Name: Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Leer magnetisch-geactiveerde cel sorteren voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit konijnensynoviaalvloeistof. Deze eenvoudige methode verbetert de zuivering en biedt een kosteneffectief alternatief voor regeneratief geneeskundig onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd financieel ondersteund door de volgende subsidies: de Natural Science Foundation van China (nr. 81572198; Nr. 81772394); het Fonds voor hoog niveau medische Discipline bouw van Universiteit Shenzhen (nr. 2016031638); de medische Research Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. A2016314); en Shenzhen wetenschaps- en technologieprojecten (nr. JCYJ20170306092215436; Nr. JCYJ20170412150609690; Nr. JCYJ20170413161800287; Nr. SGLH20161209105517753; Nr. JCYJ20160301111338144).

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met inachtneming van de richtsnoeren inzake regionale ethische Commissie, en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Shenzhen tweede People's Hospital, Universiteit Shenzhen.
1. isoleren en cultuur van de rbSF-MSCs
<ol><li>
Voorbereidingen voor de dierlijke procedure
	<ol>
<li>Bereiden van vrouwelijke Nieuw-Zeeland schouderfunctie witte konijnen voor de inzameling van rbSF-MSCs. uitvoeren van een klinisch onderzoek van de konijnen een dag voorafgaand aan de narcose en arthrocentesis procedure. Opmerking: er zijn lichamelijke onderzoeken dient gewicht (2.0-2.5 kg), geslacht (vrouw), en lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag. Met de parameter intervallen voor klinisch gezonde konijnen zijn 30-50 min. voor ademhalingsfrequentie, 220-280 min voor hartslag en 38-39 ° C voor lichaamstemperatuur.</li>
		<li>Snel de dieren gedurende 6 uur voordat de verdoving.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereidingen en de procedure voor de dierlijke anesthesie
	<ol>
<li>Beperken van het konijn met een kooi (Zie Tabel of Materials), en dan 3% pentobarbital natrium te injecteren in de ader van de marginale oor bij een dosis van 1 mL/kg voor de narcose.</li>
		<li>Plaats het konijn in een comfortabele dorsal-lig positie.</li>
		<li>Het volgen van de ademhaling, hartslag en lichaamstemperatuur van het konijn tijdens anesthesie.</li>
		<li>Oogheelkundig zalf op zijn ogen gebruiken om te voorkomen dat droogte tijdens anesthesie.</li>
		<li>De diepte van de verdoving na Guedel de classificatie14te beoordelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding voor MSCs isolatie en teelt
	<ol>
<li>Voorbereiden om te cultiveren rbSF-MSCs, 500 mL commerciële kweekmedium (Zie Tabel van materialen) aangevuld met 10% commerciële aanvulling (Zie Tabel of Materials), 10% foetale runderserum (FBS), en 1% penicilline-streptomycine.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C in een waterbad voedingsbodem.</li>
		<li>500 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) voorbereiden van isolatie van de cel en de cel wassen.</li>
		<li>100 mL isotone zoutoplossing voorbereiden op de knie holte arthrocentesis procedure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collectie van articulaire synoviale omkaderd uid van de knie van het konijn
	<ol>
<li>Selecteer een gebied ongeveer 5 x 5 cm in omvang rond de knie en scheren van het haar konijn uit dit gebied met behulp van een elektrisch scheerapparaat van veiligheid.</li>
		<li>Afwisselend, Desinfecteer de procedure site 3 x met Povidon jodium oplossing en 75% ethanol. Vervolgens passen steriele gordijnen nadat het gebied grondig is opgedroogd.</li>
		<li>Injecteer 1-2 mL isotone zoutoplossing, met behulp van een steriele hypodermische spuit (2 mL), in de gezamenlijke holte van de knie van de laterale articulaire ruimte, bewegen van de knie 3-4 x, en vervolgens zuigen uit alle de synoviale vloeistof bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Filtreer de synoviale ﬂuid door een 40 µm nylon cel zeef te verwijderen elke puin binnen 4 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultuur van de rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Het verzamelen van de gefilterde ﬂuid in 50 mL centrifuge buizen en centrifugeer bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant na het centrifugeren, wassen van de pellet met PBS resuspendeer de pellet met het volledige kweekmedium en vervolgens plaat het medium in 100 mm gerechten.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2gerechten.</li>
		<li>Na 48u, vullen de gerechten met verse medium voor het verwijderen van niet-aanhanger cellen. Vervang het medium tweemaal per week voor 2 weken als passage 0 (P0). Opmerking: Er dient ongeveer 1 x 104 Adherente cellen. Levensvatbare cellen/ml in SF zijn ongeveer 2 x 102/mL.</li>
		<li>Na 14 dagen na het eerste laagje, moeten veel koloniën hebben gevormd in de cultuur-gerechten. Selecteer de kolonies die groter zijn dan 2 mm in diameter. Markeren waar de geselecteerde kolonies bevinden zich door het traceren van hun omtrek aan de onderkant van de schotel.</li>
		<li>Gooi de kolonies < 2 mm breed, met behulp van cel schrapers. De geselecteerde kolonies met ongeveer 5 µL van 0,25% trypsine, met behulp van een klonen cilinder, verteren en de koloniën overbrengen in een nieuwe schotel als passage 1 (P1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Post-operatieve dierenverzorgers
	<ol>
<li>Volg institutionele operationele standaardprocedures voor postoperatieve bewaking en herstel van anesthesie.</li>
		<li>Volgen de vitale tekenen van het konijn iedere 10 minuten totdat het bewustzijn heeft herwonnen. Daarna kopieert u het bewuste dier naar de kooi. Een konijn dat heeft ondergaan chirurgie aan het gezelschap van andere dieren tot het volledig is hersteld niet terugkeren.</li>
		<li>Na operatie, desinfecteren van de site met 0,1% Povidon jodium, 2 x per dag gedurende 3 dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90-positieve magnetische geactiveerd cel sorteren (MACS) van de rbSF-MSCs en primaire cultuur
<ol><li>
Bereiding van de monsters
	<ol>
<li>Wanneer de cellen bereiken rond 80% confluentie, gecombineerd het medium, en voeg vervolgens 1-2 mL van 0,25% trypsine-EDTA aan elk gerecht.</li>
		<li>Incubeer de gerechten voor 2-3 min om mobiele-detachement.</li>
		<li>Zodra de cellen worden losgemaakt, voeg een gelijke hoeveelheid van het kweekmedium aan de inactivering van de trypsine.</li>
		<li>De celsuspensie passeren een 40 µm cel zeef, Vang het filtraat op in een tube van 15 mL en draai vervolgens beneden de cellen bij 600 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in MACS met buffer (PBS, pH 7,2, 0,5% bovien serumalbumine en 2 mM EDTA) en dan het aantal cellen te tellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Magnetische etiketten Opmerking: Sorteren de rbSF-MSCs met een magnetische-geactiveerde cel Sorteren kit met kolommen, een stand, en scheidingstekens (Zie Tabel van materialen).<ol>
<li>Het nummer van de cel met behulp van een hemocytometer te bepalen.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Volledig gecombineerd het supernatant.</li>
		<li>Voeg 80 µL van resuspensie buffer per 107 totaal aantal cellen.</li>
		<li>Voor 107 totaal aantal cellen, Voeg 20 µL van microbeads geconjugeerd met een monoklonaal anti-konijn CD90 antilichaam.</li>
		<li>Meng de magnetische kralen en cellen gelijkmatig in de buizen, dan hen bij 4 ° C gedurende 15 min. in het donker uit te broeden.</li>
		<li>Voeg 1 mL buffer per 107 cellen aan de buis en het vervolgens Centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C te wassen van de cellen. Verwijder het supernatant na het centrifugeren.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 500 µL van buffer per 107 cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Magnetische scheiding
	<ol>
<li>De kolom met de vleugels van de kolom aan de voorzijde in het magnetisch veld van de Magneet separator plaatsen.</li>
		<li>Spoel de kolom magnetische scheidingsteken (MS) met 500 µL van de buffer per 107 cellen.</li>
		<li>Spoel de suspensie van één cel in de kolom. Laat de negatieve cellen passeren van het magnetisch veld te ontdoen van deze labelloze cellen.</li>
		<li>Was de kolom 1-2 x met 500 µL van de buffer per 107 cellen en gooi de doorstroming.</li>
		<li>Breng de kolom in een centrifugebuis (15 mL).</li>
		<li>1 mL van de buffer per 107 cellen toevoegen aan de kolom en vervolgens onmiddellijk duw de zuiger in de kolom te spoelen van de magnetisch gelabelde cellen.</li>
		<li>Herhaal de bovengenoemde procedure met een tweede MS-Column om de zuiverheid van CD90+ cellen, die de eluted fractie kunnen verrijken.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 10 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer het met het kweekmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultuur van de CD90+ rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Inoculeer cellen in 100 mm gerechten na het magnetische geactiveerde cel sorteren.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C in een broedstoof bevochtigde cel met 5% CO2gerechten.</li>
		<li>Wanneer de samenvloeiing van de 80-90% van de primaire cultuur wordt bereikt, op ongeveer 7-10 dagen, verteren de Adherente cellen met 0,25% trypsine-EDTA en passage hen bij een verdunning 1:2 te maken passage 2 (P2).</li>
		<li>Gebruik dezelfde methode om door te geven van de cellen aan de passage 3 (P3), die kunnen worden gebruikt voor het in vitro testen. Opmerking: Na de subcultuur en zuivering, ongeveer 1 x 107 rbSF-MSCs worden verkregen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. identificatie van rbSF-MSCs
<ol><li>
Oppervlakte marker bevestiging van de rbSF-MSCs door stroom cytometry
	<ol>
<li>Wanneer de MSCs 80-90% heuvels op P3, wassen van de cellen met PBS en behandelen met 0,25% 1 mL trypsine-EDTA. Vervolgens, Incubeer de MSCs bij 37 ° C gedurende 2-3 minuten totdat de cellen zijn vrijstaand.</li>
		<li>Oogsten van de cellen met behulp van 10 mL PBS, ze vervolgens overbrengen naar een conische buis (15 mL) en centrifugeer ze bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van PBS en breng dit in een 1,5 mL-buis.</li>
		<li>Incubeer een 1:100 verdunning van het FITC-geconjugeerd en PE-geconjugeerde antilichamen (isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugeer dit mengsel bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de cellen tweemaal met PBS door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten elke keer wassen. Gooi het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 500 µL van PBS, de celsuspensie overboeken naar een ronde-onderkant-buis (5 mL) en analyseren met behulp van een cytometer stroom. Opmerking: Verwerven gegevens over een cytometer uitgerust met twee kanalen van de fluorescentie: 533/30 en 585/40. Elke isotype fluorescentie, het besturingselement isotype kruisspanning passende laser, en stel de minimale intensiteit vereist voor het verkrijgen van een fluorescentie-histogram waarin zowel linker- en rechterrand van de piek. Verzamel minimaal 10.000 gebeurtenissen voor de statistische analyses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multidifferentiation van de rbSF-MSCs Opmerking: Gebruik P3 rbSF-MSCs voor de tests in vitro multidifferentiation.<ol>
<li>
Osteogenic differentiatie
		<ol>
<li>Bereiden van het medium osteogenic inductie: DMEM basic (1 x) met 50 mM van L-ascorbinezuur zuur-2-fosfaat, 10 mM van α-glycerophosphate en 100 nM van dexamethason.</li>
			<li>Zaad van de cellen op 103 cellen/cm2 in een 6-well weefselkweek plaat en cultuur hen in het medium osteogenic inductie.</li>
			<li>Wijzig het inductie-medium om de 3 dagen voor 3 weken.</li>
			<li>Herstellen van de cellen met de 4% formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, nadat de differentiatie is voltooid, de cellen vlek met 1% Alizarine rood voor 5 minuten, en daarna wassen ze 3 x met PBS15.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Adipogenic differentiatie
		<ol>
<li>Bereiden van het medium van de inductie adipogenic: DMEM basic (1 x), bestaande uit 100 mM indomethacin, 10 mg/mL recombinante menselijke insuline, 1 mM van dexamethason en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine.</li>
			<li>De P3 rbSF-MSCs voor 3 weken in het medium van de inductie adipogenic behandelen.</li>
			<li>Na 3 weken, vlek de neutrale lipide vacuolen olie Red O met de differentiatie van de adipogenic bevestigen. Bevestigen van de cellen in een 4% formaldehyde-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, en dan was ze 3 x met PBS16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Chondrogenic differentiatie
		<ol>
<li>Bereiden van het medium van de inductie chondrogenic: DMEM basic (1 x), bestaande uit de 10 ng/mL TGFβ1, 1% zijn supplement, L-proline, 100 nM van dexamethason, 50 mM van L-ascorbinezuur zuur-2-fosfaat, en 1 mM van natrium pyruvaat 0.35 mM.</li>
			<li>Gebruik pellet kweken voor de chondrogenic-inductie. Centrifugeer 5 × 105 P3 rbSF-MSCs bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten in een polypropyleen buis (15 mL) vormen een pellet.</li>
			<li>De pellets voor 3 weken met het medium van de inductie chondrogenic cultuur.</li>
			<li>Wijzig het medium om de 3 dagen voor 3 weken.</li>
			<li>Na 3 weken inductie, insluiten de cel pellet met paraffine, deel het in 4 mm plakjes en vlek met behulp van 0,1% toluïdine blauw gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur17.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Totaal RNA extractie en analyse door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR)
	<ol>
<li>Isolaat totaal RNA van cellen na 3 weken differentiatie inductie met behulp van de commerciële RNA extractie kit (Zie Tabel van materialen).<ol>
<li>Verwijder het kweekmedium in de cultuur-schotel en voeg vervolgens 1 mL van isolatie reagens.</li>
			<li>Lyse de cellen door herhaalde pipetteren totdat de oplossing is een homogeen. Na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.</li>
			<li>Breng de cel lysate in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.</li>
			<li>Voeg 100 µL van chloroform, schud het met de hand 15 x en Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.</li>
			<li>Centrifugeer de buis bij 12.000 × g gedurende 15 min bij 4 ° C. Breng het supernatant in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
			<li>Voeg 500 µL van isopropanol en neerslag van het RNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Centrifuge op 12.000 × g voor 10 minat 4 ° C. De RNA-pellet moet worden weergegeven aan de onderkant van de buis.</li>
			<li>Verwijder het supernatant en voeg vervolgens 500 µL van 75% ethanol. Kort draaien de buis gedurende enkele seconden om te wassen van de RNA-pellet. Centrifugeer het bij 7.500 × g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
			<li>Verwijder de resterende ethanol.</li>
			<li>Los van de RNA-pellet in 10 µL van DEPC water en plaats de buizen op ijs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Omgekeerde transcriberen totaal RNA in cDNA met een DNA-herstelsynthese kit (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Alle de volgende procedures uitvoeren op ijs.<ol>
<li>De master mix van omgekeerde transcriptie voor te bereiden.</li>
			<li>Voeg 25 µL van RNA DNase behandeld aan elke buis met 1 microgram van RNA.</li>
			<li>Incubeer het mengsel bij de volgende temperaturen met behulp van een PCR thermische cycler: 26 ° C gedurende 10 min (voor de willekeurige hexamers te gloeien), 42 ° C voor 45 min (reverse transcriptie) en 75 ° C gedurende 10 minuten (aan de inactivering van de reverse-transcriptase).</li>
			<li>Onmiddellijk de resulterende cDNA door kwantitatieve PCR in real time analyseren of opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het gen expressie analyses uitvoeren met een kwantitatieve real-time PCR-systeem.<ol>
<li>QRT-PCR Master Mix gebruiken (Zie Tabel of Materials) voor het uitvoeren van PCR. De PCR inleidingen voor de GAPDH, Runx2, Agg en PPARγ zijn vermeld in tabel 1.</li>
			<li>Bereken met behulp van de methode van deΔΔCT 2−genexpressie.</li>
			<li>Voeren een statistische analyse met behulp van statistische standaardsoftware. Gebruik een onafhankelijke sample t-test te vergelijken van de groep betekent.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+lineage%2C+plasticity%2C+and+skeletal+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential.</a> Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+are+multipotential+stem+cells+that+exhibit+myogenic%2C+osteogenic%2C+and+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation.</a> Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).</li>
<li>De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stem+cells+from+adult+human+synovial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane.</a> Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).</li>
<li>McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+phenotypic+characterization+of+synovial+fluid+multipotential+mesenchymal+progenitor+cells+in+inflammatory+and+degenerative+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis.</a> Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+synovial+fluid+by+magnetic+activated+cell+sorting+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS).</a> Cell Biology International. , (2017).</li>
<li>Bashir, M., et al. <a target="_blank" href="http://scialert.net/abstract/?doi=ajava.2015.537.548">Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow.</a> Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+rabbit+CD90-positive+cells+sorted+from+adipose-derived+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 53 (1), 1-6 (2016).</li>
<li>Lee, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+surface+markers+between+human+and+rabbit+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells.</a> PLOS One. 9 (11), e111390(2014).</li>
<li>Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Phenotypic-characterization-of-equine-synovial-flu-Chen-Bianchessi/990df987cfdd18373c10bd99de90bd5824e807f4">Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells.</a> Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).</li>
<li>Prado, A. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+the+equine+synovial+fluid+and+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane.</a> BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281(2015).</li>
<li>Yoshimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+rat+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+synovium%2C+periosteum%2C+adipose+tissue%2C+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle.</a> Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).</li>
<li>Wu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+injection+of+platelet-rich+fibrin+releasates+in+combination+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+treatment+of+articular+cartilage+defects%3A+an+in+vivo+study+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).</li>
<li>John, T., Lerche, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohn%2C+T+%22Anesthesia+and+Analgesia+for+Veterinary+Technicians%22">Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians</a>. , Mosby Elsevier. St. Louis, Missouri. (2011).</li>
<li>Koyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+cells+derived+from+synovial+fluid+in+patients+with+temporomandibular+joint+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder.</a> Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+synovial+fluid+in+patients+with+osteochondral+lesion+of+the+talus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus.</a> American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).</li>
<li>Vereb, Z., et al. <a target="_blank" href="http://ard.bmj.com/content/74/Suppl_2/908.2">Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).</li>
<li>Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+after+meniscus+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+%26+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury.</a> Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).</li>
<li>Morito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+increase+after+intra-articular+ligament+injury+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans.</a> Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).</li>
<li>Hegewald, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+autologous+synovial+fluid+induce+chondrogenic+differentiation+of+equine+mesenchymal+stem+cells%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study.</a> Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).</li>
<li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+mesenchymal+stem+cells+in+health+and+early+osteoarthritis%3A+detection+and+functional+evaluation+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level.</a> Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).</li>
<li>Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+activated+cell+sorting+%28MACS%29%3A+utility+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction.</a> Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).</li>
<li>Schmitz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+activated+cell+sorting+%28MACS%29+%E2%80%94+a+new+immunomagnetic+method+for+megakaryocytic+cell+isolation%3A+comparison+of+different+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques.</a> European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).</li>
<li>Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+stem+cell+isolation+and+delivery%3A+current+need+for+drug+discovery+and+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy.</a> Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).</li>
<li>Gronthos, S., Zannettino, A. C. W. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGronthos%2C+S+%22Mesenchymal+Stem+Cells%22">Mesenchymal Stem Cells</a>. Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. , Vol. 449 of Methods in Molecular Biology 45-57 (2008).</li>
<li>Krawetz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+progenitors+expressing+CD90%2B+from+normal+but+not+osteoarthritic+joints+undergo+chondrogenic+differentiation+without+micro-mass+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture.</a> PLOS One. 7 (8), e43616(2012).</li>
<li>Ogata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+human+synovium+mesenchymal+stem+cells+as+a+good+resource+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration.</a> PLOS One. 10 (6), e0129096(2015).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells%3A+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Gauci, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+chondrocyte+hypertrophy+in+growth+plate+and+osteoarthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+%26+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage.</a> Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308(2008).</li>
<li>Cooke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+three-dimensional+co-culture+of+mesenchymal+stem+cells+with+chondrocytes+promotes+chondrogenic+differentiation+without+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).</li>
<li>Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+articular+chondrocytes+secrete+parathyroid+hormone-related+protein+and+inhibit+hypertrophy+of+mesenchymal+stem+cells+in+coculture+during+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het bestaan van MSCs in gewrichtsvocht biedt een alternatief voor cel-gebaseerde therapie. Eerdere studies hebben aangetoond dat letsel sites bevatten hogere hoeveelheden mesenchymale stamcellen in hun gewrichtsvocht, die positief kunnen worden gecorreleerd met de periode van na letsel5. De MSCs in gewrichtsvocht kunnen zinvol zijn om weefsel voor het verbeteren van de spontane genezing na een letsel18,19. De klinische toepassing van SF-MS...

MSCs hebben gesuggereerd als een waardevolle bron voor regeneratieve geneeskunde, vooral voor kraakbeen letsels. MSCs, met inbegrip van de chondrocyten, botcellen, adipocytes, skelet myocytes en viscerale stromale cellen, expand in grote lijnen de gebieden voor stamceltransplantatie vanwege hun hoge uitbreiding tarief en multi lineage differentiatie potentiële1. MSCs kunnen worden geïsoleerd uit de skeletal muscle, synovia, beenmerg en adipeus weefsel2,3,4. Bevindingen hebben ook conﬁrmed de aanwezigheid van MSCs in het gewrichtsvocht, en vorige onderzoek synoviale vloeistof afkomstige MSCs (SF-MSCs) heeft geïdentificeerd als veelbelovende kandidaten voor articulair regeneratie5,6.
Onderzoek en preklinische experimenten met menselijke specimens zijn echter onderworpen aan veel ethische kwesties. In plaats daarvan, konijnen geweest en blijven de meest gebruikte diersoorten om aan te tonen dat de transplantatie van MSCs kraakbeenletsels kan repareren. In de afgelopen jaren een stijgend aantal onderzoekers hebben bestudeerd konijn mesenchymale stamcellen (rbMSCs) beide in vitro en in vivo, als deze cellen zijn vergelijkbaar met menselijke MSCs in hun cellulaire biologie en weefsel fysiologie. Ook zijn de rbMSCs geschikt voor het vasthouden aan kunststofoppervlakken, spindel-fibroblast morfologie in menselijke MSCs weergeven. Bovendien, konijn mesenchymale monsters zijn eenvoudig en gemakkelijk te verkrijgen van7. Bovendien, zijn de meest cruciale punten dat rbMSCs express oppervlakte markers, zoals CD44, CD90 en CD105, en dat de potentiële multi lineage-differentiatie is bewaard gebleven, die is in overeenstemming met de criteria voor de identificatie van MSC populaties als gedefinieerd door de International Society for cellulaire therapie8,9. In het bijzonder de synoviale vloeistof chondroprogenitors staat niet-hypertrofische chondrogenesis wanneer geïnduceerd door TGF-β1, waardoor ze geschikt mobiele bronnen voor fenotypische articulair kraakbeen regeneratie10,11, zijn 12.
Het isolement van de SF-MSCs verschilt echter sterk van andere weefsels, met inbegrip van de navelstreng, adipeus weefsel, perifeer bloed en beenmerg. Momenteel zijn de meest voorkomende benaderingen voor de zuivering en sortering van SF-MSCs stroom cytometry en immunomagnetic kraal gebaseerde sorteren, hoewel de stroom cytometry methode een specifieke omgeving en zeer dure instrumenten13 vereist.
Dit artikel presenteert een procedure voor het eenvoudig en minimaal invasieve collectie van monsters van synoviale vloeistof uit Nieuw-Zeeland witte konijnen. Tijdens de procedure, de rbSF-MSCs zijn stabiel uitgevouwen in vitro en vervolgens geïsoleerd met CD90 positieve magnetische kraal gebaseerde procedures. Tot slot, het protocol laat zien hoe MSCs met een hoge zuiverheid en de levensvatbaarheid van de geoogste cel bronnen verkrijgen.
In dit protocol worden de geïsoleerde rbSF-MSCs gekenmerkt op basis van hun morfologie, de expressie van specifieke markers en pluripotent voor stamcellen. Stroom cytometry gebaseerde immunophenotyping blijkt een aanzienlijke positieve uitdrukking van CD44 en CD105, overwegende dat de uitdrukking van CD45 en de CD34 negatief is. Tot slot, een in vitro assay voor rbSF-MSCs toont de differentiatie van het osteogenic, adipogenic en chondrogenic van deze cellen.

<table><tbody><tr><td>Reagenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Warm in 37 &deg;C water bad voor gebruik</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Component van MSCs kweekmedium</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSCs differentiatiemedium</td></tr><tr><td>Isotone zoutoplossing</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>Reagens voor gewrichtspuncieproceduur</td></tr><tr><td>Fosfaat-bufferoplossing (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, vrij van Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Foetale boviene serum (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Component van MSCs kweekmedium</td></tr><tr><td>Povidonjooplossing</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>Sterilisatiemiddel</td></tr><tr><td>75% ethanol</td><td>Lircon, China</td><td>170917</td><td>Sterilisatiemiddel</td></tr><tr><td>0,25% Trypsine/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Celdissociatiereagens</td></tr><tr><td>1% Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Component van MSCs medium</td></tr><tr><td>MACS Running Buffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Bevat fosfaat-bufferoplossing (PBS), 0,5% bovien serumalbumine(BSA), en 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>CD90 antilichaam geconjugeerd MicroBeads</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>Voor magnetisch geactiveerde celsortering</td></tr><tr><td>Natriumpyrovaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Component van MSCs chondrogene differentiatie</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Component van MSCs osteogene differentiatie</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Component van MSCs chondrogene differentiatie</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0,35 mM, Component van MSCs chondrogene differentiatie</td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur-2-fosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Component van MSCs chondrogene differentiatie</td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0,5 mM, Component van adipogene differentiatie</td></tr><tr><td>Indomethacine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Component van adipogene differentiatie</td></tr><tr><td>TGF&beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Component van MSCs chondrogene differentiatie</td></tr><tr><td>&alpha;-glycerofosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Component van MSCs osteogene differentiatie</td></tr><tr><td>CD34 Polyklonaal Antilichaam, FITC Geconjugeerd</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>Hematopoietische stamcelmarker</td></tr><tr><td>Muis anti-konijn CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 membraan glycoproteïne (MSCs marker)</td></tr><tr><td>CD45 (Monoklonaal Antilichaam)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Hematopoietische stamcelmarker</td></tr><tr><td>CD105 antilichaam</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSCs marker</td></tr><tr><td>Isopropylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Precipiteert RNA extractie organische fasen</td></tr><tr><td>Trichloormethaen</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>Extract totaal RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isoleer totaal RNA</td></tr><tr><td>SYBR green mastermix</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR420A</td><td>PCR test</td></tr><tr><td>cDNA synthesekit</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR047A</td><td>Omgekeerd getranskribeerd naar complementair DNA</td></tr><tr><td>Alizarine Rood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Kleuring van calciumverbindingen</td></tr><tr><td>Toluidine Blauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Kleuring van kraakbeenweefsel</td></tr><tr><td>Oil Red O oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Lipide vacuole kleuring</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>Voor magnetisch geactiveerde celsortering</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>Voor magnetisch geactiveerde celsortering</td></tr><tr><td>MS Kolommen</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>Voor magnetisch geactiveerde celsortering</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &mu;m nylon</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Celtelling</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm schaal</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Celcultuurschaal</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA Extractie en PCR</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Gamma-gesteriliseerd</td></tr><tr><td>Hoge-snelheidscentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Centrifugeer cellen</td></tr><tr><td>Kooldioxide celincubator</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Instrument</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>Real-Time kwantitatieve polymerasekettingreactie</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Celanalyzer</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transfer de vloeistof</td></tr><tr><td>Kloon cilinder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isoleer en kies individuele celkolonies</td></tr><tr><td>Steriele hypodermische spuit</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>Artrocentese procedure</td></tr><tr><td>Konijnenkooi</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Houd het konijn vast</td></tr></tbody></table>

magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het model van een konijn

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn de bron van de belangrijkste cel voor cel-gebaseerde therapie. MSCs van articulaire holte gewrichtsvocht zou kunnen worden gebruikt voor weefselengineering van kraakbeen. MSCs van gewrichtsvocht (SF-MSCs) zijn veelbelovende kandidaten voor articulair regeneratie beschouwd heeft, en hun potentiële therapeutische voordeel hen een belangrijk onderzoeksonderwerp van laat. SF-MSCs uit de holte van de knie van het Nieuw-Zeeland wit konijn kunnen worden ingezet als een geoptimaliseerde translationeel model te beoordelen van menselijke regeneratieve geneeskunde. Door middel van CD90 gebaseerde magnetische geactiveerde cel sorteren (MACS) technologieën, dit protocol met succes verkrijgt konijn SF-MSCs (rbSF-MSCs) van dit model konijn en volledig toont verder het fenotype van de MSC van deze cellen door het inducerende hen om te differentiëren naar Botcellen, adipocytes en chondrocyten. Daarom kan deze aanpak worden toegepast in het onderzoek van de biologie van de cel- en weefseltechnologie met behulp van eenvoudige apparatuur en procedures.

Isolatie, zuivering en cultuur van de rbSF-MSCs: Dit protocol maakt gebruik van MACS te isoleren rbSF-MSCs, gebaseerd op de expressie van de MSC oppervlakte markering CD90. Een processtroomdiagram rbSF-MSCs isolatie, zuivering, karakterisering en het in vitro cultuur protocol is afgebeeld in Figuur 1.
De morfologie van de cel na magnetische geactiveerde cel sorte...

Dit artikel presenteert een eenvoudige en economische protocol voor het eenvoudig isolatie en zuivering van mesenchymale stamcellen uit Nieuw-Zeeland wit konijn gewrichtsvocht.

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het sorteerprotocol in het stamcelgebied te beantwoorden door een procedure te bieden voor het zuiveren van mesenchymale stamcellen rechtstreeks uit synoviaal vocht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een eenvoudig en economisch protocol hebben vastgesteld voor de isolatie en zuivering van MACS uit synoviaal vocht van konijnen. Over het algemeen in het onderzoek, vanwege deze methode, doen we grote inspanningen, omdat het zuiveren van celpopulaties afhankelijk is van het produceren van een enkele cel suspensie.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat alleen de methode voor magnetisch geactiveerde celsortering momenteel is goedgekeurd door de FDA voor klinische toepassingen. Begin deze procedure met dierdierverdoving zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de verzameling van gewrichtsynoviaal vocht uit de knie van het konijn uit te voeren, selecteert u een gebied van ongeveer vijf bij vijf centimeter groot rond de knie.Scherp het konijnenhaar rond dit gebied af met een veiligheidsscheerapparaat. Of desinfecteer de procedureplaats met povidone jodiumoplossing en 75% ethanol driemaal. Breng vervolgens steriele drapen aan nadat het gebied volledig is opgedroogd.Gebruik een steriele hypodermische spuit om een ​​tot twee milliliter isotone zoutoplossing in de knieholte te injecteren vanuit de laterale gewrichtsruimte. Beweeg het kniegewricht drie tot vier keer, en aspireer vervolgens alle synoviaal vocht bij kamertemperatuur. Filter het synoviaal vocht binnen vier uur door een 40 micron nylon celsifter om eventueel puin te verwijderen.Om de konijnen SF-MSC's te kweken, verzamel het gefilterde vocht in 50 milliliter centrifugeerbuisjes en centrifugeer gedurende tien minuten bij 1.500 rpm bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant na de centrifugatie weg en was de pellet met PBS. Na het opnieuw suspenderen van de pellet met het volledige kweekmedium, plateer het medium in 100 milliliter schaaltjes.Incubeer de schaaltjes bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Na 48 uur, vul de schaaltjes aan met vers medium om eventuele niet-aanhechtende cellen te verwijderen. Vervang het medium twee keer per week gedurende twee weken als passage nul.Na 14 dagen na de eerste beplating, zouden er veel kolonies in de kweekschaaltjes moeten zijn gevormd. Selecteer de kolonies groter dan twee millimeter in diameter. Markeer waar de geselecteerde kolonies zich bevinden door hun omtrek op de bodem van het schaaltje te traceren.Gooi de kolonies die minder dan twee millimeter breed zijn weg met celschrapers. Digest de geselecteerde kolonies met ongeveer vijf microliter 0,25% trypsine met behulp van een klooncylinder en breng de kolonies over naar een nieuw schaaltje voor passage. Wanneer de cellen ongeveer 80% confluency bereiken, aspireer het medium.Voeg vervolgens een tot twee milliliter 0,25% trypsine EDTA toe aan elke schaal. Incubeer de schaaltjes gedurende twee tot drie minuten om celdetachering mogelijk te maken. Zodra de cellen zijn losgekomen, voeg een gelijke hoeveelheid kweekmedium toe om de trypsine te inactiveren.Laat de celsuspensie door een 40 micron celsifter gaan en verzamel het filtraat in een 15 milliliter buisje. Draai vervolgens de cellen met 600 keer G gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer het celpellet in MACS Running Buffer.Om magnetisch labelen uit te voeren, bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de celsuspensie gedurende tien minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius. Voeg na het volledig aspireren van de supernatant 80 microliter resuspendatiebuffer toe per tien miljoen totale cellen.Voeg voor tien miljoen totale cellen 20 microliter microbeads toe, geconjugeerd met een monoklonaal anti-konijn CD90-antilichaam. Meng de magnetische kralen en cellen gelijkmatig in de buisjes. Bewaar ze vervolgens gedurende 15 minuten in het donker bij vier graden Celsius.Voeg een milliliter buffer per tien miljoen cellen toe aan de buis en centrifugeer vervolgens gedurende tien minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius om de cellen te wassen. Gooi de supernatant na centrifugatie weg. Resuspendeer het pellet in 500 microliter buffer per tien miljoen cellen.Plaats de kolom, met de kolomvleugels naar voren, in het magnetische veld van de magnetische separator. Spoel de magnetische separatorkolom af met 500 microliter van de buffer per tien miljoen cellen. Breng de enkele celsuspensie over in de kolom.Laat de negatieve cellen door het magnetische veld gaan om deze ongelabelde cellen weg te gooien. Was de kolom een ​​tot twee keer met 500 microliter van de buffer per tien miljoen cellen en gooi de doorstroming weg. Breng de kolom over in een 15 milliliter centrifugeerbuisje.Voeg een milliliter van de buffer per tien miljoen cellen toe aan de kolom. Druk vervolgens onmiddellijk de zuiger in de kolom om de magnetisch gelabelde cellen weg te spoelen. Herhaal de bovenstaande procedure met een tweede magnetische separatorkolom om de zuiverheid van CD90-positieve cellen te verhogen, die de geëluteerde fractie kan verrijken.Na het centrifugeren van de celsuspensie gedurende tien minuten bij 300 keer G, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet met het kweekmedium. Inoculeer de cellen in 100 milliliter schaaltjes na de magnetisch geactiveerde celsortering. Incubeer de schaaltjes bij 37 graden Celsius in een bevochtigde celincubator met 5% koolstofdioxide.Wanneer 80 tot 90% confluency van de primaire cultuur is bereikt, ongeveer zeven tot tien dagen, verteer de aangehechte cellen met 0,25% trypsine EDTA en voer ze over op een een tot twee verdunning om passage twee te maken. Gebruik dezelfde methode om de cellen door te geven naar passage drie, die kan worden gebruikt voor de in-vitro tests. Hier getoond, is de morfologie van de monolaag gekweekte konijnen SF-MSC

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.

Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC&#39;s

Een experimentele techniek voor de behandeling van osteochondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in osteochondrale defecten heeft een veelbelovende ontwikkeling op het gebied van weefsel engineering. De voorbereiding van...

Behandeling van Osteochondrale Defecten in de Rabbit&#39;s kniegewricht door Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 + magnetische bead selectie.

Isolatie van CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen

We presenteren de technieken die nodig zijn om de stromale vasculaire fractie (SVF) te isoleren uit de inguinale (subcutane) en perigonale (viscerale) vetweefsel depots van muizen om hun genexpressie en collagenolytische activiteit te beoordelen. Deze methode omvat de verrijking van Sca1high vet-afgeleide stamcellen (ASCs) met behulp van immunomagnetische celscheiding.

Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup&gt; hoog</sup&gt;-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)

Een protocol dat mesenchymale stamcellen (MSC's) vaststelt die geïsoleerd zijn uit de synoviale vloeistof en het beenmerg van minivarkens en op niet-invasieve wijze verzameld worden met behulp van het afzuigapparaat van een spuit, wordt gepresenteerd. Cellulair fenotypen werd uitgevoerd met behulp van flowcytometrie na celisolatie en in vitro cultivatie van beenmerg en synoviale vloeistoffen afgeleid van MSC's.

Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.

Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

De huidige studie biedt een aangepast protocol om synoviale macrofagen en fibroblasten te isoleren uit murine inflammatoire artritisweefsel.

Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

Mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van de kaak hebben belangrijke functies bij diverse differentiatie, zelfvernieuwing en immuunmodulatie. Ze zijn naar voren gekomen als een cruciaal reservoir van voorlopercellen in gentherapie, weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een unieke methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen van kaakbeenmerg bij ratten.

Techniek voor isolatie en kweek van mesenchymale stamcellen van rattenkaakbeenmerg

Dit protocol beschrijft een magnetische kralen-gebaseerde sorteermethode waarbij fycoerythrine (PE)-gelabelde flowcytometrie-antilichamen en anti-PE-microkorrels worden gebruikt om specifieke mesenchymale stamcelsubpopulaties met hoge postsort-doelmarkerpositiviteit en geconserveerde CCK-8-gebaseerde proliferatie/metabole activiteit onder de geteste omstandigheden te isoleren, zonder dure celsorteerders of doelspecifieke op maat gemaakte kralen te vereisen.

Isolatie en validatie van Podoplanine-positieve mesenchymale stamcelsubpopulaties met behulp van een indirecte magnetische kraalstrategie

Leer magnetisch-geactiveerde cel sorteren voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit konijnensynoviaalvloeistof. Deze eenvoudige methode verbetert de zuivering en biedt een kosteneffectief alternatief voor regeneratief geneeskundig onderzoek.

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn (Video) | JoVE Journal

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Meer video's verkennen