Name: Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Leer fluorescerende moleculaire tomografie voor niet-invasieve in vivo beeldvorming van glioblastoom xenografts. Deze methode maakt real-time monitoring van tumorbiologie en behandelingsrespons mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center voor GBM-PDX-neurospheres. Dit werk werd gesteund door de nederlaag GBM onderzoek samenwerking, een dochteronderneming van National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), de James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez werd ondersteund door een award van de American Brain Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca werd gedeeltelijk ondersteund door een Amerikaans-Italiaanse Cancer Foundation postdoc fellowship. Frank Furnari ontvangt salaris en extra ondersteuning van het Ludwig-Instituut voor kankeronderzoek.

Het gebruik van experimenteel onderzoek dieren en infectieuze agentia, zoals lentivirus aan transduce van de kankercellen, vereisen voorafgaande toestemming door de institutionele dierenverzorgers programma en door de Commissie institutionele bioveiligheid. Dit protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de Universiteit van Californië-San Diego (UCSD).
1. etikettering van Glioblastoma cellen met FP635 of FP720 Construct
<ol><li>Produceren en te zuiveren lentivirus volgens het protocol beschreven door Tiscornia et al. 12
</li>
	<li>Cultuur ongeveer 2.0 x 106 cellen uit een menselijke glioma cel-lijn met DMEM plus 10% foetale runderserum (FBS) in een schotel 15 cm; of cultuur 2.0 x 106 menselijke glioblastoma patiënt afkomstige (GBM-PDX) gebieden met DMEM/F12 1:1 medium met B27 supplement plus menselijke recombinante epidermale groeifactor (EGF; 20 ng/mL) en FGF (10 ng/mL) in een maatkolf van T75.</li>
	<li>Behouden alle cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 100% relatieve vochtigheid.</li>
	<li>Distantiëren van de cellen.<ol>
<li>Voor de glioma cellen: Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de platen en 3-5 mL trypsine 1 X aan de glioma cellen toe te voegen.</li>
		<li>Voor de GBM gebieden: de cellen verzamelen door de cellen in een buis 15 mL pipetteren.<ol>
<li>Spin down de GBM sferen bij 200 x g gedurende 5 min met behulp van een tafelblad centrifuge bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Verwijder het supernatant en voeg 3-5 mL cell detachement oplossing.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubeer alle cellen bij 37 ° C gedurende 10-15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorgvuldig distantiëren van de cellen door pipetteren op en neer meerdere malen (zorgen dat bollen en glioma cellen zijn voltooid losgekoppeld) en spin down bij 200 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 5 mL medium door pipetteren op en neer meerdere malen. Het bepalen van de levensvatbaarheid van de cellen door trypan blauwe uitsluiting.</li>
	<li>Plaat 1.0 x 106 van doelcellen in een 10-cm schotel met 5 mL medium door pipetteren.</li>
	<li>Cellen met lentivirus uiting van fluorescente proteïnen op de veelheid van infectie (MOI) 5 zoals is beschreven door Tiscornia et al. transduce 12 en Incubeer bij 37 ° C.</li>
	<li>Na 24u, verwijder het medium van de getransduceerde cellen, voeg 5 mL van verse medium en incubeer gedurende extra 48 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>De geïnfecteerde cellen in een suspensie van eencellige zoals beschreven in stappen 1.4-1.6 distantiëren. Spin down de cellen bij 200 x g gedurende 5 min en resuspendeer in 500 µL van het sorteren van de oplossing (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% FBS).</li>
	<li>Pipetteer de celsuspensie in FACS buizen. Co vlek de cellen met 1 µL/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride uit te sluiten van de dode cellen. Negatieve controles zijn vereist voor het instellen van de stroom cytometer poorten (niet-getransduceerde cellen en niet-getransduceerde cellen / DAPI gekleurd).</li>
	<li>De TL-positieve/DAPI-negatieve cellen in oplossing, sorteren sorteren, zoals beschreven door Basu et al. 13, en het verzamelen van de gesorteerde cellen in een conische buis 15 mL.</li>
	<li>Spin down de gesorteerde cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 mL gestolde voedingsbodem. Zaad de gesorteerde cellen in een 10-cm schotel door pipetteren. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 48-72 uur.</li>
	<li>Uitbreiden van de gesorteerde cellen door te distantiëren van de cellen als volgt 1.4-1.6 en plating in veelvoudige schotels voor in vivo experimenten. Opmerking: Voor meer informatie over de cel sorteren van voorbereiding en zuivering, zie Basu et al. 13
</li>
</ol>2. intracraniële injectie van iRFP-gelabeld Glioblastoma cellen in immunodeficiëntie muizen
Opmerking: Voordat u begint de chirurgie, zorg ervoor dat de chirurgische kamer en hulpmiddelen schoon voor de procedure zijn. Gebruik immunodeficiëntie athymic naakt (Foxn1nu) mannelijk of vrouwelijk muizen, tussen 4-5 weken oud en 17-19 g voor intracraniële injecties. Dieren moeten worden gehuisvest gedurende ten minste 3 dagen na aankomst en voor de operatie.
<ol><li>Voorbereiding van de cel<ol>
<li>Oogst en distantiëren van fluorescerende positief-glioma cellen in een suspensie van eencellige (stappen 1.4-1.6) en resuspendeer 0,5 of 1.0 x 106 cellen in 2-5 µL van PBS per injectie per dier. Pipetteer de celsuspensie in een 1.5-mL microcentrifuge buis en plaats op het ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anesthesie-voorbereiding en toediening<ol>
<li>200 µL van zoutoplossing met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) per 20 gram lichaamsgewicht muis voor te bereiden. Weeg de dieren en het berekenen van de juiste dosis van de verdoving.</li>
		<li>Bieden een intraperitoneale injectie van anesthesie en oogheelkundige zalf van toepassing op de ogen om uitdroging te voorkomen. Zie voor meer informatie over deze stap Kathleen et al. 14 Place het dier op een voorverwarmde water thermische pad bij 37 ° C.</li>
		<li>Controleren dat de dieren door het toezicht van de teen snuifje reactie (pedaal reflex), meestal binnen 5-10 min zijn verdoofd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intracraniële injectie<ol>
<li>Laden van een 5 µL Hamilton injectiespuit (naald botte uiteinde) met celsuspensie en houder van de houder van de sonde.</li>
		<li>Plaatst u de muisaanwijzer in een kleine dierlijke stereotactische frame en op te lossen het hoofd met behulp van de oor-balken en de adapter van de snijtand volgend op de beschreven details door Cetin et al. 15
</li>
		<li>Desinfecteer het hoofd met 70% ethanol en betadine oplossing. Zorg ervoor dat de chirurgische site is volledig steriel. Het uitvoeren van een middelste incisie met een kleine scalpel en scheiden van de huid en bindweefsel.</li>
		<li>Plaats de injectiespuit Hamilton op het punt van de bregma met behulp van de micromanipulator.</li>
		<li>De sonde houder 1,0 mm anteroposterior en 2.0 mm laterale verplaatsen vanaf het punt van de bregma. Markeer deze plaats met een potlood.</li>
		<li>Op deze locatie, zorgvuldig Maak een gat in de schedel met een micromotor hand-held boor door lichte druk naar beneden toe te passen totdat de bloedvaten zichtbaar worden. De arachnoideavilli mater en hersenen parenchym niet verstoren.</li>
		<li>Breng de naald in het burr gat en vooraf 3.0 mm onder het pial oppervlak.</li>
		<li>Instellen van het volume (2-5 µL) en stroomsnelheid (1 µL/min) van injectie met behulp van een gemotoriseerde stereotaxic injector of handmatig uitvoeren van de injectie.</li>
		<li>Na de injectie, verwijder de naald geleidelijk door oplopend van 1,0 mm elke 1 min en reinig van de injectieplaats met 70% ethanol.</li>
		<li>Dicht de huid gewikkeld met chirurgische nietjes of door het maken van chirurgische hechtingen (vaak aangeduid als de hechtingen) en Kathleen et al. Zie 14 voor meer details.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dierlijke herstel<ol>
<li>Het dier overbrengen in een water thermische pad (37 ° C) en het controleren van de lichaamstemperatuur, ademhalingsfrequentie en hartslag, tot volledig herstel. Analgesia per standaardprotocollen beheren. Opmerking: Zie voor meer informatie over de stereotactische procedure, chirurgie en coördinaten, andere verslagen5,14,15.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FMT Imaging
Opmerking: Volgens de experimentele doel, de iRFP-gelabeld glioblastoma cellen kunnen worden gecontroleerd in vivo vóór, tijdens of na de behandeling. Voor imaging-doel, anesthetize van dieren met behulp van een Isofluraan inductie kamer, onderhouden in een imaging cassette tijdens het scannen, en beeld in de dokkende post van de imager FMT.
<ol><li>Het dier uit de kooi en de plaats in de zaal van de inductie Isofluraan verwijderen. Sluit de zaal en zuurstof stroom en vaporizer tot 3-5% inschakelen.</li>
	<li>Controleren van het dier totdat het volledig verdoofd is, meestal binnen 1-2 min. onbewuste dieren moeten niet reageren op externe prikkels.</li>
	<li>Verwijderen van de narcose dier uit de kamer en zet het dier in de beeldvorming cassette door het plaatsen van de hoofd adapter eerst, gevolgd door het plaatsen van het dier naar beneden gericht. Zorg ervoor dat het hoofd in het centrum van de cassette ligt.</li>
	<li>De bovenste plaat van de cassette plaats op bovenkant en draai de knoppen van de aanpassing tot 17 mm.</li>
	<li>Eens dat het dier is veilig in de beeldvorming cassette, gaat u verder met de beeldvorming door het invoegen van de cassette in de interne dokkende post van de FMT imager, waar de Isofluraan wordt gepompt om te houden van het dier verdoofd.</li>
	<li>Voer de imager en analyzer software door te dubbelklikken op het pictogram software.</li>
	<li>Selecteer in het venster "Experimental lusje", de "Database" en een "Studiegroep".</li>
	<li>Ga naar het "Scan lusje"-venster en selecteer het onderwerp naar afbeelding door te klikken op "Selecteer onderwerp". Ook, selecteer het laser-kanaal in het deelvenster 'Laser kanaal'. De FP635-geëtiketteerden cellen, selecteert u "laser kanaal 635 nm" en voor FP720-geëtiketteerden cellen, selecteert u "laser kanaal 680 nm".</li>
	<li>Het verwerven van een afbeelding door te klikken op de optie "Capture" in het "Scan lusje" venster. Pas vervolgens, de scan veld aan te klikken en de scan-veld in het opgenomen beeld naar een bepaald aantal locaties van de bron, meestal in 20-25 bronnen voor de ipsilaterale kant te slepen.</li>
	<li>Vink de optie "Toevoegen aan wederopbouw wachtrij" en druk op "Scannen" in het "Scan lusje" venster.</li>
	<li>Wacht totdat het aftasten wordt voltooid en vervolgens de imaging cassette verwijderen uit het docking-station.</li>
	<li>Verwijder de bovenste plaat van de cassette en plaats van de dierlijke terug in de kooi.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3.1-3.12 voor de rest van de dieren.</li>
</ol>4. de beeldanalyse
<ol><li>Selecteer in het vak de imager en analyzer software, de "Analyse van het lusje" venster.</li>
	<li>De dataset en het onderwerp te analyseren door te klikken op de knop "+" in het "Dataset selectie"-paneel van de "Analyse van het lusje" venster geladen.</li>
	<li>Nadat de afbeelding is geladen in het venster "Analyse van het lusje", uitvoeren de regio van belang (ROI) analyse door het selecteren van de ellipsoïde icoon in de linker bovenhoek van het venster "Analyse van het lusje".</li>
	<li>Aanpassen van de drempel tot nul in het "statistische gegevens"-paneel door rechts te klikken op de "drempel" kolom in het venster "Analyse van het lusje".</li>
	<li>De totale waarde in het "Statistische gegevens"-deelvenster vertegenwoordigt het signaal uit de cellen van de TL-gelabeld glioblastoma geïmplanteerd in de hersenen van de muis.</li>
	<li>Herhaal stap 4.2-4.4 voor de rest van de dieren. Laden of een nieuw onderwerp verwijderen door te klikken op de "+" of "−" knop, respectievelijk in het deelvenster 'Dataset selection' van het venster "Analyse van het lusje". Opmerking: Zie voor meer informatie over FMT beeldvorming en werking van de software,20.
</li>
</ol>

<ol><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+Statistical+Report%3A+Primary+Brain+and+Other+Central+Nervous+System+Tumors+Diagnosed+in+the+United+States+in+2009-2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013.</a> Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Stewart, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Utility+of+Patient-Derived+Xenografts+to+Determine+Biomarkers+of+Prognosis+and+Map+Resistance+Pathways+in+EGFR-Mutant+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+brainstem+tumor+model+using+in+vivo+bioluminescence+imaging+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Child%27s+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat.</a> Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).</li>
<li>Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNyati%2C+S+%22ATM+Kinase%3A+Methods+and+Protocols%22">ATM Kinase: Methods and Protocols</a>. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+assessment+of+regional+directed+delivery+in+a+rodent+malignant+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model.</a> J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).</li>
<li>Badr, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBadr%2C+CE+%22Bioluminescent+Imaging%3A+Methods+and+Protocols%22">Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols</a>. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins+for+multicolor+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging.</a> Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).</li>
<li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Benitez, J. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/ncomms15223">PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3.</a> Nature Communications. 8, 15223(2017).</li>
<li>Kirschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Orthotopic+Glioblastoma+Xenografts+in+Mice+Using+a+Clinical+CT+Scanner%3A+Comparison+with+Micro-CT+and+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology.</a> PLOS ONE. 11 (11), e0165994(2016).</li>
<li>Mannheim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+Small+Animal+Imaging-Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects.</a> Molecular Imaging and Biology. , (2017).</li>
<li>Engblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+remotely+supply+lung+tumors+with+cancer-promoting+SiglecFhigh+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils.</a> Science. 358 (6367), (2017).</li>
<li>Lauber, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+vivo+imaging+techniques+for+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals.</a> Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).</li>
<li>Zanca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+cross-talk+converges+on+NF-%CE%BAB+to+attenuate+EGFR+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity.</a> Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).</li>
<li>Villa, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR-Cholesterol+Axis+Creates+a+Metabolic+Co-Dependency+for+Brain+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers.</a> Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+Mutation+Promotes+Glioblastoma+through+Epigenome+and+Transcription+Factor+Network+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling.</a> Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Tumor xenografts zijn uitgebreid gebruikt in kankeronderzoek en een aantal gevestigde beeldvormingstechnieken uitgewerkt: BLI; magnetische resonantie imaging (MRI); positron emissie tomografie (PET), berekend tomografie (CT); FMT. Elk van deze benaderingen komt met voors en tegens, maar uiteindelijk elkaar aanvullen met het type van de verstrekte informatie. Een van de meest gebruikte in vivo imaging technologie is BLI5,,6,,7...

Kanker is één van de belangrijkste oorzaken van ziekte-gerelateerde sterfgevallen bij de mens in de geïndustrialiseerde wereld. Nieuwe behandelingen zijn met een extreem hoge dodental, dringend noodzakelijk. Glioblastoma multiforme (GBM) is een uiterst dodelijk soort hersenkanker, samengesteld uit heterogene populaties van tumor, stromale en immuun hersencellen. Volgens het register van de tumor centrale hersenen van de VS is de incidentie van primaire kwaadaardige en niet-kwaadaardige hersentumoren ongeveer 22 gevallen per 100.000. Ongeveer 11.000 nieuwe gevallen worden verwacht te worden gediagnosticeerd in de VS in 20171.
Preklinische studies onderzoeken de waarschijnlijkheid van een drug, procedure of behandeling effectief vóór de test bij de mens. Een van de vroegste stappen van het laboratorium in preklinische studies is het identificeren van potentiële moleculaire targets voor medicamenteuze behandeling met behulp van kankercellen ingeplant in een ontvangende organisme, gedefinieerd als menselijke xenograft modellen. Binnen deze context intracraniële hersenen tumor xenograft modellen met behulp van de patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons, en meer recentelijk voor biomarkers ontwikkeling, drug screening, en gepersonaliseerde geneeskunde2,3,4.
Een van de meest betaalbare en niet-invasieve in vivo imaging methoden voor het controleren van intracraniële xenografts is de Bioluminescentie imaging (BLI)5,6,7,8. Enkele BLI beperkingen omvatten echter substraat administratie en beschikbaarheid, enzym stabiliteit, en lichte blussen en verstrooiing tijdens imaging overname9. Hier melden we de infrarood FMT als alternatief imaging methode voor het controleren van preklinische glioblastoma modellen. Deze methode, signaal overname en kwantificering van intracranially geïmplanteerde PDXs geven uiting aan een nabij-infrarood fluorescent proteïne iRFP72010,11 (voortaan aangeduid als FP720) of turboFP635 (voortaan aangeduid als FP635), wordt uitgevoerd met een FMT imaging systeem. Met de technologie van FMT de orthotopic tumoren kunnen worden gecontroleerd in vivo vóór, tijdens of na de behandeling, in een niet-invasieve, substraat-vrije en kwantitatieve wijze voor preklinische waarnemingen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/High Glucose&nbsp;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant EGF&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant FGF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>Gecontroleerde stof</td></tr><tr><td>Zlf</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable suture</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>5 ul syringe</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>Catalogusnummer zoals verkocht door Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>Mouse stereotaxic frame&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stereotaxic injector</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Micromotor hand-held drill</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>Mouse warming pad&nbsp;</td><td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Tomography System&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>TrueQuant Imaging Software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>7005319</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-centrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture 100mm Dishes</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture 150mm Dishes</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Flasks T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Athymic nude mice</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Strain Code&nbsp; 490 (Homozygous)</td><td>Voorafgaande goedkeuring vereist van het Institutioneel Dierverzorgingsprogramma en van het Institutioneel Bioveiligheidscomité.&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fluorescentie moleculaire tomografie voor in vivo imaging van glioblastoma xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigeniciteit is de mogelijkheid van kankercellen vormen een tumor massa. Een veel gebruikte aanpak om te bepalen of de cellen tumorigene is subcutaan injecteren van immunodeficiëntie muizen met kankercellen en het meten van de massa van de tumor na zichtbaar en voelbaar wordt. Orthotopic injecties van kankercellen streven naar de invoering van de xenograft in de communicatie dat het meest lijkt het weefsel van oorsprong van de tumor worden bestudeerd. Hersenen kankeronderzoek vereist intracraniële injectie van kankercellen om de vorming van de tumor en analyse in de unieke communicatie van de hersenen. De in vivo beeldvorming van intracraniële xenografts controleert onmiddellijk de tumor massa van orthotopically geaccepteerd muizen. Wij rapporteren hier het gebruik van fluorescentie moleculaire tomografie (FMT) van hersenen tumor xenografts. De kankercellen zijn eerste getransduceerde met in de buurt van infrarood fluorescente proteïnen en vervolgens geïnjecteerd in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen. De dieren worden vervolgens gescand om kwantitatieve informatie over de tumor massa over een langere periode van tijd. Cel vooraf labeling zorgt voor betrouwbare, rendabele en reproduceerbare kwantificering van de tumor lasten binnen elke muis. Wij geëlimineerd de noodzaak voor het injecteren van imaging substraten en zo verminderd de stress bij de dieren. Een beperking van deze aanpak is vertegenwoordigd door het onvermogen om het detecteren van zeer kleine massa's; het heeft echter een betere resolutie voor grotere massa dan andere technieken. Het kan worden toegepast om te evalueren van de effectiviteit van een medicamenteuze behandeling of genetische wijzigingen van glioma cellijnen en patiënt afkomstige monsters.

Glioblastoma U87EGFRvIII cellen (U87 cellen overdreven uiten het EGF receptor variant III) volgens de stap 1.2 werden gekweekt. Lentivirus werd geproduceerd en gezuiverd volgens stap 1.1. De virale concentratie werd bepaald door p24 ELISA analyse. Cellen werden getransduceerde met lentivirus infrarood fluorescente proteïnen volgens stap 1.8 uitvoering. Het plasmide codering FP72010,11 werd vriendelijk geleverd door Dr. V.V. Verkhu...

Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een preklinisch model voor hersentumorbeeldvorming te vestigen met behulp van fluorescentie moleculaire tomografie of FMT. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hersentumorbiologie, kankeronderzoek en geneesmiddelontdekking over tumoragressiviteit, heterogeniteit en behandelingsgevoeligheid. Het grote voordeel van deze techniek is dat de tumoren in vivo kunnen worden gemonitord voor, tijdens of na de behandeling op een niet-invasieve, niet-naadloze en kwantitatieve manier.Een ander voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om deze toe te passen op andere typen xenograftmodellen die in verschillende organen van het dier zijn geïmplanteerd. Begin door eenmaal 10 tot de zesde glioblastomacellen in vijf milliliter medium in een 10 centimeter schaal te zaaien voor 24 uur incubatie in een celcultuurincubator. De volgende ochtend, transduceer de cellen met lentivirus dat een geschikte fluorescente eiwit van belang tot expressie brengt bij een infectiemultipliciteit van vijf en breng de cellen terug naar de incubator.Na 24 uur, vervang het supernatant met vijf milliliter vers medium

fluorescence-molecular-tomography-for-vivo-imaging-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

Diffuse fluorescentie tomografie biedt een relatief goedkope en potentieel hoge hele benadering van de...

Computed Tomography-begeleide tijd-domein Diffuus fluorescentie tomografie in kleine dieren voor het lokaliseren van Cancer Biomarkers

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

In this video, we describe a protocol for genetically engineering glioma cells to express infrared fluorescent protein or iRFP. These fluorescent-tagged glioma cells hold utility in deep tissue imaging to understand the development of brain tumors.

Fluorescent Labeling of Glioma Cells: A Lentiviral Vector-based Transfection Method to Obtain Glioma Cells Expressing Fluorescent Protein for Deep Tissue Imaging

In this video, we describe fluorescence molecular tomography or FMT for in vivo imaging of fluorescent protein-tagged glioblastoma xenografts in mouse models. The technique is useful for elucidating the effects of anti-tumor therapeutics at the molecular level.

Fluorescence Molecular Tomography: An Imaging Technique for In Vivo Imaging of Fluorescent Protein-tagged Glioblastoma Xenografts in Mouse Model

Source: Clark, A.J., et al. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates bioluminescence imaging to track glioblastoma progression in an immunocompetent mouse model, using luciferase-expressing tumor cells and luciferin to quantify tumor growth non-invasively.

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Mouse Model for Glioblastoma

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Leer fluorescerende moleculaire tomografie voor niet-invasieve in vivo beeldvorming van glioblastoom xenografts. Deze methode maakt real-time monitoring van tumorbiologie en behandelingsrespons mogelijk.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Meer video's verkennen