Name: Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor exosoomisolatie uit menselijk bloedplasma en serum met behulp van eiwitvertering, ultrafiltratie en size exclusion chromatografie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van downstream analyses en biomarkerontdekking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de interne middelen van CSU (aan KMD), ATCC contract #2016-0550-0002 (een toeleveringscontract van NIAID HHSN272201600013C), en de Bill en Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (tot KMD/NKG). Wij danken de NSF onderzoekervaring voor studenten (REU) zomerprogramma bij Colorado State University voor aanvullende ondersteuning.

Dit werk werd vastgesteld niet menselijke onderwerp onderzoek op de initiële beoordeling van Colorado State University's institutionele Review Board (IRB), als alle menselijke specimens werden verkregen als de geïdentificeerde monsters uit de biorepository van de Bioreclamation IVT en waren verzameld onder de IRB goedgekeurde protocollen.
1. bereiding van ruwe monster (Plasma of Serum) door grotere blaasjes pillering en cellulaire puin
Opmerking: Veiligheid van de behandeling: serum, plasma en andere biologische vloeistoffen zijn biohazardous materialen en moeten worden behandeld met speciale zorg, terwijl het dragen van fundamentele persoonlijke beschermende uitrusting, zoals handschoenen en laboratoriumjas. Het is sterk aanbevolen dat biologische monsters worden verwerkt in een bioveiligheid kabinet; Als dat niet beschikbaar is, het gebruik van oogbescherming wordt aanbevolen.
<ol><li>Een serum of een plasma monster equilibreer door het plaatsen van de buis onder omstandigheden niet schudden in een koelkast 4 ° C's nachts (van beide -20 of opslag-80 ° C).</li>
	<li>Aliquot 250 µL van het monster in de buis van een microcentrifuge met behulp van een precisiepipet 1.000 µL.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Met behulp van een pipet 200 µL, 200 µL van het supernatans dat gewiste verwijderen en toevoegen aan een nieuwe microcentrifuge buis. Vermijd Ingehuld materiaal tijdens het overzetten van de bovendrijvende substantie. Gooi het Ingehuld materiaal.</li>
	<li>Het kwantificeren van het eiwitgehalte van het monster door bicinchoninic zuur (BCA) assay, met behulp van de fabrikant-protocol. Voor het uitvoeren van de bepaling, Verdun de monster 1:50 in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Test elk monster in tweevoud. Opmerking: Gebruik 1 x PBS in het gehele protocol, tenzij anders vermeld. 200 µL van geklaarde serum of plasma (na 18.000 x g) levert gemiddeld 15 mg van totale proteïne. Andere types van het monster, met hoger of lager eiwitgehalte, wellicht extra BCA verdunningen.</li>
	<li>Aliquot 10 mg van het monster af in een nieuwe microcentrifuge buis. Gebruik de concentratie in stap 1.5 verkregen voor het berekenen van de corresponderende hoeveelheid van het monster. Aliquot het monster met behulp van een precisiepipet 200 µL. Opmerking: Het is raadzaam om op te slaan van het resterende monster bij-80 ° C. Aliquot het monster in verschillende buisjes met 10 mg per buis om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli in de toekomst gebruiken.</li>
</ol>2. de vertering van niet-exosomal bloedeiwitten
Opmerking: De spijsvertering stap is ontworpen voor het verminderen van de niet-exosomal-eiwitten die samen met de exosomes kunnen zuiveren. Als behoud van exosome oppervlakte-eiwitten vereist voor downstream analyses is, moet het worden rekening gehouden met die deze stap het potentieel heeft om het verstoren van deze analyse. De detectie van de exosomal CD63, een oppervlak-blootgesteld tetraspanin eiwit, was niet significant negatief beïnvloed door dit proces.
<ol><li>Bereid proteïnase K-oplossing bij een concentratie van 500 µg/mL in PBS. Voeg de overeenkomstige hoeveelheid proteïnase K in een conische buis. Voeg vervolgens de buffer en de vortex voor 30 s, 3 x bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 50 µL van proteïnase K-oplossing aan het 10-mg monster aliquoot en meng zachtjes door pipetteren op en neer met behulp van een precisiepipet µL 200.</li>
	<li>Incubeer het monster bij 37 ° C in een waterbad voor 30 min. plaats de buis in een float buis rek en volledige onderdompeling van buis in het waterbad om eventuele lekkage te voorkomen.</li>
	<li>Overbrengen van het monster en zwevende buis rack een bad met water van 60 ° C gedurende 10 minuten, om de inactivering van het proteïnase K.</li>
</ol>3. verwijdering van kleine proteïnen en Peptides door Centrifuge ultrafiltratie
<ol><li>Een apparaat van de ultrafiltratie met 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) filter met PBS vóór gebruik spoelen. Hiervoor 500 µL van PBS toe te voegen aan het filter, met behulp van een precisiepipet 1.000 µL. Draai het apparaat op 3700 x g voor 5 min. Discard eventuele resterende retentate evenals het eluaat. Opmerking: De capaciteit van het volume van het monster van de ultrafiltratie apparaat moet 0,5 mL - 4 mL om ervoor te zorgen dat het volume van de uiteindelijke gereduceerde monster van 50 µL haalbaar is.</li>
	<li>Neem het voorbeeld uit stap 2.4 en verhoog het volume aan 500 µL door PBS toe te voegen. Pipetteer het monster in het vooraf gespoeld ultrafiltratie apparaat. Opmerking: Gemiddeld is het monstervolume uit stap 2.4 185 µL (120 tot 150 µL van monster en 50 µL van proteïnase K-oplossing).</li>
	<li>Plaats het ultrafiltratie apparaat in een vaste hoek benchtop centrifuge bij 3700 x g bij 4 ° C, totdat het monster heeft een volume van 50 µL verminderen. Let op: Bij het gebruik van ultrafiltratie apparaten met dode stop volume, moet worden gezorgd om te voorkomen dat volledige droogheid van het membraan filter tijdens centrifugeren stappen.</li>
	<li>Voeg 500 µL van PBS rechtstreeks in de filter membraan en Pipetteer op en neer 5 keer. Centrifugeer zoals in stap 3.3. Voer deze stap was een totaal 3 keer.</li>
	<li>Overdracht van de laatste 50 µL retentate in een nieuwe microcentrifuge buis.</li>
	<li>Spoel het membraan filter met 200 µL PBS, pipetting op en neer 10 keer, en het wassen aan de buis van stap 3.5 overbrengen.</li>
	<li>Plaats de filterhouder in de omgekeerde positie in een nieuwe buis. Een omgekeerde spin herstel voor 5 min op 2.000 x g resterende monster ophalen uit het membraan uitvoeren. Het zwembad van het monster met het monster uit stap 3.5.</li>
</ol>4. zuivering van blaasjes by Size Exclusion Chromatography (SEC)
<ol><li>Voeg 850 µL van SEC drijfmest, met kralen met een MWCO van 700 kDa, in een lege, afgetopte zwaartekracht stroom kolom met behulp van een precisiepipet 1.000 µL. Plaats de kolommen in een formaat geschikt rek is voorzien van een lekbak.</li>
	<li>Open de onderkant van de kolom en laat de vloeistof afvoer voor 5 min. Zodra uitgedropen, voeg toe 10 mL PBS te wassen de hars. 20 min voor het wassen voor de afvoer van de kolom toestaan.</li>
	<li>Plaats de geconcentreerde, proteïnase K behandeld monster uit stap 3.5 in een conische buis 15 mL, en verhoog het monstervolume tot 5 mL PBS toe te voegen met een serologische pipet. Mengen van de tube zachtjes door rocken voor 1 min en vervolgens langzaam het toepassen van het monster op de kolom die in stap 4.2 met een serologische pipet voorbereid. Opmerking: Zodra het GLB van de kolom wordt verwijderd, zal het monster stromen door de hars door de zwaartekracht; het 5-mL monster zal volledig doorstromen van de kolom in 10 min.</li>
	<li>Het verzamelen van de stroom door middel van een nieuwe conische tube van 15 mL.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, toepassing het verzamelde materiaal op het hars opnieuw te verwijderen van alle resterende materiaal onder 700 kDa.</li>
	<li>Het verzamelen van de stroom door middel van een nieuwe conische tube van 15 mL. Wassen van de hars tweemaal de toevoeging van 1 mL PBS. Verzamelen van de stroom door in de buis uit stap 4,5; de totale eindvolume zullen ongeveer 7 mL. Opmerking: Na stap 4.6, zal het monster worden verdund ongeveer 35 keer van het oorspronkelijke monstervolume; de volgende stappen zal het volume te verlagen en concentreren van het gezuiverde exosome monster.</li>
</ol>5. de concentratie van het gezuiverde Exosomes en totale proteïne kwantificering
<ol><li>Spoel een ultrafiltratie apparaat met een 3 kDa MWCO filter met PBS vóór gebruik, zoals beschreven in stap 3.1.</li>
	<li>In het voorbeeld uit stap 4.6 toevoegen aan de ultrafiltratie apparaat en centrifuge in een swingende-emmer rotor bij 3700 x g bij 4 ° C. Buffer zal het filter passeren en kan worden verwijderd. Geconcentreerd exosomes bewaard boven het filter. Centrifugeer het monster totdat het volume boven het filter (retentate) is teruggebracht tot 200 µL.</li>
	<li>De retentate overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis.</li>
	<li>Spoel het membraan filter met 200 µL PBS door pipetteren over het membraan 10 keer en het wassen te brengen naar de buis vanaf stap 5.3. Dit zal zorgen voor de verzameling van alle resterende exosome monster.</li>
	<li>Brengen monstervolume tot 500 µL door PBS toe te voegen. Meng door langzaam pipetteren op en neer 10 keer. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Monsters moeten worden bewaard bij 4 ° C's nachts of bij-20 /-80 ° C voor lange termijn opslag.</li>
	<li>Het kwantificeren van het eiwitgehalte van het monster door BCA assay, met behulp van de fabrikant-protocol. Verdun de monster 1:10 en 1:50 in PBS. Elk monster in duplo worden uitgevoerd. Opmerking: Beginnen met 10 mg van totale proteïne van serum of plasma, is het rendement van de totale proteïne in gezuiverde exosomes uit stap 5.6, gemiddeld 150 µg. extra verdunningen kunnen nodig zijn als de andere monsters dan serum of plasma worden gebruikt; opbrengst kan variëren met monster type.</li>
</ol>6. kwantificering en dimensionering van Exosomes door Nanoparticle analyse (NTA) bijhouden
<ol><li>Meng 5 µg gezuiverde exosomes (zoals gekwantificeerd in 5.6) 1 mL PBS en vortex voor 15 s op laag-medium snelheid.<ol>
<li>Leg het monster in een wegwerp injectiespuit 1 mL. Indien beschikbaar, ingesteld de spuit in een automatische-spuitpomp ingesteld op het injecteren van het monster van de verdunde exosome bij een snelheid van 30 µL/min.</li>
		<li>NTA metingen met behulp van video-opname-instellingen uit te voeren: scherm winst van 3-4 en camera niveau van 12-13.</li>
		<li>Definiëren van het script voor analyse uitvoeren van de drie technische wordt gerepliceerd voor een minimum van 30 s met behulp van een constante stroom voor elke repliceren. Voor de analyse, stelt u de drempel vastleggen op 5. Opmerking: Details over het gebruik van de automatische spuit, en de instellingen voor video-opname zijn beschikbaar in het referentie-13. Instellingen voor vastleggen en analyse voor NTA moet consequent zijn in verschillende verschillende steekproeven te verzekeren van de vergelijkbaarheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. bepaling van de vermindering van de oplosbaar eiwit
<ol><li>1-10 µg gezuiverde exosomes aan SDS monster buffer toevoegen en het uitvoeren van polyacrylamide gelelektroforese (pagina) met behulp van een 4-12% Bis-Tris Gel in 1 x MES SDS uitvoeren buffer gedurende 35 min. op 200 V. Transfer opgelost eiwitten aan een nitrocellulose 0,2 µm membraan door toepassing van een spanning-o f 50 V voor 1-1,5 h. westelijke vlekkenanalyse uitvoeren om te evalueren van de aanwezigheid van albumine, apolipoproteins A en B en de exosome markering CD 63 na standaard methoden. Opmerking: Volledige protocollen voor de methoden in 7.1 kunnen worden gevonden in verwijzing14; specifiek, SP007: lopen van polyacrylamide gels en SP011: westelijke vlek protocol.</li>
	<li>Scheiden van 10 µg gezuiverde exosomes via pagina zoals in stap 7.1 en vlekken van de eiwit-bands coomassie kleurstof, met volgende standaard aanbevelingen, om te visualiseren van eiwitten variatie en vermindering tussen de monsters. Opmerking: Nadere details betreffende het protocol voor westelijke vlekken specifiek voor CD63 zijn beschreven door Diaz et al. 15
</li>
</ol>

<ol><li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+functions+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Schorey, J. S., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+and+infectious+diseases%3A+new+complexity+to+an+old+story%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+platform+for+diagnosis+and+monitoring+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer-derived+urine+exosomes%3A+a+novel+approach+to+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.</a> Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).</li>
<li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27269(2015).</li>
<li>Sódar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Sci Rep. 6, 24316(2016).</li>
<li>de Menezes-Neto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+as+a+stand-alone+methodology+identifies+novel+markers+in+mass+spectrometry+analyses+of+plasma-derived+vesicles+from+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27378(2015).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+and+scalable+purification+of+extracellular+vesicles+using+combined+bind-elute+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11561(2017).</li>
<li>Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf">http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf</a> (2010).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx">http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx</a> (2017).</li>
<li>Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975(2016).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Sweeney, P. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+K+%28EC+3.4.21.14%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteinase K (EC 3.4.21.14).</a> Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een geoptimaliseerde methode om te verhogen, de zuiverheid en het rendement van exosomes uit bloed zal het verhogen van het vermogen om nauwkeurig de mijne van extracellulaire blaasjes als een bron van biomarkers voor verschillende ziekten. De standaardmethoden momenteel gebruikt voor het isoleren van exosomes, in het bijzonder ultracentrifugatie en neerslag methoden, hebben verscheidene nadelen met inbegrip van bundeling van exosome en pillering van oplosbare eiwitten7,<sup class="xref...

Exosomes zijn nanovesicles (variërend in grootte van 30 nm tot 150 nm) uitgebracht door bijna alle cellen in het menselijk lichaam te vergemakkelijken van cel naar cel communicatie verwerkt1,2. Interessant is dat de samenstelling van de exosomes verandert afhankelijk van de cellen van oorsprong, alsmede de gezondheidsstatus van de individuele3,4,5. Bovendien exosomes kunnen worden opgehaald uit verschillende biologische vloeistoffen zoals: speeksel, urine en bloed2. Vanwege deze kenmerken, exosomes worden beschouwd als een goede bron van ziekte biomarkers. Helaas, er is geen standaard methode voor de isolatie van de exosomes. Sommige laboratoria vinden meerstaps centrifugeren, met een laatste snelle stap bij 100.000 x g met behulp van dichtheid verlopen als de gouden standaard methode om exosome te isoleren. Recente studies hebben echter aangetoond dat ultracentrifugatie induceert aggregatie van exosomes met oplosbare eiwitten en andere exosomes, naast het beïnvloeden van de integriteit van de exosome, die beide kunnen nadelig zijn voor stroomafwaarts toepassingen6,7 . Andere gemeenschappelijke methoden voor exosome isolatie omvatten, maar zijn niet beperkt tot: neerslag door commerciële polyethyleenglycol (PEG) gebaseerd reagentia, centrifugaal ultrafiltratie en grootte-uitsluiting chromatography (SEC). De commerciële reagentia met polyethyleenglycol (PEG) polymeren verrijken exosomes door waardoor ze neerslaan en vormen een pellet. Beperkingen met behulp van dit polymeer zijn besmetting met residuele PEG polymeer en een overvloed van oplosbare niet-exosomal eiwitten in het eindproduct. Ultrafiltratie maakt gebruik van centrifugeren om te zuiveren en het concentreren van de blaasjes met een cellulose membraan; exosomes blijven behouden boven het filter, terwijl kleinere onzuiverheden en andere eiwitten de membraan7,8 doorheen. Net als andere methoden heeft centrifugaal ultrafiltratie een beperkte capaciteit voor het zuiveren van exosomes als gevolg van de handhaving van hoge niveaus van niet-exosomal eiwitten, met inbegrip van eiwitcomplexen en aggregaten. Ten slotte gebruikt de SEC zuivering poreuze hars te scheiden van moleculen door grootte. SEC heeft aangetoond veelbelovende resultaten, het overwinnen van de meeste van de problemen die met andere methoden door het vastleggen van de meerderheid van hun gehalte aan verontreinigingen eiwitten en het behoud van de integriteit van de exosomal, aangezien isolatie is gebaseerd op de zwaarte of de lagedruk systemen7, 9. De co Isolatievan groter eiwit, aggregaten en lipoproteïnen10 tijdens SEC heeft echter gevolgen voor de zuiverheid van de voorbereiding van de definitieve exosome. Terwijl sommige methoden zijn getest voor exosome zuivering van cel cultuur supernatant en plasma7, of alleen plasma9,11, is er geen informatie over de prestaties van methoden rechtstreeks vergelijken van bloed plasma en serum van dezelfde persoon.
Hier, richten we ons op de zuivering van bloed exosomes door het vergelijken van een verscheidenheid van werkstromen om te bepalen of blaasje verrijking technieken vertaalbare tussen plasma en serum. Nanoparticle voor het bijhouden van analyse en westelijke vlek werden gebruikt om het kwantificeren van de verschillen in exosome eiwit concentratie en zuiverheid samenstelling in de eindproducten. De laatste methode, beschreven in dit protocol, verhoogt vesikel nummers en vermindert van niet-exosomal eiwitniveaus. Nog belangrijker is, wordt een drastische vermindering van de gemeenschappelijke co neerslagmiddel eiwitten, met inbegrip van albumine en apolipoproteins aangetoond. De hoge overvloed van deze twee eiwitten in het bloed en de frequentie waarop zij mede met exosomes oorzaken inconsistenties tussen de "zuivere" monsters zuiveren, scheeftrekken van de stroomafwaartse analyses. Dit protocol omvat het gebruik van een commercieel beschikbare SEC hars; de hars is samengesteld uit poreuze parels waarin eiwitten kleiner dan 700 kDa de parels kunnen invoeren. Eenmaal binnen, de eiwitten worden behouden door een octylamine ligand. Het eluaat bestaat uit exosomes en moleculen groter dan 700 kDa12. Bovendien ter beperking van de eiwit-aggregaten en apolipoproteins die kraal overlapping onttrekken, nemen we een protease spijsvertering stap in de werkstroom. Op dit moment is er niet één techniek staat het maximaliseren van de opbrengst van de exosome terwijl het verminderen van mede zuiverende niet-exosomal-eiwitten. Deze studie toont aan dat een zuivering protocol dat een protease spijsvertering voorbehandeling met meerdere methoden voor herstel en zuivering combineert kan worden gebruikt om exosome rendement en zuiverheid van het bloed, serum en plasma te verhogen.

<table><tbody><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath&nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>THERMO</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE Healthcare</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep&nbsp;Chromatography Columns</td><td>BIORAD</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 &micro;m</td><td>BIORAD</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K,&nbsp;Tritirachium album</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&nbsp;BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody</td><td>SYSTEM BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>Primaire en secundaire antilichamen</td></tr><tr><td>ALB Antibody (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>apoB Antibody (C1.4)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>apoA-I Antibody (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>Primair antilichaam</td></tr></tbody></table>

vertering van eiwitten, ultrafiltratie en size exclusion chromatography voor het optimaliseren van het isolement van exosomes uit menselijk bloed plasma en serum

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, een soort nanovesicle verlost van alle celtypes, kunnen worden geïsoleerd van eventuele lichamelijke vloeistof. De inhoud van exosomes, met inbegrip van eiwitten en de RNAs, zijn uniek voor de cellen waaruit ze zijn afgeleid en kunnen worden gebruikt als indicatoren van ziekte. Verschillende gemeenschappelijke verrijking protocollen, waaronder ultracentrifugatie, opbrengst exosomes beladen met oplosbaar eiwit contaminanten. Specifiek, hebben we geconstateerd dat de meest voorkomende eiwitten in het bloed vaak mede met exosomes zuiveren en kunnen verwarren downstream proteomic studies, frustreert de identificatie van lage overvloed biomerker kandidaten. Is irreproducibility van exosome eiwit kwantificering vanwege inconsistent vertegenwoordiging van niet-exosomal eiwitniveaus extra zorgwekkend. Het protocol hier gedetailleerde werd ontwikkeld voor het verwijderen van niet-exosomal-eiwitten die mede samen met exosomes zuiveren, strengheid toe te voegen aan het zuiveringsproces van exosome. Vijf methodes werden vergeleken met behulp van de gepaarde bloed plasma en serum van vijf donoren. Analyse met behulp van nanoparticle volgen analyse en micro-bicinchoninic zuur eiwit kwantitatieve analyse bleek dat een gecombineerde protocol met behulp van ultrafiltratie en grootte uitsluiting chromatografie het blaasje optimale verrijkings- en oplosbaar eiwit verwijdering leverde. Westelijke bevlekken werd gebruikt om te verifiëren dat de verwachte overvloedige bloedeiwitten, met inbegrip van albumine en apolipoproteins, waren uitgeput.

De hieronder gepresenteerde gegevens zijn verkregen met behulp van de gepaarde plasma en serum monsters van vijf gezonde bloeddonoren. Om te bepalen van de gevolgen van elke stap van de verwerking, vijf variaties van het voorgestelde protocol werden uitgevoerd, en exosome terugwinning en niet-exosome eiwit verwijdering werden vergeleken. De methoden trialed inbegrepen: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltratie 3 kDa; 2) ultrafiltratie 100 kDa; 3) proteïnase K + ultrafiltratie 100 kDa; 4) SEC 700 kD...

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Het algemene doel van deze procedure is om blaasjes uit bloed te zuiveren terwijl co-zuiverende eiwitten en complexen worden verminderd die de downstream-analyse kunnen verstoren, inclusief nanoparticle-tracking en proteomics. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals wat de proteomische veranderingen zijn in serum- of plasmablaasjes tijdens de ziektetoestand in vergelijking met een gezonde toestand. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de verhoogde nauwkeurigheid in blaasje-enumeratie.Bij het verwijderen van overvloedige niet-blaasjesverontreinigingen verhogen we de identificatie van eiwitten met lage abundantie en de potentiële biomarkers van ziekten. De implicatie van deze methode strekt zich uit tot de ontdekking van nieuwe diagnostische biomarkers. Het maakt een nauwkeurigere bepaling van de proteomische samenstelling van extracellulaire blaasjes mogelijk in complexe matrices, zoals bloed.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in blaasjeszuivering worstelen omdat er veel gepubliceerde technieken zijn. De reproduceerbaarheid van downstream proteomische analyse wordt beïnvloed door de co-zuivering van overvloedige serumeiwitten. Equilibreer een serum- of plasmamonster door de buis onder niet-schuddende omstandigheden overnacht in een koelkast van vier graden Celsius te plaatsen.De volgende dag, pipet 250 microliter van het monster in een microcentrifugebuis met een pipet van 1.000 microliter. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius bij 18.000 keer G. Gebruik een pipet van 200 microliter om 200 microliter van het opgehelderde supernatant te verwijderen en voeg het toe aan een nieuwe microcentrifugebuis.Vermijd enig bezonken materiaal tijdens het overbrengen van het supernatant. Kwantificeer het eiwitgehalte van het monster door BCA-test met behulp van het protocol van de fabrikant. Om de test uit te voeren, verdun het monster één op 50 in een X fosfaatgebufferde zoutoplossing.Test elk monster in duplicaat. Bereid een proteinase K-oplossing met een concentratie van 50 microgram per milliliter in PBS voor door eerst de overeenkomstige hoeveelheid proteinase K toe te voegen aan een conische buis. Voeg vervolgens de buffer toe en vortex gedurende 30 seconden driemaal bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 50 microliter proteinase K-oplossing toe aan het aliqout van 10 milligram monster en meng voorzichtig door op en neer te pipetten met een pipet van 200 microliter. Incubeer het monster gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius, waarbij het buisje in een drijvende buisrek wordt geplaatst. Om potentiële lekkage te voorkomen, vermijd volledige onderdompeling van het buisje in het waterbad.Na incubatie, breng het monster en de rek over naar een waterbad van 60 graden Celsius gedurende 10 minuten om de proteinase K te inactiveren. Spoel vervolgens een ultrafiltratieapparaat met een moleculair gewichtsdoorlaatfilter van 100 kilodalton met PBS voor gebruik. Gebruik een pipet van 1.000 microliter om 500 microliter PBS aan het filter toe te voegen. Na het draaien van het apparaat bij 3.700 keer G gedurende vijf minuten, gooit u eventueel overgebleven retentate evenals het eluaat weg.Verhoog het volume van het monster tot 500 microliter door PBS toe te voegen. Pipet vervolgens het monster in het vooraf gespoelde ultrafiltratieapparaat. Centrifugeer het ultrafiltratieapparaat in een tafelcentrifuge met vaste hoek bij 3.700 keer G en vier graden Celsius tot het monster is verminderd tot een volume van 50 microliter.Voeg vervolgens 500 microliter PBS direct op het filtermembraan toe. En pipet vijf keer op en neer voordat u opnieuw centrifugeert zoals eerder. Breng het laatste retentate van 50 microliter over naar een nieuwe microcentrifugebuis.Spoel het filtermembraan af met 200 microliter PBS, pipet op en neer 10 keer. En breng het wasmiddel over naar de buis. Plaats vervolgens de filterhouder in de omgekeerde positie in een nieuwe buis.Voer een omgekeerde spinherstel gedurende vijf minuten bij 2.000 keer G uit om het resterende monster van het membraan te halen. Plaats de kolommen in een maatwerkrek. Voeg 850 microliter SEC-slurry toe met parels met een moleculair gewichtsdoorlaat van 700 kilodalton met behulp van een pipet van 1.000 microliter.Open de bodem van de kolom en laat de vloeistof gedurende vijf minuten in een afvalcontainer lopen. Eenmaal uitgelopen, voeg 10 microliter PBS toe om de hars te wassen. Geef de was 20 minuten de tijd om uit de kolom te lopen.Plaats het geconcentreerde proteinase K-behandelde monster in een kegelvormige buis van 15 milliliter. En verhoog het monstervolume tot vijf milliliter door PBS toe te voegen met een serologische pipet. Roer het buisje voorzichtig door één minuut te schudden.Breng vervolgens het monster langzaam aan op de voorbereide kolom met een serologische pipet. Verzamel het doorstromingsproduct in een nieuwe kegelvormige buis van 15 milliliter. Pipet het verzamelde materiaal weer over de hars om eventueel resterend materiaal onder 700 kilodalton te verwijderen, en verzamel het doorstromingsproduct in een nieuwe kegelvormige buis van 15 milliliter.Was de hars twee keer door telkens een milliliter PBS toe te voegen. Verzamel het doorstromingsproduct in een buis. Het totale eindvolume zal ongeveer zeven milliliter zijn.Spoel een ultrafiltratieapparaat met een moleculair gewichtsdoorlaatfilter van drie kilodalton af zoals eerder. Centrifugeer in een schommelbakrotor bij 3.700 keer G en vier graden Celsius. De buffer zal door het filter passeren en kan worden weggegooid.Geconcentreerde exosomen worden boven het filter vastgehouden. Centrifugeer het monster tot het volume boven het filter is verminderd tot 200 microliter. Kwantificeer het eiwitgehalte van het monster door BCA-test met behulp van het protocol van de fabrikant.Voeg vijf microgram gezuiverde exosomen toe aan één milliliter PBS. En vortex gedurende 15 seconden op

protein-digestion-ultrafiltration-size-exclusion-chromatography-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van exosomen uit vol bloed en verdere analyse door middel van nanodeeltjestracking met behulp van een semi-automatisch instrument. De gepresenteerde technologie biedt een uiterst gevoelige methode voor het visualiseren en analyseren van deeltjes in vloeibare suspensie.

Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.

Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse

Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).

Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Leer een geoptimaliseerd protocol voor exosoomisolatie uit menselijk bloedplasma en serum met behulp van eiwitvertering, ultrafiltratie en size exclusion chromatografie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van downstream analyses en biomarkerontdekking.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum (Video) | JoVE Journal

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Meer video's verkennen