens de pulmonaire infectie zijn nooit beschreven. Hier een aantal eenvoudige in vitro testen worden beschreven die kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de cytotoxin productie en activiteit na infectie met behulp van een gemeenschappelijk longontsteking veroorzaken agent, P. aeruginosa. Deze testen moeten gemakkelijk aan te passen aan het onderzoeken van mogelijke cytotoxin inductie na infectie met behulp van andere stoffen die longontsteking veroorzaken, en het supernatant die worden gegenereerd ook moet nuttig zijn voor het onderzoeken van de effecten van de cytotoxins geheel organen of dieren. Tot slot zal de tests die worden beschreven hier waarschijnlijk worden aangepast aan het testen van dierlijke en menselijke biologische vloeistoffen voor de productie van cytotoxins tijdens longontsteking.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti beta amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 amyloid oligomeer antilichaam</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-tau oligomeer antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavine T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0,22 micron spuitfilters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Geitenantikonijn IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Strains PA103 en &Delta;PcrV</td><td></td><td></td><td>Deze stammen van P. aeruginosa werden verkregen van Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lektines</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lektines</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0,22 micron nitrocellulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Type 2 collageenase</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline Dinatriumzout</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeerconcentrators- 10.000 MW cut-off</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumfosfaat heptahydraat</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden voor het opsporen van cytotoxische amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis kwijting. Het heeft zijn veronderstelde dat besmetting van pulmonaire weefsel tijdens longontsteking resulteert in de productie van langlevende cytotoxins die tot daaropvolgende einde orgaanfalen leiden kunnen. Wij hebben ontwikkeld in vitro testen om te testen van de hypothese dat cytotoxins worden geproduceerd tijdens de pulmonaire infectie. Geïsoleerde rat pulmonaire endotheliale cellen en de bacterie Pseudomonas aeruginosa worden gebruikt als modelsystemen, en de productie van cytoxins na infectie van de endotheliale cellen van de bacteriën wordt aangetoond door middel van cultuur van de cel gevolgd door directe kwantificatie met behulp van lactaat dehydrogenase tests en een nieuwe microscopische methode ImageJ technologie. De amyloïde aard van deze cytotoxins werd aangetoond door thioflavin T bindende analyses en door immunoblotting en immunodepletion met behulp van de A11 anti-amyloid antilichaam. Verdere analyses met behulp van immunoblotting aangetoond dat oligomere tau en Aβ werden geproduceerd en uitgebracht door endotheliale cellen na infectie door P. aeruginosa. Deze methoden moeten gemakkelijk aanpasbaar aan analyses van menselijke klinische monsters.

Een eenvoudige in vitro -assay is ontwikkeld om assay voor de aanwezigheid van cytotoxins in supernatant van cellen die zijn besmet met de bacterie P. aeruginosa. Kortom, kweekmedium van geïnfecteerde cellen 4 h na bacteriële toevoeging is verzameld, de bacteriën worden verwijderd door het filter sterilisatie van de cultuur supernatant en vervolgens het steriele supernatant wordt toegevoegd aan een nieuwe bevolking van cellen. De cellen worden vervolgens waargenomen 21-2...

Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van longzorg te beantwoorden, zoals waarom patiënten die overleven na longontsteking die ze in het ziekenhuis opliepen, zo'n slechte langetermijnresultaten hebben. Het voordeel van deze methode is dat het eenvoudig en betrouwbaar is, wat betekent dat iedereen die in het lab komt het kan leren en de volgende dag nuttige en herhaalbare gegevens genereert. Hoewel deze analytische methoden kunnen worden toegepast om inzicht te geven in de infectie van gekweekte cellen in vitro, kunnen ze ook worden toegepast op diermodellen en menselijke patiënten.Om cytotoxische supernatant te produceren, was een 150 centimeter schaal van endotheelcellen met HBSS en verdun een P.aeruginosa-kolonie tot een absorptie van 0,25 bij 540 nanometer. Verdun de bacteriecellen verder om een multiplicity of infection van 20 tot één in 20 milliliter HBSS mogelijk te maken en zaai de bacteriën op het bord met endotheelcellen. Plaats vervolgens de geïnfecteerde cellen in een incubator van 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende vier tot vijf uur.Het is essentieel dat de incubatie van de bacteriën en de endotheelcellen gedurende een gepaste tijdsduur plaatsvindt. Als de incubatie te kort is, worden de amyloids niet vrijgegeven in het supernatant. Als de incubatie te lang is, zullen de cellen daadwerkelijk lyseren en al hun inhoud in het supernatant vrijgeven.De indicator die we gebruiken voor een gepaste incubatieduur is de vorming van gaten in het endotheelmonolayer. Wanneer gaten in het celmonolayer kunnen worden waargenomen door lichtmicroscopie, verzamel het supernatant voor centrifugatie om eventueel cellulair puin te verwijderen. Giet het supernatant in een spuit die is uitgerust met een 0,2 micron filter en passeer het supernatant door het filter om eventuele verontreinigende bacteriën te verwijderen.Stel vervolgens 1,5 milliliter steriele supernatant terzijde voor cytotoxiciteitstesten en bevries de rest van het monster op min 80 graden Celsius. Om de cytotoxiciteit van het verzamelde supernatant te beoordelen, voeg de 1,5 milliliter aliquot van filtergesteriliseerd supernatant toe aan een enkele put van een zes-putsplaat die een confluent longmicrovasculair endotheelcelcultuur bevat. Plaats de plaat in een CO2-incubator gedurende 21 tot 24 uur.Vervolgens verkrijg beelden van gebieden van de behandelde en controleculturen. Importeer de beelden in een aangepaste imagej-macro en pas het contrast aan naar 15% verzadigde pixels. Dupliceer de contrastaangestuurde beelden en gebruik achtergrond aftrekken om hoge contrastbeelden te verkrijgen van zowel de intacte cellen als het gatgebied binnen het gezichtsveld.Trek dit hoge contrastbeeld af van het originele beeld en gebruik de beeldcalculator en functie om het resulterende beeld te combineren met het originele beeld. Gebruik de drempelfunctie om de gecombineerde afbeelding om te zetten in een masker met de gaten in zwart en de intacte cellen in wit. En gebruik de binaire eroderen functie om eventuele ruis uit het beeld te verwijderen.Gebruik vervolgens de oppervlaktefractie om de verhouding van zwarte naar witte pixels binnen het resulterende beeld te meten. En plot en druk de fractionele gebieden voor elk behandelingstijdstip uit, als het percentage van de maximale gatgebied. Om de amyloids in het supernatant te kwantificeren, voeg 20 microliters vers bereide en gefilterde 50X thioflavine T-stockoplossing toe aan één milliliter PBS in een een milliliter spectrofotometer cuvet en laad het verdunde monster op een spectrofluorometer.Meet de baseline fluorescentie-emissie met een 425 nanometer excitatie. Scan de fluorescentie-emissie van 450 tot 575 nanometer in stappen van twee nanometer. Stel vervolgens het instrument in om een tijdsverloopscan uit te voeren met een 425 nanometer excitatie en 482 nanometer emissie met gegevensverzameling elke 0,2 seconden gedurende 60 seconden.Pauzeer de scan na 20 seconden en voeg 10 microliters filtergesteriliseerd supernatant toe aan de cuvet. Na het mengen door inversie, laad de cuvet opnieuw op de spectrofluorometer en hervat de tijdgebaseerde scan voor de laatste 40 seconden. Na voltooiing van het tijdsverloop, voer een laatste fluorescentie-emissiesspectrumscan uit met behulp van de oorspronkelijke scaninstellingen.De toevoeging van P.aeruginosa aan confluente lagen van longmicrovasculaire endotheelcellen induceert gatvorming tussen de cellen. Met behulp van imagej om de cytotoxiciteit van het supernatant te beoordelen, zoals aangetoond gedurende de eerste 12 uur van de behandeling, kunnen nog gezonde confluente celmonolagen worden gevisualiseerd als alle witte gebieden binnen het microscopische veld. Echter, na 18 uur na de toevoeging van supernatant verzameld uit PA 103 geïnfecteerde culturen, kunnen gaten in het monolayer worden gedetecteerd met het gebied van de cultuurschaal dat verstoken is van cellen lineair toenemen tot 36 uur behandeling, waarbij op dat moment bijna geen intacte cellen kunnen worden waargenomen.Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen door lactate dehydrogenase-afgifte te gebruiken als een marker voor cytotoxiciteit. Met lactate dehydrogenase voor het eerst gedetecteerd na 18 uur na de toevoeging van het cytotoxische supernatant en lineair toenemend tot de maximale celdoding wordt gemeten na 36 uur. De supernatanten kunnen ook worden beoordeeld door immunoblot-analyse of door het meten van de verandering in thioflavine T-fluorescentie-intensiteit vanwege conformationele veranderingen veroorzaakt door amylooide binding om de aanwezigheid van cytotoxische amyloids in de supernatanten te bepalen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben hoe cytotoxische supernatanten te genereren na infectie van endotheelcellen met citomonsis aeruginosa. Bovendien zou u goed thuis moeten zijn in de soorten assays die nodig zijn om de cytotoxinen die aanwezig zijn in die supernatanten te karakteriseren en te analyseren.

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Balczon, R., et al. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the protocol to quantify amyloids in culture supernatants from pulmonary endothelial cells infected with virulent bacteria, using thioflavin T, a fluorescent dye that binds to amyloid beta-sheet structures. An increase in fluorescence compared to baseline indicates the presence of amyloids in the culture...

Quantifying Bacterial Infection-Induced Amyloids Using Thioflavin T Fluorescence

Source: Balczon, R., et al. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure for generating cytotoxic supernatant from pulmonary endothelial cells following infection with Pseudomonas aeruginosa. It outlines how bacterial effector proteins disrupt host cell structure and induce the release of cytotoxic amyloid oligomers into the supernatant.

Obtaining Cytotoxic Amyloids Following Bacterial Infection of Rat Pulmonary Endothelial Cells

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

We hebben een muislongletselmodel ontwikkeld door intra-tracheale injectie van bacteriën Pseudomonas aeruginosa. Dit model bootst longletsel tijdens pneumonie na en is klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Hier beschrijven we de bereiding en toepassing van een op activiteit gebaseerde probe (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) waarmee voor de detectie en kwantificering van de actieve vorm van het enzym N proinflammatoire -acylethanolamine acid amidase (NAAA), zowel in vitro en ex vivo.

voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Hier beschrijven we een groeivoorwaarde om de kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosate kweken. We beschrijven ook twee afzonderlijke methoden voor de detectie en kwantificering van de exopolysaccharide alginaat geproduceerd door P. aeruginosa met behulp van een traditionele uronic zuur carbazole test en een alginaat-specifieke monoklonale antilichaam (mAb) gebaseerde ELISA.

Cultuur van kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosa en Quantitatie van zijn Alginate

We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.

P. aeruginosa Geïnfecteerde 3D Co-Cultuur van Bronchiale epitheelcellen en macrofagen bij Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Antibioticaresistentie bij adherent-invasieve Escherichia coli-stammen vormt uitdagingen bij het beoordelen van bacteriële invasie met de traditionele gentamicine-beschermingsassay. Er wordt een verbeterde methode beschreven om bacteriële invasie kwantitatief te evalueren door kolonievormende eenheden op te sommen en kwalitatief door geïnfecteerde cellen te visualiseren met immunofluorescentie-confocale microscopie.

Amikacine Beschermingsassay voor Kwantificering en Visualisatie van Escherichia coli-celinvasie

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van...

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Leer methoden om cytotoxische amyloïden te detecteren na infectie van pulmonale endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa. Dit betrouwbare protocol genereert herhaalbare data voor infectieonderzoek.

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Meer video's verkennen