Name: Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer een robuuste methode voor de productie van native, labelvrije Huntingtin Exon1 monomeren en fibrillen met behulp van een SUMO-fusiestrategie. Deze eenvoudige en reproduceerbare protocol vereenvoudigt structurele en functionele studies van dit aggregatiegevoelige eiwit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de CHDI-Stichting en de Zwitserse National Science Foundation. Wij danken Dr. Sophie Vieweg voor nuttige discussies tijdens de ontwikkeling van dit nieuwe systeem van de expressie en andere leden van de groep van de Lashuel voor het delen van hun ervaringen met dit systeem van expressie en voor hun input en waardevolle feedback. Wij danken ook Prof. Oliver Hantschel voor het verstrekken van de ULP1-plasmide. De auteurs bedanken Dr. John B. Warner en Dr. Senthil K. Thangaraj voor de kritische evaluatie van het manuscript

<ol><li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Biology of Huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14528049">Huntington's disease.</a> Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).</li>
<li>Li, S., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+contribute+to+the+pathogenesis+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 1, 19(2006).</li>
<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Georgalis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+monitored+by+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
<li>Muchowski, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+hsp40+chaperones+can+inhibit+self-assembly+of+polyglutamine+proteins+into+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).</li>
<li>Heiser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+huntingtin+fibrillogenesis+by+specific+antibodies+and+small+molecules%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).</li>
<li>Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+nuclear+or+cytoplasmic+protein+aggregates+precedes+inclusion+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation.</a> Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).</li>
<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
<li>Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+Hsp40+attenuate+formation+of+spherical+and+annular+polyglutamine+oligomers+by+partitioning+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+fragments+form+oligomers+in+a+polyglutamine+length-dependent+manner+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).</li>
<li>Nucifora, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+potentially+toxic+oligomers+formed+in+vitro.+from+mammalian-derived+expanded+huntingtin+exon-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).</li>
<li>Dahlgren, P. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17292058">Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation.</a> Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).</li>
<li>Poirier, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+spheroids+and+protofibrils+as+precursors+in+polyglutamine+fibrilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).</li>
<li>Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction+imaging+of+huntingtin+protein+aggregates+by+fluorescence+blink-microscopy+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy.</a> Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).</li>
<li>Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+alpha-synuclein+and+huntingtin+exon+1+assemblies+are+toxic+to+the+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells.</a> Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).</li>
<li>Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+between+the+chaperone+Hsc70+and+the+N-terminal+flank+of+huntingtin+exon+1+modulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).</li>
<li>Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+Nuclear+Magnetic+Resonance+on+the+Static+and+Dynamic+Domains+of+Huntingtin+Exon-1+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils.</a> Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).</li>
<li>Malakhov, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+fusions+and+SUMO-specific+protease+for+efficient+expression+and+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Function+Genomics%22%5BJournal%5D)">SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.</a> Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).</li>
<li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).</li>
<li>Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+X-ray+Diffraction+Dataset+for+Bacillus+licheniformis+Gamma+Glutamyl+Transpeptidase-acivicin+complex%3A+SUMO-Tag+Renders+High+Expression+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Journakl%22%5BJournal%5D)">High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility.</a> Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Production+and+Characterization+of+SAC%2C+the+Core+Domain+of+Par-4%2C+by+SUMO+Fusion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).</li>
<li>Reif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semisynthesis+of+biologically+active+glycoforms+of+the+human+cytokine+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).</li>
<li>Smith, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20512673">SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).</li>
<li>Lawrence, A. M., Besir, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+proteins+in+gels+with+Coomassie+G-250+without+organic+solvent+and+acetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19892187">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Chen, S. M., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+from+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li>
<li>O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).</li>
<li>Greenfield, N. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15063655">Analysis of circular dichroism data.</a> Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).</li>
<li>Aiken, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+threonine+3%3A+implications+for+Huntingtin+aggregation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).</li>
<li>Satakarni, M., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+peptides+as+fusions+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant peptides as fusions with SUMO.</a> Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).</li>
<li>Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+aortic+amyloid+polypeptide+medin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin.</a> Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).</li>
<li>Chen, S., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse met de inhoud van dit artikel hebben.

In dit protocol, we hebben geschetst een efficiënte procedure voor verkrijging milligram hoeveelheden native, gecodeerde Httex1 23 of 43 glutamine residuen bevatten. Dit werd bereikt door het uiten van Httex1 als een fusie van de C-terminal een zijn6-SUMO tag, die wordt gebruikt voor het isoleren van de fusieproteïne uit de cel lysate door IMAC en gekloofd is vóór HPLC zuivering van Httex1. Terwijl de SUMO-strategie is gebruikt in de productie van verschillende andere eiwitten, onze methode laat zien dat de unieke eigenschappen die Sumo kan ook worden gebruikt voor het genereren van intrinsiek ontregelde, aggregatie-gevoelig, amyloidogenic eiwit dat reeds eerder is aangetoond te worden moeilijk te hanteren en43,44te produceren. We presenteren een protocol dat is ongecompliceerd, makkelijk te gebruiken en vergelijkbaar met een protocol voor het genereren van een "goedgedragende" eiwit. De SUMO fusion Lost en stabiliseert Httex1 tijdens de expressie en de zuivering van de IMAC. Voortijdige splijten van de tag, zoals waargenomen met de intein strategie10 en aggregatie waren niet langer een probleem.
Intrinsiek ongeordende eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor afbraak. Terwijl de aantasting van het N-terminaal N17 regio niet een probleem met behulp van dit protocol is, kunnen opschoningen in de PRD van Httex1 optreden. Als de afgekapte eiwitten zijn zeer gelijkaardig aan de Httex1 in hydrophobicity, lading en grootte, ze te verwijderen met chromatografische middelen is uitdagend, dus het is best om te voorkomen dat hun vorming in de eerste plaats. Steken nauw bij het protocol, altijd bezig met ijs en met behulp van een voldoende hoeveelheid proteaseinhibitor moeten helpen het niveau van waargenomen afkappen zeer laag houden. Toepassing van een fusie-tag in het C-terminus van Httex1 kon verwijderen opschoningen in de PRD gemakkelijk als de afgekapte proteïne evenals de affiniteit tag zou verliezen. Echter, als de oorspronkelijke volgorde worden gehandhaafd dat met deze optie kan niet worden toegepast moet als Httex1 met proline en tot de beste van onze kennis eindigt er zijn geen C-terminal fusion labels waarvan bekend is dat het induceren van spoorloze en efficiënte decolleté na proline.
Het meest kritische deel van het protocol is de behandeling van de Httex1 bevrijd na de splitsing van de SUMO-tag door ULP1. Het eiwit moet onmiddellijk worden gezuiverd door RP-HPLC. Gelukkig is dit een efficiënte en snelle reactie, dat is meestal voltooid in 10-20 min bij 4 ° C. De intein strategie vereist daarentegen enkele uren voor volledige splitsing van de intein, waarvoor derhalve een trade-off tussen onvolledig decollete en begin aggregatie te maximaliseren van het rendement. Een snelle workup is vereist voor mutant Httex1, zoals op zal voorsprong bijeen te voegen op de relatief hoge concentratie aanwezig in de reactie van het decollete, overwegende dat de 23Q variant voor een langere tijd stabiel is. Tijdens de RP-HPLC-zuivering, een ander voordeel van SUMO wordt duidelijk: terwijl de Ssp DnaB intein hydrofoob is en sterk naar de kolom stokken, SUMO is meer hydrofiele en GC volledig uit de C4 reversed-phase kolom. Commerciële ULP1 weliswaar vrij kostbaar is, kan het eiwit gemakkelijk worden geproduceerd in hoog rendement na eerder gepubliceerde protocollen29.
Het cruciale belang van de toepassing van een protocol aggregatieniveau voorafgaand aan het gebruiken van de Httex1 kan niet genoeg benadrukt. Gelyofiliseerd polyQ eiwitten zoals Httex1 kunnen zijn stabiel en opgeslagen lange periodes, maar zijn niet volledig oplosbaar zijn in water en buffers. De aanwezigheid van voorgevormde oligomeren of fibrillen kan een belangrijke impact hebben op aggregatie kinetiek en biofysische eigenschappen van de eiwit-45. Het aggregatieniveau protocol hier beschreven kan het aggregatieniveau van het eiwit, verwijdering van voorgevormde aggregaten en generatie van een oplossing van de monomeer Httex1 uit een gelyofiliseerd monster. We waargenomen soortgelijke aggregatie kinetiek en fibril morfologie voor Httex1 verkregen met de SUMO en de strategie van de intein.
Vergeleken met vorige methoden voor de productie van Httex1, de SUMO-strategie zoals hier beschreven biedt verschillende voordelen en breidt het bereik van mogelijke studies te onderzoeken van de structuur en functionele eigenschappen van dit eiwit in gezondheid en ziekte. De fusieproteïne SUMO-Httex1 is gemakkelijk te hanteren, kan worden ingevroren en opgeslagen of bewaard in de oplossing gedurende 24 uur bij omgevingstemperatuur, terwijl de vrije mHttex1 snel zou aggregaat. De stabiliteit en de hoge oplosbaarheid van de SUMO-Httex1 fusion eiwitten bieden meer flexibiliteit te manipuleren van de eiwitten en/of enzymatische en chemische wijzigingen in mHttex1 die anders niet mogelijk na splitsing zijn zou invoeren. Dit omvat de invoering van posttranslationele modificaties, fluorophores, spin etiketten, Biotine tags, etc. moeten de vooruitgang hier gepresenteerd 1) vergemakkelijken van toekomstige studies om te verhelderen structuur-functie relaties van Httex1; 2) het genereren van nieuwe hulpmiddelen om te onderzoeken Htt aggregatie en pathologie zich kan verspreiden; 3) stellen de ontwikkeling van nieuwe testen te identificeren van moleculen die mutant Httex1 te stabiliseren en te voorkomen dat de samenvoeging; en 4) moedigen wetenschappers uit andere velden om te werken aan dit eiwit en Word lid van onze zoektocht naar behandelingen voor de ziekte van Huntington.

Htt is een 348 kDa proteïne en is betrokken bij verschillende fysiologische functies1. Wanneer Htt een uitgebreide polyQ regio van meer dan 36 residuen in de N-terminus bevat, veroorzaakt het HD2,3. HD-pathologie wordt gekenmerkt door cellulaire inclusies in het striatum en cortex, wat tot neuronale dood en atrofie van de aangetaste weefsels4,5 leidt. Diverse N-terminale Htt fragmenten die de polyQ herhalen tractus bevatten in post mortem hersenen van HD patiënten zijn gedetecteerd en worden verondersteld te worden gegenereerd door Proteolytische verwerking van het eiwit huntingtin6. Recente studies suggereren dat Httex1 ook vanwege afwijkende mRNA-splicing kon worden gevormd. Httex1 bevat de pathologische polyQ mutatie en haar overexpressie bij dieren kan veel van de belangrijkste functies van HD7, dus het markeren van een mogelijke centrale rol van dit fragment in HD pathologie en ziekte progressie6, recapituleren 8,9.
Als gevolg van de hoge aggregatie neiging van mutant Httex1 (mHttex1) met uitgebreide polyQ-darmkanaal, het merendeel van de bestaande expressiesystemen zijn gebaseerd op de voorbijgaande fusie van Httex1 aan eiwitten (zoals de glutathion-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) of maltose-bindend-proteïne (MBP) en/of peptiden (poly-histidine) die differentieel de expressie, stabiliteit, zuivering en/of oplosbaarheid10,11,12,13,14 verbeteren ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. De fusie partner is gekoppeld aan Httex1 met een korte opeenvolging met een breukzijde voor proteasen zoals trypsine, tabak etch virus (TEV) protease- of PreScission met het oog op het decolleté en de introductie van Httex1 vóór de inleiding van aggregatie of zuivering. Tekortkomingen van deze methoden omvatten de mogelijkheid van het verlaten van de extra residuen als gevolg van niet-spoorloze splijten en de oprichting van afgeknotte fragmenten als gevolg van de miscleavage binnen de volgorde van de Httex1, naast de heterogeniteit als gevolg van onvolledige splitsingsproducten ( Zie Vieweg, et al. voor meer diepgaande discussie over de voordelen en beperkingen van deze aanpak)10. Om aan deze beperkingen, strategie wij onlangs een expressie waarmee de generatie van inheemse tag-vrije Httex1 voor de eerste keer met behulp van een voorbijgaande N-terminale fusie van de Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein tot Httex110. Terwijl het intein splijten spoorloze en specifieke en mg hoeveelheid eiwitten levert, het nog steeds lijdt twee nadelen die de opbrengst verminderen kunnen: namelijk voorbarig splitsing van de intein die zich tijdens de expressie, en het feit dat splitsing vindt plaats voordoen kan via enkele uren, die tot verlies van eiwitten door aggregatie, vooral voor Httex1 met uitgebreide polyQ herhaalt leiden kunnen.
Inspelen op deze beperkingen en verfijnen van onze strategie voor de productie van native, tag-vrije Httex1, wij een nieuwe expressie systeem ontwikkeld op basis van de voorbijgaande fusie van SUMO, meer precies de gist homolog Smt3 te Httex1. De toepassing van de SUMO-systeem voor de productie van recombinante eiwitten werd voor het eerst gepubliceerd in 200429, waar een verhoogd tarief van meningsuiting en de oplosbaarheid van SUMO fusieproteïne werd aangetoond. De SUMO-tag kan worden cleaved door de ubiquitin als eiwit-specifieke protease 1 (ULP1), die hoeft niet een erkenning site, maar herkent de tertiaire structuur van SUMO en vrijwel elimineert de mogelijkheid van miscleavage30. Bovendien, het ULP1-gemedieerde splijten is snel en spoorloze en laat geen extra residuen achter. Het voorbarig splijten van de fusion-tag, wordt zoals waargenomen met de autocatalytic intein10, volledig vermeden door de eis van een externe protease. Terwijl de SUMO-strategie tegenwoordig veel voor recombinant eiwit productie31,32,33 gebruikt wordt, we het in dit document laten zien dat het vooral nuttig voor het genereren van een intrinsiek ongeordende is, aggregatie-gevoelig, amyloidogenic eiwitten zoals Httex1. Wij zijn van mening dat de eenvoud, de efficiëntie en de degelijkheid van onze SUMO fusion-gebaseerde methode zal native, tag-vrije Httex1 meer toegankelijk voor onderzoekers uit verschillende disciplines maken en de noodzaak elimineren om het gebruik van uitheemse sequenties van Httex1 in vitro . Dit is een belangrijke stap vooruit dat toekomstige studies om te verhelderen van de structuur-functie relatie van Httex1 zal vergemakkelijken.
Het protocol beschrijft de zuivering van Httex1 van 12 L van bacteriële cultuur, maar het protocol zou kunnen gemakkelijk worden aangepast voor kleinere of grotere schaal producties. Het protocol beschrijft de productie van wild type Httex1 (wtHttex1) met een polyQ herhalen lengte hieronder (23Q) en mutant Httex1 (mHttex1) met een polyQ Herhaal lengte boven (43Q) de pathogene drempel (36Q).

<table><tbody><tr><td>Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (Miller's LB Broth)</td><td>&nbsp;Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp;Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 column&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168.P0</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 &micro;m C4 300 &Aring;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer semi-micro cuvette</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, 1/16" fittings (&Auml;KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;100 kD Microcon&nbsp; fast flow filters</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;kta 900 equipped with a fraction collector&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Circular Dichroism</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC system&nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&nbsp;, preheated column (40 &deg;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &mu;L</td></tr><tr><td>waters HPLC system</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lyophylizer instrument</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td></tr><tr><td>37 &deg;C shaking&nbsp; incubator</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van eigen, niet-gecodeerde huntingtin exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een sumo fusion strategie

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

De ziekte van Huntington (HD) is een erfelijke fatale neurodegeneratieve ziekte veroorzaakt door een CAG uitbreiding (≥36) in de eerste exon van het HD-gen, resulterend in de expressie van het eiwit Huntingtin (Htt) of N-terminale fragmenten daarvan met een uitgebreide polyglutamine ( polyQ) stuk.
De exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) is de kleinste Htt-fragment dat veel van de functies van HD in mobiele recapituleert en dierlijke modellen en is een van de meest bestudeerde fragmenten van Htt. De kleine grootte van Httex1 maakt het experimenteel meer vatbaar voor biofysische karakterisering met behulp van standaard en hoge resolutie technieken in vergelijking met langere fragmenten of full-length Htt. Echter, de hoge aggregatie neiging van mutant Httex1 (mHttex1) met verhoogde polyQ inhoud (≥42) heeft het moeilijk gemaakt om efficiënte expressie en reinigingssystemen te produceren van deze eiwitten in voldoende hoeveelheden en toegankelijk te maken wetenschappers uit verschillende disciplines zonder het gebruik van fusie-eiwitten of andere strategieën die gevolgen hebben voor de oorspronkelijke volgorde van het eiwit. Wij presenteren hier een robuust en geoptimaliseerde methode voor de productie van milligram hoeveelheden voor native, tag-gratis Httex1 op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO). De eenvoud en efficiëntie van de strategie zal elimineren de noodzaak om het gebruik van uitheemse sequenties van Httex1, dus dit eiwit meer toegankelijk maken voor onderzoekers en het verbeteren van de reproduceerbaarheid van experimenten in verschillende laboratoria. Wij zijn van mening dat deze vooruitgang ook toekomstige studies gericht op het ophelderen van de structuur-functie relatie van Htt evenals ontwikkelende nieuwe diagnostische hulpprogramma's en therapieën te behandelen of te vertragen de progressie van HD zal vergemakkelijken.

Httex1 wordt uitgedrukt in E. coli met een N-terminal zijn-6-SUMO label. De representatieve resultaten van de expressie en de zuivering van de fusieproteïne worden samengevat in Figuur 1. De volgorde van de Httex1 bestaat uit 2-90 residuen van Htt en begint met Ala2, omdat Met1 volledig gekloofd in vivo42 is. De nummering van de aminozuren verwijst naar de 23Q-variant, de volledige sequentie van de geuite fusieproteïne is getoond in Figuur 1A. De plasmiden worden gestort op Addgene in de nabije toekomst te delen met de Gemeenschap. Een schematische voorstelling van de plasmide en de geuite fusieproteïne is afgebeeld in Figuur 1B. His6-SUMO Httex1 spreekt op een gemiddeld beveiligingsniveau (Figuur 1C) en de meeste van de fusieproteïne is aanwezig in de oplosbare fractie na lysis, zowel voor de 23Q en de 43Q variant. De fusieproteïne migreert hoger dan verwacht, op basis van het molecuulgewicht. Dit is deels te wijten aan de sterke vouw van SUMO maar vooral te wijten aan de samenstelling van de ongebruikelijke volgorde van Httex1, die voornamelijk glutamine en proline residuen bevatten. Zowel de wildtype (23Q) en de mutant (43Q) fusieproteïne ~ 80% zuiverheid kan worden verrijkt door IMAC (Figuur 1D) de aanwezigheid van co zuiveren host eiwit kan worden verklaard door het relatief lage expressie niveau van Httex1 en de grote steekproef het volume wordt toegepast op de kolom.
Het splijten van het zijn6-SUMO tag en de zuivering van Httex1 wordt getoond in Figuur 2. UPLC is een efficiënt hulpmiddel voor de monitoring van de splitsing van de zijn6-SUMO label (Figuur 2B). De oorspronkelijke piek van het fusie-eiwit wordt verbruikt en twee nieuwe en goed gescheiden bergtoppen overeenkomt de zijn6-SUMO tag en Httex1 verschijnen. De splijting reactie is afgewerkt in 10-20 min. De Western Blot (WB) is te traag om te controleren de splitsingsproducten reactie efficiënt, maar het is opgenomen in de afbeelding ter referentie en om aan te tonen van de volledigheid van het SUMO splijten. Beide Httex1 23Q en 43Q kunnen worden gescheiden van het zijn goed6-SUMO tag door RP-HPLC (Figuur 2C) en werden verkregen in hoge zuiverheid, zoals blijkt uit de UPLC, MS en SDS-pagina analyse (Figuur 2D).
Om te illustreren dat de proteïnen van de Httex1 bereid door deze methode blijven de eigenschappen van de verwachte aggregatie van Httex1, we de kinetiek van de fibrillization van mutant Httex1 bij 37 ° C beoordeeld door een sedimentatie assay, bewaakt de wijzigingen in de secundaire structuur door CD spectroscopie, en de morfologie van de aggregaten door TEM gekenmerkt. Een representatieve gegevensset van de kinetiek van de aggregatie van de vorming van de fibril van de mHttex1 zoals bepaald door een sedimentatie assay is afgebeeld inFiguur 3A. Het verlies van oplosbare Httex1 43Q na verloop van tijd ontstaan door de vorming van de fibril werd gekwantificeerd door UPLC. We zien een volledige uitputting van oplosbaar eiwit na 48 uur incubatie. Daarnaast vastgesteld we de secundaire structuur van de eiwitten door CD spectroscopie (Figuur 3B). Httex1 43Q verschuivingen van ongestructureerde (λmin 205 nm) naar voornamelijk β-sheet rijke conformatie (λmin 215 nm) na 48 uur incubatie. Deze structurele wijziging gaat gepaard met de vorming van de lange fibrillar aggregaten als waarneembare door TEM 48 uur (Figuur 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figuur 1 . Meningsuiting en zuivering van de zijn6-SUMO Httex1 fusieproteïne.  (A) de volgorde van de aminozuur van het zijn6-SUMO-Httex1-QN fusion constructies (zijn6-SUMO in groen en Httex1-QN in oranje); (B) schematisch overzicht van de expressie en de zuivering van de fusieproteïne; (C) SDS-pagina-analyse van de expressie en de oplosbaarheid van de fusieproteïne na lysis; (D) Chromatogram van de IMAC zuivering van de fusieproteïne en analyse van de breuken door SDS-PAGE (rode balk: niet-afhankelijke, blauwe deelteken: wassen breuk, zwarte bar: breuken met de elutie piek); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figuur 2 . Splitsing van het zijn6 SUMO tag en zuivering van label-gratis Httex1-QN eiwitten. (A) schematisch overzicht; (B) analyse van de splitsing van de SUMO-tag met ULP1 door UPLC (blauwe: vóór toevoeging van ULP1; zwart: 20 min (23Q), respectievelijk 10 min (43Q) na toevoeging van ULP1) en WB (MAB5492 1:2000, secundaire geit anti muis antilichaam 1:5000); (C) Chromatogram van de voorbereidende RP-HPLC zuivering van Httex1; D: analyse van het gezuiverde Httex1 door UPLC, SDS-pagina en ESI-MS; de verwachte molecuulgewicht is respectievelijk 9943 Da (23Q) en 12506 Da (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figuur 3 . Samenvoeging van Httex1-43Q: (A) sedimentatie assay gebaseerd op UPLC. (B) CD spectra van de secundaire structuur bij 0 uur en 48 h. (C) TEM microfoto van de aggregaten in 48 h (schaal bars zijn 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een robuust en geoptimaliseerde protocol voor de productie van milligram hoeveelheden native, tag-vrije monomeren en fibrillen van de exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO).

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Deze methode stelt ons in staat om tag-vrij exon één te produceren dat de native sequentie van het eiwit bevat en biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de structuurfunctie van dit eiwit, waardoor we zijn functie in gezondheid en ziekte kunnen begrijpen. De belangrijkste voordelen hier zijn de eenvoud, efficiëntie en robuustheid van de methode. Door de heterogeniteit van de sequentie te elimineren, zal deze methode vergelijking en reproduceerbaarheid in verschillende laboratoria mogelijk maken en vergemakkelijken.Hoewel deze methode werd ontwikkeld voor de productie van Huntingtinexon één, kan het ook worden toegepast op andere aggregatie-georiënteerde systemen zoals amyloid-beta peptide en alpha-synucleïne. Filter eerst een eerder geïsoleerd supernatant dat His-SUMO Huntingtinexon één fusie-eiwit bevat, met behulp van een 0,45-micrometer spuitfilter. Verwijder een 20-microliter monster van het gefilterde supernatant voor SDS-PAGE-analyse.Vul het opgehelderde lysaal in een Superloop. Isoleer het His-SUMO Huntingtinexon één fusie-eiwit van het opgehelderde bacterielysaal door geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie op een fast performance vloeistofchromatografiesysteem bij vier graden Celsius. Laat 10 kolomvolumes of 200 milliliter buffer A passeren met 10 milliliter per minuut om de ongebonden eiwitten weg te spoelen.Elueer het fusie-eiwit met 2,5 kolomvolumes of 50 milliliter 100% buffer B bij twee milliliter per minuut. Neem 20 microliter van elke fractie voor SDS-PAGE-analyse. Voeg 20 microliter laadbuffer toe aan elk monster.Laad twee microliter van het ruwe eiwit, de ongebonden fractie, de wasfractie en elke fractie van de elutiepieken op een 15%-gel. Laat de gel 90 minuten bij 180 volt lopen. Wanneer de run is voltooid, kleurt de gel met Coomassie-kleurstof volgens de instructies van de fabrikant.Pool de fracties die het fusie-eiwit bevatten volgens de piek van het chromatogram. Voeg vervolgens 100-millimolair DTT en 100-millimolair L-cysteïne toe aan de gepoolde fracties en los op door de buis voorzichtig te keren. Om oplosmiddel A voor HPLC-zuivering voor te bereiden, voegt u twee milliliter trifluorazijnzuur toe aan een twee-liter fles water.Om oplosmiddel B voor te bereiden, voegt u 2,5 milliliter trifluorazijnzuur toe aan een 2,5-liter fles acetonitril. Bereid het HPLC-systeem voor zoals aanbevolen door de fabrikant. Voer een lege run uit om een schone kolom te garanderen.Neem vervolgens 100 microliter van het fusie-eiwit voor de toevoeging van ULP1 om de splitsingsreactie door UPLC te bewaken. Breng 20 milliliter van het fusie-eiwit over naar een nieuwe 50-milliliter buis en voeg 0,4 milliliter ULP1-voorraadoplossing toe. Incubeer het monster op ijs en houd de resterende fusie-eiwit op ijs.Bewaar het eiwit niet tijdens tussenstappen en ga door met de zuivering tot voltooiing. Neem elke 10 minuten 100 microliter van de splitsingsreactie om de voortgang van UPLC te bewaken. Na centrifugatie van de monsters, analyseer twee microliter van elke supernatant door UPLC.Vergelijk de verkregen chromatogrammen voor het monster vóór toevoeging van ULP1 en de monsters die daarna zijn genomen. Zodra de SUMO-splitsing voltooid is, filtert u het monster met een 22-micrometer spuitfilter. Zuiver vervolgens het gefilterde monster door omgekeerde fase HPLC.Analyseer de HPLC-fracties door UPLC en ESI-MS. Pool fracties van vergelijkbare zuiverheid in 50-milliliter plastic buizen. Bevriest de monsters in vloeibare stikstof en lyofiliseert.Breng vervolgens het gelyofiliseerd eiwit over in tweeduizend milliliter plastic buizen en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Los 100 microgram gelyofiliseerd Huntingtinexon één op in acht microliter zuivere trifluorazijnzuur in een 1,5-milliliter buis. Na 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur, verdampt u voorzichtig het trifluorazijnzuur onder een afzuigkap met een stroom stikstof of argon.Zodra het eiwit droog is, lost u het op in 100 microliter water. Analyseer vervolgens twee microliter monster door UPLC. Meng nu 20 microliter eiwit-oplossing met 20 microliter 2X laadbuffer.Analyseer monsters van één tot tien microgram eiwit door SDS-PAGE. Laat de gel 90 minuten bij 180 volt lopen. Wanneer de run is voltooid, kleurt de gel met Coomassie-kleurstof volgens de instructies van de fabrikant.Bereid tien milliliter DPBS voor in een 50-milliliter buis. Filtreer de DPBS-oplossing voor elke gebruik door een twee-micrometer filter. Los vervolgens 150 microliter gelyofiliseerd Huntingtinexon één op in twaalf microliter zuivere trifluorazijnzuur in een 1,5-millimeter buis.Na 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur, verdampt u voorzichtig het trifluorazijnzuur in een afzuigkap met een stroom stikstof of argon. Los het geaggregeerde eiwit op in een milliliter voorgekoelde DPBS en pas de pH tussen 7,2 en 7,4 aan met een molaair natriumhydroxide. Filter vervolgens de eiwit-oplossing door een 100-kilodalton centrifugale filter in 1,5-milliliter plastic buizen.Bepaal de concentratie van Huntingtinexon één met behulp van een UPLC-kalibratiecurve op basis van aminozuuranalysedetectie. Bereken vervolgens de hoeveelheid DPBS die moet worden toegevoegd om een concentratie van drie-micromolair Huntingtinexon één te verkrijgen. Verdun het eiwit tot drie micromolair door de berekende hoeveelheid DPBS aan de testbuis toe te voegen.Houd de buis op ijs tot het begin van het aggregatieprotocol. De validatie door elektro-microscopie en andere technieken moet worden uitgevoerd om te valideren dat het desaggregatieprotocol succesvol was in het verwijderen van eventuele vooraf gevormde aggregaten. De volledige aminozuursequentie van het geëxprimeerde fusie-eiwit wordt hier getoond.Een schematisch overzicht van het plasmide en het ge

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates imaging and quantification of protein aggregates in genetically modified Drosophila brains. Brains are fixed, washed, and treated with an antifading agent before mounting. Images are captured using a confocal microscope and quantified to observe the transmission of mutant protein aggregates.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains

De synthese van aangepaste plasmiden is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson-assemblage-klonering om de werk en duur van de procedure voor aangepaste DNA-klonering te verminderen. Het beschreven protocol produceert ook betrouwbare getagde eiwitconstructies voor zoogdierexpressie tegen vergelijkbare kosten als de traditionele cut-and-paste DNA-klonering.

Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering

Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

Een methode is beschreven voor fractionering van onoplosbare en oplosbare mutant huntingtin soorten van muis hersenen en cel cultuur. De beschreven methode is nuttig voor karakterisering en kwantificering van het huntingtin eiwit flux en aids in het analyseren van eiwitten homeostase in de pathogenese van de ziekte en in het bijzijn van...

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

Verschillende antisense oligonucleotides (AONs) hebben aangetoond dat induceren exon integratie (splice modulatie) en SMN expressie voor spinale musculaire atrofie (SMA) te redden. Hier beschrijven we een protocol voor AON lipotransfection ertoe exon opneming in het SMN2 -gen en de evaluatiemethoden te bepalen van de werkzaamheid bij SMA patiënt fibroblasten.

Evaluatie van de opname van de Exon geïnduceerd door Splice switch Antisense Oligonucleotides in SMA patiënt fibroblasten

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

We bieden schaalbare protocollen voor constructontwerp, voorbijgaande transfectie en expressie en zuivering van volledige menselijke huntingtine-eiwitvarianten in HEK293-cellen.

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Leer een robuuste methode voor de productie van native, labelvrije Huntingtin Exon1 monomeren en fibrillen met behulp van een SUMO-fusiestrategie. Deze eenvoudige en reproduceerbare protocol vereenvoudigt structurele en functionele studies van dit aggregatiegevoelige eiwit.

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Meer video's verkennen