Name: Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer hoe u kalium-ionselectieve micro-elektroden maakt en kalibreert voor het meten van kaliumdynamiek in volwassen hippocampus-snedes. Deze methode biedt inzicht in kaliumhomeostase in het centrale zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het Khakh lab werd gesteund door de NIH MH104069. De Mody lab werd gesteund door de NIH NS030549. J.C.O. bedankt de NIH T32 Grant(NS058280) voor Training van neurale micro schakelingen.

Alle dierproeven verliepen volgens het nationale Instituut van Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Chancellor's Animal Research Committee aan de Universiteit van Californië, Los Angeles. Alle muizen werden ondergebracht bij voedsel en water beschikbaar ad libitum in een omgeving van 12 h licht-donker. Alle dieren waren gezond met geen duidelijke gedragsveranderingen, waren niet betrokken bij eerdere studies, en werden opgeofferd tijdens de lichte cyclus. Gegevens voor experimenten werden verzameld uit volwassen muizen (6-8 weken oud voor alle experimenten).
1. bereiding van de selectieve microelectrodes K+
<ol><li>Silanization van borosilicaatglas<ol>
<li>Voldoende glazen capillairen te verwijderen uit de verpakking en leg in een conische tube van 50 mL. Vul conische buis naar boven met 1 M HCl. Wash elektroden met zachte agitatie in HCl's nachts of voor een minimum van 6 uur.</li>
		<li>Kort spoelen haarvaten met 70% ethanol en droog dan volledig bij 100-120 ° C voor 6-8 uur. Opslag gewassen haarvaten in containers met watervrij calciumsulfaat droogmiddel voor maximaal 4 weken voor verder gebruik.</li>
		<li>Trek vóór silanization, haarvaten naar een fijne tip met behulp van een micro-elektrode-trekker. De microelectrodes die we gebruiken zijn ongeveer 2-5 micron in diameter. Altijd behandelen gewassen haarvaten met handschoenen, als oliën van de huid met silanization interfereren kunnen.</li>
		<li>Microelectrodes in een glazen container plaatsen, zodat de elektroden van de bodem om te voorkomen dat tip breuk zijn verheven. De microelectrodes naar de container met autoclaaf tape of soortgelijke plakband vast te stellen.</li>
		<li>Ongeveer 0,5 mL 5% dichlorodimethylsilane (DDS) silanization oplossing verwijderen uit de container met behulp van de methode van de stikstof-replacement (Zie Figuur 2). Een ballon vullen met stikstofgas en bevestig een spuit of de buis en de naald aan de ballon. Steek de naald in de DDS-container tijdens het opstellen van DDS in een aparte spuit via een langere naald.</li>
		<li>De silanization oplossing ontkleuring van toepassing op de toppen van de pipetten en onmiddellijk dekken. Plaats de container bezit is van de microelectrodes met silanization-oplossing in een voorverwarmde oven van (170-180 ° C) laboratorium voor 10-12 uur of bij 200-220 ° C gedurende 30 minuten</li>
		<li>Na de incubatie, zet de oven en verwijder vervolgens de plaat uit de oven. Wees voorzichtig met het verwijderen van de plaat uit de incubator, aangezien er zeer heet. Plaats de plaat op een bankje bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten zodat het glaswerk om te koelen.</li>
		<li>Verwijder de microelectrodes uit de plaat (gebruik een scheermesje of scalpel mes te snijden van de tape) en plaats hen in een dessicant gevulde luchtdichte verpakking. Gesilaneerde microelectrodes vrij van vocht gehouden kunnen worden gebruikt voor maximaal 1 week na silanization.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De elektroden priming<ol>
<li>Bereiden van een stamoplossing van K+ ionophore cocktail: 5% w/v valinomycin, 93% (v/v): 1,2-dimethyl-3-nitrobenzeen, 2% w/v kalium tetrakis(4-chlorophenyl) boraat11. Deze oplossing is een vage gele kleur. In een luchtdichte, ondoorzichtige verpakking bij kamertemperatuur bewaren. Als goed opgeslagen deze oplossing kan vele maanden duren.</li>
		<li>Voorbereiden van een stamoplossing van 10 mM HEPES gebufferd 300 mM NaCl met een pH van 7,4. Het herstellen van de elektrode in een klem en de aanvulling funderingsput met de gebufferde NaCl met behulp van een 28G microfil tip verbonden met een spuit. Let op dat de zoutoplossing het einde van de micro-elektrode tip heeft bereikt. Bevestigen dat de micro-elektrode vrij grote luchtbellen die met de stroom van stroom interfereren kunnen.</li>
		<li>De tip van de elektrode met ongeveer 10-20 µm breed, met de botte kant van een scalpel of scheermesje verbreken.</li>
		<li>Met behulp van een micropipet, het toepassen van een kleine druppel (~0.1 µl) van de ionophore K+ , nabij de monding van de micro-elektrode. Als de elektrode goed gesilaneerde die de druppel zal worden geabsorbeerd in de gebroken tip is. Vul de elektrode tot 1-2 mm met de K+ ionophore, en Verwijder overtollig gebruik papieren zakdoekje.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kalibratie van de selectieve Microelectrodes K+
<ol><li>Bereiding van de ijkoplossingen<ol>
<li>Bereid oplossingen van verschillende concentraties van KCl in gelijke osmolariteit kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) door NaCl vervangen door KCl. We 0,1 1, 4.5, 10 en 100 mM K+ ACSF, gebruikt voor de kalibratie van de elektroden. De recepten voor deze ijkoplossingen zijn vermeld in tabel 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Chemische stof</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">definitieve mM</td>
			<td rowspan="2">0.1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>varieert</td>
			<td>1,51 g</td>
			<td>1,50 g</td>
			<td>1,44 g</td>
			<td>1.4 g</td>
			<td>0.345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>1 M voorraad</td>
			<td>varieert</td>
			<td>20 µl</td>
			<td>200 µl</td>
			<td>900 µl</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1 M voorraad</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µl</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>1 M voorraad</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µl</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0.29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0.437 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Water</td>
			<td colspan="7">q.s. 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Kalium ijkoplossingen
<ol start="2"><li>Micro-elektrode kalibratie<ol>
<li>Bubble alle oplossingen met 95% O2/5% CO2 gedurende ten minste 20 minuten voordat u begint met het experiment. Beginnen de bad met 4.5 mM [K+] zoogdierlevercellen ACSF met een snelheid van 3 mL per minuut. Plaats de selectieve K+ -elektrode in elektrode-houder verbonden aan de headstage van de elektrode op de manipulator. Deze headstage is verbonden met een geschikte versterker. Breng de tip van de elektrode in de bad perfusaat.</li>
		<li>Controleer de Ag/AgCl-elektrode voor grond baadt in dezelfde oplossing en dat de stroom stabiel is. Ijkoplossingen op een stapsgewijze manier van toepassing en de mogelijke wijzigingen opnemen in mV over het uiteinde van de elektrode. Wachten voor de mogelijkheden op het puntje van de elektrode te bereiken van een stabiele waarde voordat u naar de volgende oplossing</li>
		<li>De steady-state spanning wijziging in reactie op de toepassing van de ijkoplossingen op de elektrode tip meten. Bevestigen dat de helling van de elektrode respons ten minste 52 en niet groter is dan 58 is mV per log verandering in [K+].</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bereiding van Acute Hippocampal hersenen segmenten
<ol><li>Voorbereiding van segment oplossingen<ol>
<li>Bereiden van 500 mL sacharose snijden oplossing bestaat uit: 194 mM sacharose, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, en 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2.</li>
		<li>Bereiden van 1-2 liter opnameoplossing (ACSF) bestaat uit: 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4en 26 mM NaHCO3; pH 7,3-7.4 (na borrelen), 290-300 mOsm, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2. Vul een bekerglas een hersenen segment houder kamer met het opnemen van de oplossing en bewaar deze op 32-34 ° C. Vul de vibratome kamer met ijswater slush.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acute segment voorbereiding<ol>
<li>Diep anesthetize een muis door deze te plaatsen in een glazen stolp voorgevuld met 2-3 mL Isofluraan. Controleer voor teen snuifje reflex en als niet-reagerende, snel onthoofden met behulp van een paar scherpe schaar of guillotine als uw dier protocol vereist.</li>
		<li>Maak een incisie van 2-3 cm, met behulp van schaar uit het caudal gedeelte van de schedel te snijden de hoofdhuid langs de middellijn. Maak twee 1 cm horizontale insnijdingen van het foramen magnum langs de zijkanten van de schedel terwijl handmatig intrekken de hoofdhuid. Dan, met behulp van fijn schaar, snijd een sneetje de lengte van de schedel, langs de middellijn vanaf de achterkant van de schedel naar de neus.</li>
		<li>Met behulp van fijne pincet ingevoegd in de buurt van de middellijn, trekken de ingesneden schedel in twee gedeelten. Pak de muis hersenen van de schedel en gebruik een mes om te verwijderen het cerebellum en de bulbus bollen, die respectievelijk op de caudal en rostraal gedeelten van de hersenen liggen. Deze kunnen worden geïdentificeerd door de grote kloven, die hen van de cortex scheiden.</li>
		<li>Monteren van het blok van de hersenen op de lade van de vibratome met behulp van superlijm. Vul de vibratome lade met ijskoude snijden oplossing.</li>
		<li>Gesneden weefselsecties op de coronale vlak bij 300 µm dikte. Meestal kunnen 6 coronale hippocampal segmenten worden verzameld.</li>
		<li>Nadat elke sectie wordt gesneden, onmiddellijk de plakjes overbrengen naar het segment holding bekerglas opgewarmd tot 32-34° C. Houd de secties op deze temperatuur gedurende 20 minuten voordat u verwijdert het bekerglas van de secties en plaats deze bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20-30 minuten voorafgaand aan de opname.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. meting van de elektrisch Evoked K+ Dynamics
<ol><li>Instellen van de segment-voorbereiding<ol>
<li>Voorzichtig plaatst het segment van de hersenen in het bad met behulp van een precisiepipet Pasteur en houd hem zachtjes in plaats met een platina harp met nylon snaren.</li>
		<li>Zorgen de toppen van de bipolaire stimulerende elektrode evenwijdig aan elkaar en zijn niveau met het vliegtuig van het segment. Langzaam, in de loop van 6-7 seconden, invoegen de elektroden CA3 stratum radiatum ongeveer 40-50 µm diep om te stimuleren Schaffer zekerheden. In coronale secties, kan CA3 worden ongeveer geïdentificeerd als het gedeelte van de hippocampus goede laterale aan de cellaag van de submodule op de hippocampal genu, met de stratum radiatum mediale en ventrale dalen tot de piramidale cellaag.</li>
		<li>Steek voorzichtig de K+-selectieve elektrode in CA1 stratum radiatum ongeveer 50 µm diep, door het langzaam het verlagen van de elektrode over ongeveer 3-4 seconden. Toestaan dat het potentieel om te stabiliseren in de elektrode voordat u stimulaties toepast op het segment: dit duurt meestal 5 tot 10 minuten. Als het segment spontane vertoont veranderingen in extracellulaire K+ vervolgens negeren en herhaal dit proces met een nieuw segment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maatregel opgeroepen K+ release<ol>
<li>Toepassing treinen van elektrische stimulatie (8 pulsen) door handmatig het indrukken van de trekker op de stimulator tijdens het digitaal opnemen van reacties. Toepassing stimulatie bij 10 Hz en 1 ms pulsbreedte, vanaf 10 µA stimulans amplitude.</li>
		<li>Toenemende stimulatie amplitudes worden toegepast met een factor 2 totdat een maximale amplitude van K+ reactie wordt gedetecteerd. Als u geen antwoord niet wordt weergegeven, de positie van de K+ -elektrode dichter te verplaatsen naar de site van de stimulatie in 100 µm in stappen</li>
		<li>Het bepalen van de amplitude van de stimulans die de helft van de maximale respons oplevert. In onze ervaring is dit tussen 40-160 µA, afhankelijk van de kwaliteit van de voorbereiding, de leeftijd van het dier en de afstand tussen de elektroden van de stimulatie en selectieve K+ -elektrode.</li>
		<li>In hetzelfde segment, met behulp van de amplitude van een stimulus op één stap lager is dan de amplitude die de helft van de maximale reactie produceert (bijvoorbeeld als 80 µA een half-maximale-reactie produceert, gebruikt 40 µA) prikkel treinen van het toenemende aantal pulsen van toepassing. Aanvankelijk hebben we treinen van 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 en 128 pulsen gebruikt.</li>
		<li>Om te bevestigen dat K+ signalen zijn gemedieerd door actiepotentiaal afvuren van het elektrisch gestimuleerd Schaffer zekerheden bad, 0,5 µM TTX in ACSF van toepassing voor 10 minuten en herhaalt u het protocol stimulatie. Geen evoked reacties moeten worden nageleefd.</li>
		<li>Na het beëindigen van het segment experiment, bevestigen de elektrode heeft haar responsivity onderhouden door opnieuw kalibreren de elektrode in de ijkoplossingen en waarborgen van de reactie is niet afgeweken door meer dan 10% van de eerste kalibratie</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A. A., Youn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis%3A+The+knowns%2C+the+unknowns%2C+and+the+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Bethesda+Md%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits.</a> Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).</li>
<li>Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+%28Kir4.1+subunit%29+in+mice%3A+Phenotypic+impact+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina.</a> J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).</li>
<li>Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroglial+potassium+cycle+during+neurotransmission%3A+role+of+Kir4.1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels.</a> PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).</li>
<li>Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide+and+DNA+aptamer+based+sub-nanomolar+potassium+detecting+optical+nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor.</a> Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).</li>
<li>Bandara, H. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-Mediated+Synthesis+of+a+Near-Infrared+Fluorescent+K%2B+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor.</a> J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).</li>
<li>Depauw, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+selective+potassium+sensor+for+the+detection+of+potassium+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Weinh+Bergstr+Ger%22%5BJournal%5D)">A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues.</a> Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).</li>
<li>Machado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofouling-Resistant+Impedimetric+Sensor+for+Array+High-Resolution+Extracellular+Potassium+Monitoring+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain.</a> Biosensors. 6 (4), (2016).</li>
<li>Rose, M. C., Henkens, R. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304416574902049">Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+membrane+potentials+during+sleep+and+paroxysmal+oscillations+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex.</a> J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+K-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional significance of K-complexes.</a> Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).</li>
<li>MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signals+in+the+rat+optic+nerve%3A+role+for+K%28%2B%29+uptake+via+NKCC1+and+swelling+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes.</a> Glia. 37 (2), 114-123 (2002).</li>
<li>Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Kir4.1+channel+in+excess+potassium+clearance%3A+an+in+vivo+study+on+anesthetized+glial-conditional+Kir4.1+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice.</a> J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).</li>
<li>Hall, D. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9603039">Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects.</a> J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+Concentric+Microelectrodes+for+Measurement+of+Extracellular+Ion+Signals+in+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.</a> J Vis Exp. (103), e53058(2015).</li>
<li>Larsen, B. R., MacAulay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1-mediated+spatial+buffering+of+K%28%2B%29%3A+Experimental+challenges+in+determination+of+its+temporal+and+quantitative+contribution+to+K%28%2B%29+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+Austin+Tex%22%5BJournal%5D)">Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain.</a> Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode die wij hier beschrijven heeft ons om te beoordelen van K+ dynamics in reactie op elektrische stimulatie van Schaffer zekerheden in acute hippocampal plakjes van volwassen muizen toegestaan. Onze methode voor te bereiden K+ ion selectieve microelectrodes is vergelijkbaar met de eerder beschreven procedures12,13,14,15. Deze methode heeft echter voordelen ten opzi...

Kalium-ion concentraties worden strak gereguleerd in de hersenen, en hun schommelingen een krachtige invloed uitoefenen op de rustpotentiaal membraan van alle cellen. In het licht van deze kritische bijdragen is een belangrijk doel van de biologie het bepalen van de cellulaire en biofysische mechanismen die worden gebruikt voor de concentratie van K+ strak te regelen in de extracellulaire ruimte in verschillende organen van het lichaam1 , 2. een belangrijke voorwaarde in deze studies is het vermogen om te K+ concentraties nauwkeurig meten. Hoewel veel onderdelen die tot kalium homeostase in de hersenen in gezonde en zieke staten bijdragen geïdentificeerde3,4,5 geweest, is verdere vooruitgang vertraagd vanwege de gespecialiseerde aard van ion selectieve microelectrodes voorbereiden kalium meting. Micro-elektrode sensoren vertegenwoordigen de gouden standaard voor het meten van K+ concentraties in vitro, in weefsel segmenten en in vivo.
Benaderingen van de nieuwere voor K+ monitoring worden ontwikkeld met behulp van optische sensoren, maar deze een biologisch relevant bereik van K+ -concentraties niet gedetecteerd of niet al volledig in biologische systemen, doorgelicht hebben hoewel eerste resultaten veelbelovende6,7,8te verschijnen. Vergeleken met optische sensoren, zijn microelectrodes fundamenteel beperkt tot een puntbron meting van ionen, hoewel elektrode matrices van de ruimtelijke resolutie9 verbeteren kunnen. Dit artikel richt zich op de sensoren van de single-barreled micro-elektrode voor het toezicht op K+ dynamics.
In dit werk, rapporteren we gedetailleerde stapsgewijze procedures voor het maken van K+ selectieve microelectrodes, met behulp van een valinomycin gebaseerde kalium-ionophore waarmee zeer selectief (104 K+ vouw om het boekje nb+ selectiviteit) K+ verkeer over membranen10. Een natuurlijk voorkomende polypeptide, valinomycin fungeert als een K+ doorlaatbare poriën en vergemakkelijkt de stroom van K+ beneden het elektrochemische gradiënt. Ook beschrijven we hoe ter ijking van de elektroden, hoe te slaan en te gebruiken en tot slot hoe implementeren voor het meten van K+ concentratie dynamiek in acute hippocampal hersenen plakjes van volwassen muizen. Het gebruik van dergelijke elektroden samen met genetisch gemodificeerde muizen dat het gebrek aan specifieke ionenkanalen voorgesteld te reguleren de extracellulaire K+ dynamiek moet onthullen de cellulaire mechanismen die door het zenuwstelsel worden gebruikt om te controleren de ambient concentratie van K + in de extracellulaire milieu.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Muis: C57BL/6NTac ingefokt muizen</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodetrekker</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl gemalen pellet</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aangepaste microfil 28G tip</td><td>World precision instruments</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamstaaf</td><td>A-M Systems</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Bipolare stimulerende elektroden</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus isolator</td><td>World precision instruments</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Grass S88 Stimulator</td><td>Grass Instruments Company</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat glas pipetten</td><td>World precision instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>A naar D board</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Signaalversterker</td><td>Multiclamp 700A of 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Patch computer</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycine</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimethyl-3-nitrobenzeen</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Kalium tetrakis (4-chloorfenyl)boraat</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% dimethyldichloorsilaan in heptaan</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Objectieflens</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

maken, testen en het gebruik van kalium-ion selectieve microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Kalium ionen aanzienlijk bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is daarom een belangrijke regulator van de prikkelbaarheid van de cel. Concentraties van extracellulaire K+ beïnvloeden de rust membraan potentiële en cellulaire prikkelbaarheid gewijzigd door een verschuiving van het evenwicht tussen open en gesloten, geïnactiveerd Staten voor spanning afhankelijk van de ionenkanalen die ten grondslag liggen aan de actiepotentiaal Inleiding en geleiding. Vandaar, is het waardevol voor extracellulaire K+ dynamiek in gezondheid en valt bestuurlijk gezien onder zieke rechtstreeks te meten. Hier beschrijven we hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. We ingezet hen in volwassen hippocampal hersenen segmenten voor het meten van de dynamiek van de concentratie elektrisch evoked K+ . Het oordeelkundige gebruik van dergelijke elektroden is een belangrijk onderdeel van de tool-kit nodig te evalueren van de cellulaire en biofysische mechanismen waarmee extracellulaire K+ concentraties in het zenuwstelsel.

Wij bereid voor selectieve meting van extracellulaire K+, ion-selectieve microelectrodes bekleed met een hydrofobe laag via silanization van schone borosilicaatglas pipetten (figuur 1A). Deze coating kan de K+ -ionophore met valinomycin om te rusten op het puntje van de elektrode en toestaan dat alleen K+ flux via een smalle opening aan het uiteinde van de elektrode (figuur 1B). Na de priming de e...

Kalium ionen bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is een cruciale regulator van cellulaire prikkelbaarheid. We beschrijven hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. Deze elektroden, kunt de meting van elektrisch evoked K+ concentratie dynamiek in volwassen hippocampal plakjes.

Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Het algemene doel van deze techniek is om monopolare kaliumion-selectieve micro-elektroden te maken, kalibreren en gebruiken. Het gebruik van dergelijke elektroden maakt de kwantitatieve beoordeling van de geïnduceerde kaliumionconcentratiedynamiek in volwassen hersenslices mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de fysiologie, zoals het identificeren van de cellulaire en moleculaire mechanismen voor kaliumionhomeostase in het centrale zenuwstelsel.Het grootste voordeel van deze techniek is dat, naast het een eenvoudige en directe fabricagemethode te zijn, micro-elektrodesensoren de gouden standaard vertegenwoordigen voor de meting van kaliumionconcentratie. Om de borosilicaatglas capillairen voor silanisering voor te bereiden, plaatst u ze in een conische buis van 50 milliliter. Vul de conische buis met een-molaire zoutzuur en incubeer de glas capillairen in zoutzuur met zachte agitatie gedurende minimaal zes uur, overnacht.Vervolgens spoelt u de capillairen kort met 70% ethanol en droogt u ze volledig gedurende zes tot acht uur bij 100 tot 120 graden Celsius. Bewaar de gewassen capillairen in containers met watervrij calciumsulfaat droogmi

making-testing-using-potassium-ion-selective-microelectrodes-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit is een protocol voor te bereiden en een neocorticale slice voorbereiding handhaven organotypische cultuur voor het maken van elektrische opnames van piramidale neuronen.

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

We maken gebruik van de patch-clamp techniek om GABA-geactiveerde single-channel stromingen (GABAA-kanalen, GABAA-receptoren) en de synaptische en tonische stromen ze genereren in neuronen te meten. Activering van de kanalen af ​​neuronale prikkelbaarheid bij gezondheid en...

GABA-geactiveerde Single-kanaal en Tonic Stromingen in hersenen van de rat Slices

Neuronen zijn in de eerste elektrofysiologische gekarakteriseerd. Dan het cytoplasma van de opgenomen neuron is opgezogen en onderworpen aan transcriptie-PCR analyse achteruit om de expressie van mRNA's voor de neurotransmitters synthese enzymen, ion kanalen en receptoren op te sporen.

Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

The video demonstrates evoked potassium ion concentration dynamics on electrical stimulation of mouse coronal hippocampal brain slices. A bipolar stimulating electrode is inserted into the stratum radiatum of the CA3 region in the hippocampus, and a potassium-ion selective electrode is placed in the CA1 stratum radiatum. The electrical stimulation causes an action potential, resulting in potassium ion release. Finally, the lack of evoked potassium ion response in the presence of an inhibitory...

Measurement of Evoked Potassium Ion Concentration Dynamics in Coronal Hippocampal Slices

This video demonstrates how to characterize the extracellular space in a brain slice by using ion-selective and iontophoresis microelectrodes to measure and compare electrical signals. This process helps determine the space's volume fraction and degree of twisting.

Characterizing Extracellular Space in a Brain Slice Using Ion-Selective and Iontophoresis Microelectrodes

We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

In dit artikel tonen we een methode voor het bereiden van acute hersenslices bij fysiologische temperatuur, met behulp van een conventionele fysiologische oplossing zonder speciale aanpassingen voor het snijden (zoals het toevoegen van sucrose) en zonder intracardiale perfusie van het dier vóór de slice-voorbereiding.

Slice It Hot: Acute volwassen hersenen Snijden in Fysiologische Temperatuur

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

We demonstreren de fabricage, kalibratie en eigenschappen van twee soorten ionen-selectieve micro-elektroden (dubbel-gerand en concentrisch) voor het meten van ionenconcentraties in hersenweefsel. Deze worden vervolgens gebruikt in de muis hippocampale plak voorbereiding om te laten zien dat exciterende activiteit zowel extracellulaire kalium- als natriumconcentraties verandert.

Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

Leer hoe u kalium-ionselectieve micro-elektroden maakt en kalibreert voor het meten van kaliumdynamiek in volwassen hippocampus-snedes. Deze methode biedt inzicht in kaliumhomeostase in het centrale zenuwstelsel.

Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Meer video's verkennen