Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het sorteerprotocol in het stamcelgebied te beantwoorden door een procedure te bieden voor het zuiveren van mesenchymale stamcellen rechtstreeks uit synoviaal vocht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een eenvoudig en economisch protocol hebben vastgesteld voor de isolatie en zuivering van MACS uit synoviaal vocht van konijnen. Over het algemeen in het onderzoek, vanwege deze methode, doen we grote inspanningen, omdat het zuiveren van celpopulaties afhankelijk is van het produceren van een enkele cel suspensie.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat alleen de methode voor magnetisch geactiveerde celsortering momenteel is goedgekeurd door de FDA voor klinische toepassingen. Begin deze procedure met dierdierverdoving zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de verzameling van gewrichtsynoviaal vocht uit de knie van het konijn uit te voeren, selecteert u een gebied van ongeveer vijf bij vijf centimeter groot rond de knie.

Scherp het konijnenhaar rond dit gebied af met een veiligheidsscheerapparaat. Of desinfecteer de procedureplaats met povidone jodiumoplossing en 75% ethanol driemaal. Breng vervolgens steriele drapen aan nadat het gebied volledig is opgedroogd.

Gebruik een steriele hypodermische spuit om een ​​tot twee milliliter isotone zoutoplossing in de knieholte te injecteren vanuit de laterale gewrichtsruimte. Beweeg het kniegewricht drie tot vier keer, en aspireer vervolgens alle synoviaal vocht bij kamertemperatuur. Filter het synoviaal vocht binnen vier uur door een 40 micron nylon celsifter om eventueel puin te verwijderen.

Om de konijnen SF-MSC's te kweken, verzamel het gefilterde vocht in 50 milliliter centrifugeerbuisjes en centrifugeer gedurende tien minuten bij 1.500 rpm bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant na de centrifugatie weg en was de pellet met PBS. Na het opnieuw suspenderen van de pellet met het volledige kweekmedium, plateer het medium in 100 milliliter schaaltjes.

Incubeer de schaaltjes bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Na 48 uur, vul de schaaltjes aan met vers medium om eventuele niet-aanhechtende cellen te verwijderen. Vervang het medium twee keer per week gedurende twee weken als passage nul.

Na 14 dagen na de eerste beplating, zouden er veel kolonies in de kweekschaaltjes moeten zijn gevormd. Selecteer de kolonies groter dan twee millimeter in diameter. Markeer waar de geselecteerde kolonies zich bevinden door hun omtrek op de bodem van het schaaltje te traceren.

Gooi de kolonies die minder dan twee millimeter breed zijn weg met celschrapers. Digest de geselecteerde kolonies met ongeveer vijf microliter 0,25% trypsine met behulp van een klooncylinder en breng de kolonies over naar een nieuw schaaltje voor passage. Wanneer de cellen ongeveer 80% confluency bereiken, aspireer het medium.

Voeg vervolgens een tot twee milliliter 0,25% trypsine EDTA toe aan elke schaal. Incubeer de schaaltjes gedurende twee tot drie minuten om celdetachering mogelijk te maken. Zodra de cellen zijn losgekomen, voeg een gelijke hoeveelheid kweekmedium toe om de trypsine te inactiveren.

Laat de celsuspensie door een 40 micron celsifter gaan en verzamel het filtraat in een 15 milliliter buisje. Draai vervolgens de cellen met 600 keer G gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer het celpellet in MACS Running Buffer.

Om magnetisch labelen uit te voeren, bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de celsuspensie gedurende tien minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius. Voeg na het volledig aspireren van de supernatant 80 microliter resuspendatiebuffer toe per tien miljoen totale cellen.

Voeg voor tien miljoen totale cellen 20 microliter microbeads toe, geconjugeerd met een monoklonaal anti-konijn CD90-antilichaam. Meng de magnetische kralen en cellen gelijkmatig in de buisjes. Bewaar ze vervolgens gedurende 15 minuten in het donker bij vier graden Celsius.

Voeg een milliliter buffer per tien miljoen cellen toe aan de buis en centrifugeer vervolgens gedurende tien minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius om de cellen te wassen. Gooi de supernatant na centrifugatie weg. Resuspendeer het pellet in 500 microliter buffer per tien miljoen cellen.

Plaats de kolom, met de kolomvleugels naar voren, in het magnetische veld van de magnetische separator. Spoel de magnetische separatorkolom af met 500 microliter van de buffer per tien miljoen cellen. Breng de enkele celsuspensie over in de kolom.

Laat de negatieve cellen door het magnetische veld gaan om deze ongelabelde cellen weg te gooien. Was de kolom een ​​tot twee keer met 500 microliter van de buffer per tien miljoen cellen en gooi de doorstroming weg. Breng de kolom over in een 15 milliliter centrifugeerbuisje.

Voeg een milliliter van de buffer per tien miljoen cellen toe aan de kolom. Druk vervolgens onmiddellijk de zuiger in de kolom om de magnetisch gelabelde cellen weg te spoelen. Herhaal de bovenstaande procedure met een tweede magnetische separatorkolom om de zuiverheid van CD90-positieve cellen te verhogen, die de geëluteerde fractie kan verrijken.

Na het centrifugeren van de celsuspensie gedurende tien minuten bij 300 keer G, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet met het kweekmedium. Inoculeer de cellen in 100 milliliter schaaltjes na de magnetisch geactiveerde celsortering. Incubeer de schaaltjes bij 37 graden Celsius in een bevochtigde celincubator met 5% koolstofdioxide.

Wanneer 80 tot 90% confluency van de primaire cultuur is bereikt, ongeveer zeven tot tien dagen, verteer de aangehechte cellen met 0,25% trypsine EDTA en voer ze over op een een tot twee verdunning om passage twee te maken. Gebruik dezelfde methode om de cellen door te geven naar passage drie, die kan worden gebruikt voor de in-vitro tests. Hier getoond, is de morfologie van de monolaag gekweekte konijnen SF-MSC