Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Het algemene doel van deze techniek is om monopolare kaliumion-selectieve micro-elektroden te maken, kalibreren en gebruiken. Het gebruik van dergelijke elektroden maakt de kwantitatieve beoordeling van de geïnduceerde kaliumionconcentratiedynamiek in volwassen hersenslices mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de fysiologie, zoals het identificeren van de cellulaire en moleculaire mechanismen voor kaliumionhomeostase in het centrale zenuwstelsel.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat, naast het een eenvoudige en directe fabricagemethode te zijn, micro-elektrodesensoren de gouden standaard vertegenwoordigen voor de meting van kaliumionconcentratie. Om de borosilicaatglas capillairen voor silanisering voor te bereiden, plaatst u ze in een conische buis van 50 milliliter. Vul de conische buis met een-molaire zoutzuur en incubeer de glas capillairen in zoutzuur met zachte agitatie gedurende minimaal zes uur, overnacht.

Vervolgens spoelt u de capillairen kort met 70% ethanol en droogt u ze volledig gedurende zes tot acht uur bij 100 tot 120 graden Celsius. Bewaar de gewassen capillairen in containers met watervrij calciumsulfaat droogmiddel gedurende maximaal vier weken voor verder gebruik. Voorafgaand aan de silanisering, trekt u de capillairen tot een fijne punt met behulp van een micro-elektrodetrekmachine.

Plaats vervolgens de micro-elektroden in een glazen container met behulp van autoklaveerbaar plakband, zodat de elektroden verheven zijn van de bodem om puntbreuk te voorkomen. Verwijder vervolgens ongeveer 0,5 milliliter 5%DDS silaniseringsoplossing uit de container met behulp van de stikstofvervangingsmethode. Vul een ballon met stikstofgas en bevestig een spuit of buis en naald aan de ballon.

Voer vervolgens de naald in de DDS container terwijl u DDS in een aparte spuit opzuigt via een langere naald. Breng vervolgens de silaniseringsoplossing druppelsgewijs aan op de punten van de pipetten en dek de container onmiddellijk af. Plaats de container met de micro-elektroden met silaniseringsoplossing in een voorverwarmde laboratoriumoven op 170 tot 180 graden Celsius gedurende 10 tot 12 uur of op 200 tot 220 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na incubatie, haalt u de plaat uit de oven. Plaats de plaat op een werkbank bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten om het glaswerk te laten afkoelen. Verwijder de micro-elektroden van de plaat en plaats ze in een met droogmiddel gevulde luchtdichte container.

Silaniseerde micro-elektroden die vrij van vocht worden gehouden, kunnen tot een week na silanisering worden gebruikt. Om de elektroden te primen, bereidt u een stamoplossing van kalium-ionofoorhoux en bewaart deze in een luchtdichte, ondoorzichtige container bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een stamoplossing van 10-millimolar HEPES-gebufferde 300-millimolar natriumchloride op pH 7,4.

Bevestig de elektrode in een klem. Gebruik vervolgens een stomp instrument om de punt van de elektrode te harken tot ongeveer 10 tot 20 micrometer breed, vul vervolgens de elektrode achterwaarts met de HEPES-gebufferde natriumchloride met behulp van een 28 gauge MicroFil-tip verbonden met een spuit. Observeer dat de zoutoplossing het einde van de micro-elektrodenpunt heeft bereikt en zorg ervoor dat de micro-elektrode vrij is van grote luchtbellen die de stroom kunnen verstoren.

Gebruik een micropipet om een kleine druppel van de kalium-ionofoorhoux aan te brengen nabij de punt van de micro-elektrode. Als de elektrode goed is silanseerd, zal de druppel worden geabsorbeerd in de gebroken punt. Vul de elektrode tot ongeveer 1 millimeter met de kalium-ionofoorhoux en verwijder het overtollige met tissuepapier.

Om de micro-elektroden te kalibreren, laat alle kalibratie- en slice bufferoplossingen minimaal 20 minuten met 95% zuurstof/5% koolstofdioxide borrelen voordat u met het experiment begint. Begin met het doorstromen van het bad met ACSF met 4,5 millimolar kaliumionen met een snelheid van drie milliliter per minuut. Plaats de kaliumion-selectieve elektrode in de elektrodehouder die is bevestigd aan de elektrodekop op de manipulator.

Breng vervolgens de punt van de elektrode in het bad perfusaatoplossing. Zorg ervoor dat de zilver/zilverchloride aardelektrode in dezelfde oplossing is gedompeld en dat de stroom constant is. Breng kalibratieoplossingen stapsgewijs aan en registreer de potentiaalveranderingen in millivolt over de elektrodenpunt.

Wacht tot het potentiaal op de elektrodenpunt een stabiele waarde bereikt voordat u overschakelt naar de volgende oplossing. Meet vervolgens de stabiele spanningsverandering als reactie op de toepassing van de kalibratieoplossingen op de elektrodenpunt. Bevestig dat de helling van de elektrodespanningsrespons minimaal 52 is en niet groter dan 59 millivolt per tienvoudige verandering in kaliumconcentratie.

Om hippocampale slices te bereiden, maakt u een incisie van twee tot drie centimeter vanaf de caudale portie van de schedel om de hoofdhuid langs de middenlijn te snijden. Terwijl u de hoofdhuid handmatig terugtrekt, maakt u twee horizontale incisies van één centimeter vanaf het foramen magnum langs de zijkanten van de schedel. Maak vervolgens met behulp van fijne schaar een incisie langs de middenlijn vanaf de achterkant van de schedel tot aan de neus.

Breng vervolgens fijne forceps nabij de middenlijn aan en trekt u de ingesneden schedel in twee delen terug. Verwijder de muizenhersenen uit de schedel en gebruik een mes om de cerebellum, prefrontale cortex en reukbollen te verwijderen, die respectievelijk op de caudale en rostrale porties van de hersenen zijn gelegen. Monteer vervolgens het hersenblok op de vibratomelade met behulp van Superlijm.

Vul de vibratomelade met ijskoude snijoplossing. Snijd vervolgens weefselsecties op het coronale vlak met een dikte van 300 micrometer. Gewoonlijk kunnen vier tot zes coronale hippocampale slices worden verzameld.

Nadat elke sectie is gesneden, brengt u de slice onmiddellijk over naar de slicehouderbekerde, opgewarmd tot 32 tot 34 graden Celsius. Houd de secties gedurende 20 minuten op