Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten
16 maart 2018
Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.
Het algemene doel van dit experiment is om de virulentie van verschillende Leishmania-stammen te beoordelen door middel van infectie van muis-gemedieerde beenmergmacrofagen in vitro en de daaropvolgende kwantificering van de intracellulaire groeikinetiek van parasieten. Deze methode kan ons helpen antwoorden te geven op belangrijke vragen over de factoren van zowel de macrofaag van de gastheer als de ziekteverwekker die de virulentie van de infectieuze Leishmania-parasieten bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een snelle, economische en betrouwbare methode is die aanzienlijk minder dieren vereist in vergelijking met in vivo-studies.
De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van leishmaniasis, omdat het kan worden gebruikt om de besmettelijkheid van gemuteerde Leishmania-stammen of de werkzaamheid van therapeutische verbindingen te beoordelen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de isolatie van beenmerg-gemedieerde macrofagen en de kwantificering van intracellulaire parasieten moeilijk te leren zijn uit geschreven protocollen alleen. Begin met het vastzetten van een vrouwelijke muis van vier tot zes weken oud op een dissectiebord en desinfecteer het dier met 70% ethanol.
Gebruik een schaar om een snede van een centimeter te maken nabij één heupgewricht en snijd de huid helemaal rond het gewricht. Trek de huid van het been naar de enkel om voorzichtig het been te ontdoen van de huid en snijd het voetgedeelte af bij of onder de enkelgewricht om het scheenbeen intact te laten. Om het heupgewricht te lokaliseren, manipuleer het dijbeen om het draaipunt te identificeren en gebruik de schaar om het been boven het heupgewricht af te snijden, waarbij de proximale kop van het dijbeen intact blijft.
Verwijder zoveel mogelijk spier- en bindweefsel van het been en plaats de gereinigde botten in een petrischaal met steriel RPMI gesupplementeerd met antibiotica op ijs. Gebruik na het oogsten van de tweede set beenderen gesteriliseerde pincetten en een nummer tien mes om eventueel resterend spier- en bindweefsel te verwijderen. Breng de gereinigde botten over naar een lege petrischaal en gebruik het scalpel om beide uiteinden van elk scheenbeen te verwijderen om toegang te krijgen tot het beenmerg.
Gebruik pincetten om één scheenbeen over de mond van een 50 milliliter conische buis op ijs te plaatsen en steek de punt van een 25 gauge naald, bevestigd aan een 10 milliliter spuit gevuld met mediums gesupplementeerd met antibiotica, in één uiteinde van het scheenbeen. Spoel ongeveer vijf tot 10 milliliter medium door het bot in de conische buis totdat al het rode beenmergweefsel is geoogst en het bot er wit uitziet. Wanneer al het beenmerg is verzameld, centrifugeert u het gepoolde beenmerg en suspendeert u het beenmergcellenpalet in vijf milliliter beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium.
Breng de beenmergcellensuspensie over in een 175 vierkante centimeter celkweekkolf met 60 milliliter steriel beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium en spoel de buis twee keer met medium van de kweekkolf om maximale celrecuperatie te garanderen. Breng na de tweede spoeling een 30 milliliter aliquot van cellen over in een tweede 175 vierkante centimeter celkweekkolf en sluit elke kolf met een filterdop. Incubeer vervolgens beide culturen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de residente macrofagen te scheiden van eventuele besmettende fibroblasten of andere adhesieven cellen.
De volgende ochtend brengt u 10 milliliter ongedifferentieerd beenmergcellen-bevattend supernatant van elke kolf over in afzonderlijke 100 bij 15 millimeter niet-weefselcultuurbehandelde polystyreen petrischalen en brengt u de cellen terug in de celkweekincubator voor nog twee tot drie dagen. Voer vervolgens de culturen met vijf milliliter vers 37 graden Celsius beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium per schaal en breng de schalen terug naar de incubator. Op dag zeven of acht na de kweek gebruikt u een aspiratietip die is aangesloten op een vacuümlijn om vier geautoclaveerde gesteriliseerde 12 millimeter glazen deksels over te brengen naar de bodem van elke put van een zes-putten kweekplaat zonder overlapping.
Bereid identieke platen voor voor elk tijdstip van het experiment. Was vervolgens de beenmerg-gemedieerde macrofagenculturen twee keer met vers 37 graden Celsius PBS en vijf milliliter PBS zonder calcium en magnesium gesupplementeerd met één millimolair EDTA naar elke plaat. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, verzamel de losgekomen cellen in een 50 milliliter conische buis, spoel elke plaat twee keer met een aanvullende vijf milliliter PBS zonder calcium en magnesium.
Na centrifugatie, re-suspendeer de macrofagen in vijf tot 10 milliliter vers beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium op ijs. Na het tellen, verdun de cellen tot vijf maal 10 tot de vijfde per milliliter concentratie in vers beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium, en voeg twee milliliter cellen per put toe aan de zes-putten plaat. Incubeer vervolgens de cellen een nacht in de celkweekincubator.
Om de cellen te infecteren met L.amazonesis, verdunt u de parasietensuspensie tot de geschikte experimentele infectiviteit en voegt u 50 tot 100 microliter parasieten toe aan elke put van alle zes-putten platen, inclusief alle tijdstippen van het experiment. Incubeer de beenmerg-gemedieerde macrofagen voor de geschikte infectieperiode en temperatuur. Was vervolgens de putten drie keer met twee milliliter vers 37 graden Celsius PBS zonder calcium of magnesium per put en fixeer de monsters van het begintijdstip met 1,5 tot 2 milliliter 2% paraformaldehyd gedurende 10 minuten.
Voor de platen die overeenkomen met de latere tijdstippen, voegt u twee milliliter vers beenmerg-gemedieerde macrofagenmedium toe aan elke put en brengt u de platen terug naar de geschikte incubator. Fixeer en was vervolgens de cellen voor elk van de resterende tijdstippen, zoals zojuist is aangetoond, en bewaar de monsters bij vier graden Celsius in vers PBS. Om de cellen met DAPI te kleuren, vervangt u het supernatant door 1,5 milliliter vers PBS zonder calcium en magnesium, gesupplementeerd met 0,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het infecteren van uit murine beenmerg afgeleide macrofagen met Leishmania om de intracellulaire groeikinetiek te kwantificeren. Deze methode helpt bij het begrijpen van gastheer-pathogeeninteracties en de virulentie van Leishmania.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Immunologie
- Pathogeen-gastheerinteracties
Achtergrond
- Leishmania-soorten repliceren binnen macrofagen van gewervelde gastheren.
- Het begrijpen van virulentiefactoren is cruciaal voor de ontwikkeling van therapieën.
- In vitro-methoden verminderen de noodzaak van diermodellen.
- Visuele demonstraties verbeteren het leren van complexe technieken.
Doel van de studie
- Om de virulentie van verschillende Leishmania-stammen te beoordelen.
- Om de intracellulaire groeikinetiek van de parasieten te kwantificeren.
- Om gastheer- en pathogeenfactoren die de virulentie beïnvloeden te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van uit het beenmerg afgeleide macrofagen van muizen.
- Infectie van macrofagen met Leishmania-stammen.
- Kwantificering van de intracellulaire parasietgroei.
- Visuele demonstratie van het protocol voor de duidelijkheid.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle infectie van macrofagen met diverse Leishmania-stammen.
- Kwantitatieve gegevens over intracellulaire groeikinetiek verkregen.
- Inzichten in factoren die de virulentie van Leishmania beïnvloeden.
- Methode is bewezen efficiënt en betrouwbaar voor onderzoek.
Conclusies
- Het protocol is een waardevol instrument voor het bestuderen van de virulentie van Leishmania.
- Het kan de beoordeling van therapeutische verbindingen vergemakkelijken.
- Het vermindert de afhankelijkheid van in vivo studies, wat ethisch onderzoek bevordert.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze in vitro macrofaaginfectie-assay biedt een snel en kosteneffectief alternatief voor diermodellen om de virulentie van Leishmania te evalueren, wat vroege target-validatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van antiparasitaire geneesmiddelen mogelijk maakt. Door de kinetiek van de intracellulaire parasitaire groei te kwantificeren, ondersteunt de methode de voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van lead-verbindingen en portfolio-triage voor verbindingen die gericht zijn op interacties tussen gastheer en pathogeen. De reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de assay faciliteren cross-functionele samenwerking tussen teams voor discovery biology, assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door genetische factoren (bijv. LMIT1-deletie) te koppelen aan defecten in de intracellulaire replicatie en attenuatie van de virulentie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets via kwantitatieve meting van de overleving en replicatie van de parasiet binnen ziekte-relevante menselijke macrofaagsurrogaten.
- Voorspellende waarde: Genereert dosis-respons- en tijdverloopgegevens die bijdragen aan mechanische risicoreductie en prioritering van targets die essentieel zijn voor intracellulaire overleving.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde, kwantificeerbare output (intracellulaire parasietenaantallen met intervallen van 24u) geschikt voor high-content screening en hit-validatie.
- Reproduceerbaarheid: Gedefinieerde MOI-controles en gesynchroniseerde infectietiming zorgen voor consistente resultaten over experimenten en laboratoria heen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well plaatformaten, wat parallelle evaluatie van verbindingenbibliotheken of genetische mutanten onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk maakt.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Maakt gebruik van uit beenmerg afgeleide macrofagen om de gastheernis van vertebraten te modelleren waarin Leishmania persisteert, wat de translationele getrouwheid verhoogt.
- Preklinische continuïteit: Verbindt vroege target hits met fenotypische uitkomsten in een pathogeen relevant systeem, wat go/no-go-beslissingen ondersteunt voorafgaand aan in vivo validatie.
- Afstemming op biomarkers: De intracellulaire parasitaire last dient als een directe, mechanistisch gekoppelde readout voor het beoordelen van de effectiviteit van verbindingen en target engagement.
Integratie van Pipeline en Workflow
De assay past binnen het discovery-continuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische effectiviteit, en vormt een brug tussen biochemische screening en studies met diermodellen door fenotypische validatie te leveren in een ziekterelatieve cellulaire context.
- Discoverybiologie: Faciliteert hypothese-gestuurde analyse van virulentiefactoren en gastheer-pathogeeninteracties via gecontroleerde manipulatie van de genetica van de parasiet en de omstandigheden van de gastheer.
- Screening: Levert kwantitatieve, op microscopie gebaseerde read-outs die assay-standaardisatie en compound-screening in 6-well of hogere-densiteitsformaten mogelijk maken.
- Analytics: Genereert gegevens over groeikinetiek (parasietcounts over tijd) die EC50/IC50-berekeningen en statistische vergelijking van virulentiefenotypes ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van primaire muis-macrofagen om de menselijke infectiebiologie te modelleren, wat extrapolatie naar preklinische studies ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van meerdere Leishmania-stammen, mutanten of therapeutische kandidaten onder gedefinieerde condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door genetische of farmacologische perturbaties direct te koppelen aan defecten in de intracellulaire replicatie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor macrofaagisoolatie, infectie en fixatie, waardoor variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de afhankelijkheid van kostbare en tijdrovende diermodellen voor vroege virulentiebeoordeling te verminderen.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gevalideerde intracellulaire effectiviteit, waardoor het risico op falen in een laat stadium afneemt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celcultuur, aseptische technieken en fluorescentiemicroscopie voor een nauwkeurige kwantificering van parasieten.
- Afhankelijk van toegang tot biologische veiligheidskabinetten, centrifuges, fluorescentiemicroscopen en gestandaardiseerde reagentia (DAPI, PBS, paraformaldehyde).
- Vereist cross-team standaardisatie van de MOI-berekening, de timing van infectie en de kwantificatiecriteria om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpassing aan menselijke macrofaagmodellen of iPSC-afgeleide systemen kan nodig zijn voor een verbeterde menselijke relevantie in screeningsfasen in een later stadium.
- Beperkt tot kwantificering van eindpunten en tijdspunten; real-time imaging zou aanvullende optimalisatie vereisen voor compatibiliteit met levende cellen.
