Name: Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer hoe je intracellulaire groei van Leishmania in muizenmacrofagen kwantificeert om parasietvirulentie te beoordelen. Deze snelle, betrouwbare methode vermindert dierproeven en helpt bij het ontwikkelen van therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie RO1 AI067979 NWA. YK is ontvanger van undergraduate fellowship van de Howard Hughes Medical Institute/Universiteit van Maryland College Park.

Alle experimentele procedures werden door de National Institutes of Health uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Maryland. Alle stappen die worden beschreven in de punten 1 tot en met 4 mag aseptisch worden uitgevoerd binnen biologische laminaire flow kasten. Persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt, en voorzichtigheid moet worden betracht bij de verwerking van levende Leishmania parasieten in alle stadia van de experimenten.
1. isolatie en differentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs)8,30,31
<ol><li>
Dag 0: 4 - 6 weken oude vrouwelijke C57BL/6 of BALB/c muis in een CO2 kamer opofferen en bevestig dood via cervicale dislocatie. Sterilisatie van schaar en pincet zorgen doordat ze gedrenkt in 70% ethanol. Spray handschoenen met 70% ethanol toe steriele behandeling gedurende het beenmerg proces voor de isolatie van de cel.</li>
	<li>Veilige geofferde muis naar dissectie boord door pinning zijn voorpoten en desinfecteer door spuiten aangenomen met 70% ethanol.</li>
	<li>Maken een kleine snede (ongeveer 1 cm) met een schaar in de buurt van het heupgewricht. Steek voorzichtig scharen onder de huid te scheiden van de onderliggende spier en het knippen van de huid al manier rond het heupgewricht. Opmerking: De dissectie van bestuur kan worden gedraaid zodat betere toegang hebben tot het heupgewricht.</li>
	<li>Zorgvuldig deglove huid van het been door te trekken naar de enkel en verwijderen. De voet afsnijden op de enkel, zeer voorzichtig te snijden op of onder de enkel gezamenlijk aan het scheenbeen volledig intact laten. Opmerking: De broche in dit stadium is losjes gekoppeld en gemakkelijk kan worden gescheiden met het pincet.</li>
	<li>Handmatig zoeken van het heupgewricht door het manipuleren van het dijbeen ter identificatie van het punt van rotatie. Zorgvuldig gebruik schaar te verbreken van het been boven het heupgewricht naar de proximale kop van het dijbeen intact laten.</li>
	<li>Verwijder zo veel spier- en bindweefsel mogelijk van het been met een schaar. Verwijder eventuele resterende huid van de enkel en eventuele overtollige beendermateriaal boven het heupgewricht.</li>
	<li>Plaats de schoongemaakte been botten in steriele RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine (1% eindconcentratie) in een petrischaal op ijs.</li>
	<li>Herhaal stap 1.4 via 1.6 te isoleren scheenbeen en het dijbeen van de andere achterpoot.</li>
	<li>Verwijder eventuele resterende spier- en bindweefsel uit de botten onderdompelen in RPMI met behulp van gesteriliseerde pincet en steriele #10 blade.</li>
	<li>Plaats de botten op de deksel van de petrischaal. Snij het scheenbeen zorgvuldig met het mes onmiddellijk boven het enkelgewricht tot het beenmerg. Verwijder de tibia van de rest van het been door het afsnijden direct onder het kniegewricht.</li>
	<li>Tekenen van 10 mL steriele RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine (1% eindconcentratie) in een 10 mL spuit en bevestig een 25G naald.</li>
	<li>Houd het onderbeen stevig met een tang, verticaal boven een conische buis van 50 mL op ijs. Gebruik de spuit te injecteren zachtjes ongeveer 5 mL RPMI in het einde van de bot voor het spoelen van het beenmerg uit het andere uiteinde in de conische buis. Spoel het beenmerg met een totaal van 10 mL RPMI totdat het bot wit wordt. Opmerking: Na het grondig spoelen, het bot moet wenden wit. Als dat niet het geval is, blijven spoelen om te verwijderen van beenmerg. De distale einde van de tibia wellicht bijgesneden terug met het mes als het is te smal om in te voegen van de naald.</li>
	<li>Snijd het dijbeen onmiddellijk boven het kniegewricht en onmiddellijk onder het heupgewricht aan beide uiteinden van het bot voor toegang tot het merg bloot. Spoel het beenmerg uit het dijbeen met een totaal van 10 mL RPMI op dezelfde manier als het scheenbeen.</li>
	<li>Herhaal reinigen en spoelen stappen 1.6 via 1.13 met de resterende botten en beenmerg leeggemaakte cellen in een conische buis van één 50 mL verzamelen Opmerking: Als een bot op elk gewenst moment tijdens de dissectie voorafgaand aan bot spoelen breekt, gebruik niet het merg uit dit bot.</li>
	<li>De conische buis gebruikt voor het verzamelen van beenmerg gespoeld uit alle vier botten gedurende 10 minuten bij 4 ° C bij 300 x g centrifugeren.</li>
	<li>Plaats van 60 mL steriele BMM voedingsbodem (RPMI met een eindconcentratie van 20% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1.2 mM nb-pyruvaat, 25 µg Mo/mL menselijke M-CSF) in een maatkolf van 175 cm2 cel cultuur met filter dop.</li>
	<li>Verwijder het supernatant volgende centrifugeren en resuspendeer de pellet cel door zachte op en neer pipetteren met 5 mL van BMM medium uit de kolf.</li>
	<li>Celsuspensie in de erlenmeyer van de cultuur en spoel de conische buis tweemaal met BMM medium uit de cultuur kolf maximale cel invordering te waarborgen. Zorgen voor celsuspensie grondig wordt gemengd tot medium en distribueren van 30 mL van de eerste 175 cm2 cel cultuur kolf in een tweede 175 cm2 cel cultuur kolf met filter GLB.</li>
	<li>Incubeer beide kolven met 30 mL celsuspensie elke overnachting bij 37 ° C, 5% CO2 dat scheiding van eventuele contaminerende fibroblasten, resident macrofagen en andere Adherente cellen.</li>
	<li>
Dag 1: Overdracht van de bovendrijvende substantie met ongedifferentieerde beenmergcellen van kolven aan 100 x 15 mm niet-TC-behandelde polystyreen petrischalen bij ongeveer 10 mL/schotel en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Gooi de kolven.</li>
	<li>
Dag 3 of 4: Toevoegen van een extra 5 mL BMM medium (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) aan elke petrischaal en blijven incubatie bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>2. plating BMMs op Coverslips voor infectie (dag 7 of 8)
<ol><li>6-well weefselkweek platen door het plaatsen van vier (4) steriel 12 mm glas coverslips (gesteriliseerde met autoclaaf en opgeslagen in een gesloten glazen container) in de bodem van elke lege goed voor te bereiden. Opmerking: Halen elke steriele 12 mm dekglaasje aan met een zuigen tip gemonteerd op een vacuüm lijn. Plaats coverslips in de putjes zonder overlapping, vrijgeven op de gewenste positie door het knijpen van de buis vacuüm worden onderbroken.</li>
	<li>Aspirate media (en alle niet-aanhanger cellen) van petrischalen bekleed met aanhangend beenmerg afgeleid macrofagen en voorzichtig spoelen aanhanger cellen 2 x met de steriele Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium chloride (PBS- / -) vooraf opgewarmd tot 37 ° C.</li>
	<li>Voeg ontkleuring, 5 mL steriele 1 x PBS- / - met een eindconcentratie van 1 mM EDTA tot elke petrischaal en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C loskoppelen van de aanhanger BMMs. Controleer dat de cellen zijn vrijstaand met behulp van een microscoop.</li>
	<li>Verzamel alle vrijstaande cellen gesuspendeerd in 1 x PBS- / - aangevuld met 1 mM EDTA in een conische tube van 50 mL. Spoel elke schotel 2 x met 5 mL PBS- / - en voeg toe aan cel schorsing zwembad. Opmerking: Celsuspensie kan worden verdund met extra PBS- / - ter bescherming van macrofagen van EDTA toxiciteit tijdens het proces van het verzamelen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer macrofagen in 5-10 mL BMM medium door pipetteren. Geresuspendeerde plaats cellen op ijs ter voorkoming van gehechtheid aan buizen en samendoen.</li>
	<li>Levensvatbare cellen tellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting in de hemocytometer. Opmerking: Als u wilt tellen BMM cellen geresuspendeerde in 5 mL medium, een verdunning-mix van 25 µL celsuspensie in 445 µL PBS- /- en 30 µL 0,4% Trypan blauwe oplossing meestal maakt het mogelijk gemakkelijk kwantificering in een hemocytometer (rekening houdend met een 20 x verdunningsfactor voor de definitieve berekening ). Tellen alleen de cellen die niet ging krijgen gekleurd met Trypan blauw (levensvatbare cellen). Het volume van de celsuspensie kan worden gewijzigd als dit mengsel is te geconcentreerd of verdund. In het algemeen, varieert de opbrengst van de BMM per voorbereiding tussen 2 x 107 en 5 x 107 cellen uit een simpele muisklik.</li>
	<li>Voorbereiden van de celsuspensie in BMM medium bij gewenste plating concentratie (5 x 105/mL) en verspreiden van schorsing aan 6 goed platen in 2 mL medium per putje, zodat elk goed 1 x 106 macrofagen ontvangt. Opmerking: Dit is een kritieke stap die zorgt voor elke goed krijgt de voldoende aantal macrofagen ter dekking van de coverslips uniform. Controleer of de coverslips in putten niet overlappende of drijvend in het medium. Zo ja, voorzichtig aanpassen met een steriele pipette uiteinde.</li>
	<li>Na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>3. de zuivering van besmettelijke vormen van L. amazonensis
Opmerking: Leishmania bereiden voor infecties - zuiveren van metacyclische promastigoten van stationaire promastigote culturen8,13, of onderscheiden van promastigoten in cultuur in amastigoot formulier met behulp van standaard L. amazonensis een differentiatie protocol6,8.
<ol><li>
Zuivering van Leishmania metacyclische promastigoten gebruiken dichtheid verlopende media(Materials) 33<ol>
<li>Stockoplossing van het 40% van de kleurovergang media dichtheid in steriele, endotoxine-gratis water voor te bereiden.</li>
		<li>Verdun de kleurovergang oplossing dichtheid in 10 x M199 medium (zonder serum) ter voorbereiding van 10% concentratie in het M199 medium.</li>
		<li>Filtreer alle oplossingen door 0,22 µm filter. Opmerking: Voorraad oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 oC in het donker niet langer dan 1 maand.</li>
		<li>Voeg 2 mL van 40% dichtheid kleurovergang media-oplossing in de bodem van een conische centrifugebuis van 15 mL.</li>
		<li>Laag 2 mL 10% dichtheid kleurovergang media oplossing in M199 op de top van de laag van 40% dichtheid kleurovergang media zorgvuldig, met behulp van een pipet van Pasteur om te voorkomen dat elke vermenging tussen de twee lagen.</li>
		<li>1 x 109 parasieten van stationaire-fase cultuur verzamelen door centrifugeren bij 1.900 x g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in de 6 mL Dulbecco bewerkt essentiële Medium (DMEM).</li>
		<li>Laag 2 mL van de celsuspensie direct bovenop de 10% dichtheid kleurovergang media layer, zacht, met behulp van een pipet van Pasteur te vermijden mengen tussen lagen.</li>
		<li>Centrifugeer het verloop gedurende 10 minuten bij 1300 x g bij kamertemperatuur. Opmerking: Als gevolg van verschillen in fysische eigenschappen tussen Leishmania soorten, CENTRIFUGEEROMSTANDIGHEDEN voor elk wellicht enigszins worden aangepast om ervoor te zorgen maximale opbrengst.</li>
		<li>Verzamelen parasieten (verrijkt in metacyclische promastigote vorm) van de band gevormd op de bovenste 10% dichtheid kleurovergang media grens (interface tussen de 0 en 10% dichtheid kleurovergang media lagen).</li>
		<li>Verdun parasieten met een volume van DMEM en verzamelen door middel van centrifugeren (1.900 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur).</li>
		<li>Resuspendeer in 500 µL DMEM medium en tellen in een hemocytometer te kwantificeren van de opbrengst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generatie van L. amazonensis amastigotes onder een kweekomstandigheden (lage pH / verhoogde temperatuur)6,8,13<ol>
<li>Meng 5 mL van de log-fase promastigote cultuur (pH 7.4 bij 26 oC) met een gelijke hoeveelheid amastigoot medium (pH 4.5), met behulp van 25 cm2 flacons (totaal 10 mL medium) en na een nacht bebroeden bij 26 ° C.</li>
		<li>Verschuiving van de kolf van 26 ° C tot 32 ° C.</li>
		<li>Na 3 of 4 dagen split cultuur 1:5 in amastigoot media bij 32 ° C.</li>
		<li>Controleer de parasieten in de komende 3-4 dagen (max. 7 dagen) om te zien als ze klaar voor gebruik in infecties zijn. Opmerking: Gezonde een amastigotes moet hebben een ovale vorm, zonder zichtbare flagellen. Gedeeltelijk gedifferentieerde amastigotes hebben een grote ovale vorm met korte flagellen. De cultuur moet niet een heleboel bosjes - veel klontjes zijn een indicatie van het niet-groeiende, stervende parasieten. De amastigoot cultuur kan worden gesplitst van 1:5 en onderhouden voor een maximum van 3 weken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. infectie met L. amazonensis
<ol><li>Verdun parasiet schorsingen volgens gewenste MOI (3-5 meestal metacyclische promastigoten per macrofaag [MOI van 1:3 of 1:5]) en 1 amastigoot per macrofaag [MOI 1:1]. In PBS- / - in een volume van 50-100 µL Leishmania toevoegen aan elk putje al met 2 mL medium.</li>
	<li>Incubeer BMMs voor 1 h met amastigotes en 3 h met metacyclische promastigoten bij 34 oC voor infectie. Opmerking: Optimale infectie temperatuur kan verschillen per soort.</li>
	<li>Na incubatie, grondig te wassen weg gratis parasieten in elke goed 3 x met 2 mL PBS- / - voorverwarmde tot 37 ° C. Opmerking: Dispergeren PBS voorzichtig om ervoor te zorgen dat coverslips niet over elkaar heen doen drijven. Zachtjes swirl de plaat en dan uit de vloeistof worden gecombineerd. Gebruik aparte zuigen tip als met meerdere stammen van parasieten te voorkomen van kruisbesmetting.</li>
	<li>Positiebepaling 1 h of 3 h-tijdstip monsters door broeden elk goed met 1,5-2 mL 2% PFA in PBS- / - 10 min. 3 x met PBS- / - wassen. Niet gecombineerd laatste wassen en koelen platen met coverslips in PBS tot vlekken.</li>
	<li>Voeg 2 mL verse BMM medium aan elk putje op platen voor verdere tijd-punten en Incubeer bij 34 ° C.</li>
	<li>Fix resterende tijd-punten als gewenste zoals beschreven in stap 4.3 en koelkast platen tot vlekken.</li>
</ol>5. de DAPI kleuring en dekglaasje aan montage
<ol><li>Gecombineerd PBS uit putten met coverslips en voeg 1,5 mL PBS- / - met 0,1% niet-ionogene wasmiddel. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 3 x wassen met 2 mL PBS- / -.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS- / - met 2 µg/mL DAPI (verdund van 5 mg/mL voorraadoplossing in water) aan putjes met coverslips en incubeer gedurende een ander 1 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: De incubatietijd met DAPI is essentieel voor goede visualisatie van intracellulaire Leishmania parasieten. Macrophage kernen vlek snel, als gevolg van hun grotere omvang en DNA inhoud maar de verkleuring van de kernen van de intracellulaire parasieten is trager. Uitbreiding van de incubatietijd voorbij wat er nodig is om te visualiseren van de BMM kernen is dus nodig dat DAPI te doordringen via en het plasmamembraan parasiet, en de parasiet kernmembraan. Met de juiste DAPI vlek, kan de mitochondriale kinetoplast DNA in de buurt van de flagellar zak van de parasiet ook worden gevisualiseerd, naast de nucleaire DNA.</li>
	<li>Wash elk putje met coverslips 3 x met 2 mL PBS- / - en vervolgens lift en flip coverslips met pincet plaats neer de kant van de cel te monteren op glas Microscoop dia's met een commercieel verkrijgbare antifade montage reagens. Opmerking: Coverslips zijn bijzonder kwetsbaar en moeten voorzichtig omgaan. Vermijd druk op hen, met name tegen de zijwand van de putten bij het tillen. Het toevoegen van een paar druppels van PBS- / - vermindert de oppervlaktespanning tussen het dekglaasje aan en goed en vergemakkelijkt de hijs. Een fijne gauge naald kan worden gebruikt om te helpen bij de prying van de coverslips van de bodem van de put. Na het plaatsen van een dekglaasje aan op de dia, zachtjes druk naar beneden met een tang aan alle luchtbellen in de montage media uitduwen. Als een dekglaasje aan gebroken is of eventueel tijdens het tillen is gespiegeld, niet remount; gewoon gebruik maken van de reserve vierde dekglaasje aan.</li>
	<li>Koelkast dia's tot kwantificering.</li>
</ol>6. infectie kwantificering
<ol><li>DAPI gebeitste dia's onder een fluorescentie Microscoop onderzoeken door te focussen op de macrofagen 100 X objectief met immersie-olie (excitatie op 358 nm; optimale emissie bij 461 nm). Zorg ervoor dat de focus ligt op de laag van de macrofagen tussen het glasplaatje en dekglaasje aan.</li>
	<li>Kwantificeren van het aantal macrofagen (grote kernen gekleurd met DAPI) en het aantal kleinere amastigoot kernen geclusterd rond de kern van elke macrofaag (Zie figuur 2A, DAPI) voor elke gezichtsveld, met behulp van een handmatige counter. Opmerking: Amastigoot kernen kunnen niet allemaal zichtbaar zijn in een vlak van de focus vanwege hun kleine omvang. Die zichtbaar zijn wanneer gericht op macrophage kernen tellen en vervolgens het gebruik van fijne focus om te controleren of parasiet kernen in vliegtuigen boven en onder de macrofaag-kernen.</li>
	<li>Verplaatsen naar een ander gezichtsveld te herhalen kwantificering. Een aparte teller-sleutel wordt gebruikt voor het bijhouden van het aantal velden geteld. Visual velden in parallelle rijen doorlopen over elke dekglaasje aan, om te voorkomen dat overlapping tellen.</li>
	<li>Kwantificeren van een minimum van 200 macrofagen per dekglaasje aan. Kwantificeren van elk tijdstip van infectie in drievoud (3 coverslips). De vierde dekglaasje aan tellen als een van de vorige niet geschikt is voor het tellen van wegens dekglaasje aan overlapping, slechte montage, Glasbreuk, enz. Opmerking: Als 200 macrofagen kunnen niet worden geteld op elk een dekglaasje aan, tellen de reserve vierde.</li>
	<li>Berekenen van infectie tarieven als amastigotes/macrofaag of amastigotes/100 macrofagen en bepalen percentage geïnfecteerde macrofagen van de kwantificering van de ruwe gegevens.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben,

De kwantitatieve gegevens geproduceerd door de BMM infectie assay hierboven beschreven, kunnen onderzoekers te verkrijgen van de tarieven van de infectie en een betrouwbare bepaling van de veranderingen in virulentie eigenschappen in een relatief korte periode (maximaal 2 weken, in vergelijking met de 2 maanden vereist voor in vivo experimenten). Deze methode is gebaseerd op de DNA-specifieke kleurstof DAPI, die specifiek vlekken macrophage en parasiet kernen, en maakt snelle identificatie en kwantificering van ...

Leishmaniasis verwijst naar een breed spectrum van ziekten bij de mens veroorzaakt door eencellige parasiet soorten van het geslacht Leishmania. Ongeveer 12 miljoen mensen zijn momenteel geïnfecteerd met Leishmania wereldwijd en meer dan 350 miljoen worden bedreigd. De pathologie ziekte hangt af van de soort Leishmania en gastheer factoren en symptomen variëren van onschuldige zelfhelend letsels van de huid tot dodelijke visceralizing vormen. Indien onbehandeld, viscerale leishmaniasis dodelijk is, ranking pas na malaria als de dodelijkste ziekten bij de mens veroorzaakt door infectie met een eencellige parasiet1. Ondanks de brede verschillen in ziekte pathologie en symptomen hebben alle Leishmania soorten een afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk digenic-levenscyclus. Binnenkant gewervelde dieren, Leishmania target host macrofagen voor invasie en de vorming van parasitophorous vacuolen (PVs), zure compartimenten met eigenschappen van de phagolysosomes waar de formulieren zeer virulente amastigoot repliceren veroorzaken. Amastigotes aanhouden in gastheer weefsel gedurende chronische infecties en doorsturen naar niet-geïnfecteerde zandvliegjes, kunnen worden doorgegeven als voltooiing van de cyclus van de transmissie. Daarom, in het kader van de ontwikkeling van ziekten bij de mens, amastigotes zijn de belangrijkste Leishmania lifecycle vorm2. Onderzoeken hoe amastigotes repliceren binnen macrofaag PVs is van cruciaal belang voor het begrip Leishmania virulentie3,4,5,6,7 en voor de ontwikkeling van nieuwe werkzame therapieën.
Hier beschrijven we een methode regelmatig gebruikt door ons laboratorium Leishmania infectie en replicatie in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs), waarbij kwantitatieve beoordeling van het aantal intracellulaire Leishmania na verloop van tijd te studeren. Het proces bestaat uit het verzamelen van monocyten van muis beenmerg en differentiatie macrofagen in cultuur, in vitro besmetting met infectieuze formulieren (metacyclische promastigoten of amastigotes) van Leishmania en kwantificering van de aantal intracellulaire parasieten op elk interval van 24 uur gedurende een periode van 72-96 uur na infectie. Deze test is gebruikt in ons laboratorium om te bepalen van het effect van verscheidene milieufactoren en parasiet genen, met inbegrip van identificatie van de kritische rol van ijzer bij de bevordering van L. amazonensis virulentie verder werd gevalideerd door de struikrover laesie ontwikkelingsstudies in muizen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Aangezien alle pathogene Leishmania soorten hun Dr. niche binnen host macrofagen stellen, kan deze test universeel worden gebruikt voor de analyse van de virulentie in alle Leishmania soorten.
Uitvoeren van BMM infecties kan analyse van gastheer-parasiet interacties op het niveau van eencellige, en dus een uitgebreider begrip van de wisselwerking tussen Leishmania parasieten en hun voorkeur host-communicatie, de PVs van macrofagen. Macrophage infectie testen zijn met succes gebruikt door meerdere groepen16,17,18,19,20,21,22 te verkennen functies van zowel de host macrofaag Leishmania specifieke genen en hun mogelijke betrokkenheid bij de complexe wisselwerking die kenmerkend intracellulaire infectie. BMM infecties toestaan kwantificering van de groei van de parasiet als een uitlezing van de invloed van gastheer factoren die van invloed zijn intracellulair overleven, zoals microbicidal stikstofmonoxide productie, generatie van reactieve zuurstof soorten en andere ongunstige omstandigheden opgetreden binnen het lysosoom-achtige PVs23. Macrophage infectie testen hebben ook gebruikt ter identificatie van potentiële anti-Leishmania drug leads voor therapeutische ontwikkeling13,24.
De in vitro -aard van de BMM infecties biedt diverse voordelen ten opzichte van andere methoden voor het beoordelen van Leishmania virulentie. Verscheidene vorige studies onderzoeken mechanismen van intracellulaire parasiet overleven na verloop van tijd heeft echter niet kwantificeren infectie als een tarief20,21,24. Bovendien, vele studies gericht op de volgende in vivo infecties na verloop van tijd gedaan door het meten van de grootte van de cutane laesie en andere fysiologische symptomen die slechts indirect gerelateerd zijn aan de parasiet replicatie25,26 , 27. in vivo infectie is een strenge aanpak om te beoordelen van de virulentie van de parasiet, maar laesie grootte metingen gebaseerd op struikrover alleen zwelling zijn vaak ontoereikend, omdat ze de inflammatoire respons in geïnfecteerde weefsels weerspiegelen en niet de absolute aantal parasieten. Om deze reden, struikrover laesie ontwikkeling testen moeten worden gevolgd door de kwantificering van de parasiet belasting in geïnfecteerde weefsels, testen een procedure waarvoor langdurige beperkende verdunning28. Daarnaast betrekken in vivo studies vaak offeren meerdere dieren op verschillende punten in de tijd om uit te pakken van weefsels van belang6,8,9,10, 11 , 13. daarentegen grote aantallen BMMs van slechts één dier kan worden verkregen, en deze cellen kunnen verguld worden onder voorwaarden die het mogelijk maken van beoordeling van infectie op verschillende momenten in de tijd. Voorts staat ten opzichte van in vivo studies, uitvoeren van in vitro BMM infecties meer controle over de proefomstandigheden. Kwantificeren van de macrofagen besmet samen met de parasieten zich maakt nauwkeurige controle van de veelheid van infectie (MOI) en kweekomstandigheden. Fijne controle over deze factoren kunnen zijn belangrijk bij het identificeren van de kenmerken van discrete cellulaire routes en in het begrip van hun effect op het verloop van de infectie.
Gezien deze voordelen, is het enigszins verrassend dat zeer weinig groepen bestuderen van Leishmania virulentie volledig voordeel van de kwantitatieve beoordeling van intracellulaire replicatie tot nu toe hebben genomen in macrofagen. In dit artikel bespreken we gemeenschappelijke valkuilen die kunnen worden belemmert het uitgebreider gebruik van deze bepaling, en een stapsgewijze protocol om de juiste uitvoering te vergemakkelijken. Gezien haar precisie en veelzijdigheid, de BMM infectie assay we hier beschrijven kan niet alleen worden gebruikt om te verkennen van de gastheer-pathogeen interacties Leishmania virulentie te beïnvloeden, maar ook om te studeren van andere micro-organismen die repliceren binnen macrofagen29. Nog belangrijker is, kan deze bepaling ook worden ontwikkeld als een snelle en voordelige preklinische screeningsmethode voor anti-Leishmania Geneesmiddelenontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>6 well cell culture plate</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &mu;L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &mu;L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &mu;L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide Needle, 25G&nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: 12 mm circles</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol 200 proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Isoton II Diluent</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gemini</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&nbsp; Hemocytometer&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfactant</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Scissors, 4 1/2"</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van leishmania parasieten

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

De levenscyclus van Leishmania, de verwekker van leishmaniasis, afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen de insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk. Terwijl pathogene symptomen van leishmaniasis sterk, van goedaardige cutane letsels aan zeer dodelijke viscerale ziekte naar gelang van de infectieuze soorten, vormen variëren kunnen alle Leishmania soorten zich bevinden binnen de gastheer macrofagen in de gewervelde fase van hun levenscyclus. Leishmania infectiviteit is dus direct gerelateerd aan haar vermogen om vallen, overleven en repliceren binnen parasitophorous vacuolen (PVs) in macrofagen. Dus fungeert beoordelen of de parasiet de bekwaamheid om te repliceren intracellulair als een betrouwbare methode voor het bepalen van de virulentie. Bestuderen van leishmaniasis ontwikkelen met behulp van diermodellen is tijdrovend, vervelend en vaak moeilijk, met name met de pathogenically belangrijk viscerale vormen. Hier beschrijven we een methodologie om de intracellulaire ontwikkeling van Leishmania in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) volgen. Intracellulaire parasiet aantallen zijn vastgesteld op 24u tijdstippen gedurende 72-96 uur na infectie. Deze methode zorgt voor een betrouwbare bepaling van de effecten van verschillende genetische factoren op Leishmania virulentie. Als voorbeeld, laten we zien hoe een één allel schrapping van de Leishmania mitochondriale ijzer Transporter gen (LMIT1) belemmert het vermogen van de Leishmania amazonensis gemuteerde stam LMIT1/ΔLmit1 om te groeien binnen de BMMs, Als gevolg van een drastische vermindering in virulentie in vergelijking met wild-type. Deze test maakt ook nauwkeurige controle van de proefomstandigheden, die individueel kan worden gemanipuleerd om het analyseren van de invloed van verschillende factoren (voedingsstoffen, reactieve zuurstof soorten, enz.) op de host-pathogen interactions. Daarom bieden de juiste uitvoering en kwantificering van BMM infectie studies een niet-invasieve, snel, voordelig, veilig en betrouwbaar alternatief voor conventionele diermodel studies.

Leishmania heeft twee besmettelijk vormen - metacyclische promastigoten die onderscheiden van procyclische promastigoten in stationaire fase van cultuur en amastigotes, die de intracellulaire stadia (Figuur 1). In sommige Leishmania soorten zoals L. amazonensis, kan amastigotes ook worden onderscheiden in een cultuur door het verschuiven van de promastigote cellen lagere pH (4.5) en verhoogde temperatuur (32 ° C), voorwaarden die ve...

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Het algemene doel van dit experiment is om de virulentie van verschillende Leishmania-stammen te beoordelen door middel van infectie van muis-gemedieerde beenmergmacrofagen in vitro en de daaropvolgende kwantificering van de intracellulaire groeikinetiek van parasieten. Deze methode kan ons helpen antwoorden te geven op belangrijke vragen over de factoren van zowel de macrofaag van de gastheer als de ziekteverwekker die de virulentie van de infectieuze Leishmania-parasieten bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een snelle, economische en betrouwbare methode is die aanzienlijk minder dieren vereist in vergelijking met in vivo-studies.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van leishmaniasis, omdat het kan worden gebruikt om de besmettelijkheid van gemuteerde Leishmania-stammen of de werkzaamheid van therapeutische verbindingen te beoordelen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de isolatie van beenmerg-gemedieerde macrofagen en de kwantificering van intracellulaire parasieten moeilijk te leren zijn uit geschreven protocollen alleen. Begin met het vastzetten van een vrouwelijke muis van vier tot zes weken oud op een dissectiebord en desinfecteer het dier met 70% ethanol.Gebruik een schaar om een snede van een centimeter te maken nabij één heupgewricht en snijd de huid helemaal rond het gewricht. Trek de huid van het been naar de enkel om voorzichtig het been te ontdoen van de huid en snijd het voetgedeelte af bij of onder de enkelgewricht om het scheenbeen intact te laten. Om het heupgewricht te lokaliseren, manipuleer het dijbeen om het draaipunt te identificeren en gebruik de schaar om het been boven het heupgewricht af te snijden, waarbij de proximale kop van het dijbeen intact blijft.Verwijder zoveel mogelijk spier- en bindweefsel van het been en plaats de gereinigde botten in een petrischaal met steriel RPMI gesupplementeerd met antibiotica op ijs. Gebruik na het oogsten van de tweede set beenderen gesteriliseerde pincetten en een nummer tien mes om eventueel resterend spier- en bindweefsel te verwijderen. Breng de gereinigde botten over naar een lege petrischaal en gebruik het scalpel om beide uiteinden van elk scheenbeen te verwijderen om toegang te krijgen tot het beenmerg.Gebruik pincetten om één scheenbeen over de mond van een 50 milliliter conische buis op ijs te plaatsen en steek de punt van een 25 gauge naald, bevestigd aan een 10 milliliter spuit gevuld met mediums gesupplementeerd met antibiotica, in één uiteinde van het scheenbeen. Spoel ongeveer vijf tot 10 milliliter medium door het bot in de conische buis totdat al het rode beenmergweefsel is geoogst en het bot er wit uitziet. Wanneer al het beenmerg is verzameld, centrifugeert u het gepoolde beenmerg en suspendeert u het beenmergcellenpalet in vijf milliliter beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium.Breng de beenmergcellensuspensie over in een 175 vierkante centimeter celkweekkolf met 60 milliliter steriel beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium en spoel de buis twee keer met medium van de kweekkolf om maximale celrecuperatie te garanderen. Breng na de tweede spoeling een 30 milliliter aliquot van cellen over in een tweede 175 vierkante centimeter celkweekkolf en sluit elke kolf met een filterdop. Incubeer vervolgens beide culturen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de residente macrofagen te scheiden van eventuele besmettende fibroblasten of andere adhesieven cellen.De volgende ochtend brengt u 10 milliliter ongedifferentieerd beenmergcellen-bevattend supernatant van elke kolf over in afzonderlijke 100 bij 15 millimeter niet-weefselcultuurbehandelde polystyreen petrischalen en brengt u de cellen terug in de celkweekincubator voor nog twee tot drie dagen. Voer vervolgens de culturen met vijf milliliter vers 37 graden Celsius beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium per schaal en breng de schalen terug naar de incubator. Op dag zeven of acht na de kweek gebruikt u een aspiratietip die is aangesloten op een vacuümlijn om vier geautoclaveerde gesteriliseerde 12 millimeter glazen deksels over te brengen naar de bodem van elke put van een zes-putten kweekplaat zonder overlapping.Bereid identieke platen voor voor elk tijdstip van het experiment. Was vervolgens de beenmerg-gemedieerde macrofagenculturen twee keer met vers 37 graden Celsius PBS en vijf milliliter PBS zonder calcium en magnesium gesupplementeerd met één millimolair EDTA naar elke plaat. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, verzamel de losgekomen cellen in een 50 milliliter conische buis, spoel elke plaat twee keer met een aanvullende vijf milliliter PBS zonder calcium en magnesium.Na centrifugatie, re-suspendeer de macrofagen in vijf tot 10 milliliter vers beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium op ijs. Na het tellen, verdun de cellen tot vijf maal 10 tot de vijfde per milliliter concentratie in vers beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium, en voeg twee milliliter cellen per put toe aan de zes-putten plaat. Incubeer vervolgens de cellen een nacht in de celkweekincubator.Om de cellen te infecteren met L.amazonesis, verdunt u de parasietensuspensie tot de geschikte experimentele infectiviteit en voegt u 50 tot 100 microliter parasieten toe aan elke put van alle zes-putten platen, inclusief alle tijdstippen van het experiment. Incubeer de beenmerg-gemedieerde macrofagen voor de geschikte infectieperiode en temperatuur. Was vervolgens de putten drie keer met twee milliliter vers 37 graden Celsius PBS zonder calcium of magnesium per put en fixeer de monsters van het begintijdstip met 1,5 tot 2 milliliter 2% paraformaldehyd gedurende 10 minuten.Voor de platen die overeenkomen met de latere tijdstippen, voegt u twee milliliter vers beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium toe aan elke put en brengt u de platen terug naar de geschikte incubator. Fixeer en was vervolgens de cellen voor elk van de resterende tijdstippen, zoals zojuist is aangetoond, en bewaar de monsters bij vier graden Celsius in vers PBS. Om de cellen met DAPI te kleuren, vervangt u het supernatant door 1,5 milliliter vers PBS zonder calcium en magnesium, gesupplementeerd met 0,

quantification-intracellular-growth-inside-macrophages-is-fast

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt om kwantitatieve metingen te genereren van muisinfecties met de Trypanosomatide protozoa Leishmania. Dit is een niet-invasieve en niet-lethale methode voor het detecteren van parasieten die luciferase tot expressie brengen in diverse weefsels gedurende het verloop van een chronische Leishmania spp. infectie.

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen...

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

This video investigates Leishmania's virulence by treating macrophages with metacyclic promastigotes, resulting in the formation of intracellular amastigotes. The confirmation of Leishmania's virulence is achieved through nucleic acid fluorescent dye staining. This insight can contribute to the development of new therapies for leishmaniasis.

Assessment of Leishmania Virulence within Cultured Macrophages

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Hier presenteren we een samengesteld protocol om de cutane infectie van muizen met Leishmania amazonensiste evalueren. Dit is een betrouwbare methode voor het bestuderen van parasietvirulentie, waardoor een systemische weergave van de gewervelde gastheer respons op de infectie.

In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Hier presenteren we een longitudinale evaluatie van goudhamsters die intraperitoneaal (IP) of via intragingivaal (IG) zijn geïnfecteerd met L. infantum-Luc door middel van bioluminescente beeldvorming en door PCR. Hamsters werden 1 dag na infectie (1 dpi), 1 week na infectie (8 dpi) en 3 weken na infectie (22 dpi) geëvalueerd en geëuthanaseerd op de 50edpi en 8 maanden na infectie.

In vivo Beeldvorming van met Leishmania infantum geïnfecteerde hamsters door gingiva-inoculatie van axenische amastigoten die luciferase tot expressie brengen

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen...

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Leer hoe je intracellulaire groei van Leishmania in muizenmacrofagen kwantificeert om parasietvirulentie te beoordelen. Deze snelle, betrouwbare methode vermindert dierproeven en helpt bij het ontwikkelen van therapieën.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

Meer video's verkennen