Beoordelende vasculaire Hyperpermeability-inducerende stoffen in de huid met de Miles-test

Het algemene doel van deze procedure is om vasculaire lekkage in de dermis van de muis te meten die wordt geïnduceerd door intradermale injectie van permeabiliteitsbevorderende middelen. Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de regulatie van vasculaire permeabiliteit in vivo, zoals welke moleculen vasculaire lekkage kunnen stimuleren of remmen en wat de betrokken signaalroutes zijn. Het grote voordeel van deze procedure is dat deze snel en relatief eenvoudig is en meestal gebruik maakt van gebruikelijke laboratoriumreagentia en materialen.

De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van ziekten met pathologisch oedeem. In het bijzonder kunnen onderzoekers deze test gebruiken om nieuwe moleculaire doelen te identificeren en relevante geneesmiddelen te testen op hun vermogen om vasculaire permeabiliteit te remmen op een relatief snelle en eenvoudige manier. Bereid afzonderlijke oplossingen van de histamine-remmer Pyrilamine Maleaat en de Evans Blue-kleurstof, beide in 0,9% saline-oplossing.

Werk vervolgens in een laminaire stroomkast en steriliseer de oplossingen door ze door een 0,22 micrometer filter te laten gaan. Laad de twee oplossingen in afzonderlijke spuiten van één milliliter voorzien van naalden van 30 gauge. Draai vervolgens de muis om.

Kanteel vervolgens de muis zodat de kop naar de grond is gericht en de buik naar boven. Nadat de muis is gepositioneerd, dient u 10 microliter per gram lichaamsgewicht van de Pyrilamine Maleaat-oplossing intraperitoneaal toe te dienen. Plaats vervolgens de muis in een warmtekamer van 37 graden Celsius gedurende 10 minuten om vasodilatatie te bevorderen.

Verplaats vervolgens de muis naar een muizenbegrenzer. Wrijf vervolgens de staart met 70% ethanol voor verdere vasodilatatie. Toedienen van 100 microliter van de Evans Blue-kleurstofoplossing intraveneus via de staarvene.

Om bloeden te voorkomen, houdt u snel de staart tussen een vinger en de duim en oefent u druk uit op de plaats van de injectie. Intraveneuze injectie van Evans Blue-kleurstof in de staarvene van de muis is een moeilijke en kritische stap binnen deze procedure. Daarom is het essentieel dat onderzoekers bekwaam zijn in het uitvoeren van deze injectie voordat ze verdergaan met de rest van de procedure.

Het vaststellen van competentie zal voorafgaande oefening vereisen. Gebruik steriele oplossingen van fosfaat gebufferd zout om VEGF-reagens te verdunnen, zodat het eindvolume van de dosis 20 microliter is. Laad vervolgens de VEGF-doorlaatbaarheid-inducerende reagens en de voertuigregeling in twee afzonderlijke spuiten van 300 microliter voorzien van naalden van 31 gauge.

Houd de naald onder een hoek van 15 graden met de huid en injecteer 20 microliter VEGF intradermaal in de flank van de muis. Lokaliseer een opgeblazen bubbel in de huid om een succesvolle injectie te valideren. Voer intradermale injecties uit op twee extra plaatsen op minstens een centimeter afstand van elkaar.

Draai vervolgens de muis om de tweede flank bloot te leggen en herhaal de drievoudige injecties met de voertuigregeling. Houd voor elk van de injectieplaatsen een record bij op papier en het tijdstip waarop de injectieprocedure is beëindigd. Breng vervolgens de muis over naar de thuiscamer.

Blijf de muis monitoren totdat deze bijkomt en begint rond te bewegen in de kooi. Laat de VEGF-oplossing 20 minuten inwerken voordat u de muis roept. In dit stadium injecteert u volgens dezelfde procedure achtereenvolgens VEGFA en voertuig in alle muizen.

Na 20 minuten plaatst u elke geëuthaniseerde muis op zijn rug en prikt u zijn poten op een kurkplank die in een schoon zakdoekje is gewikkeld. Maak vervolgens met behulp van stompe schaar een verticale incisie van drie tot vier centimeter lang van de onderbuik tot de borstkas van de dode muis. Gebruik vervolgens pincet en scalpel om de huid van beide zijden van de flank te verwijderen.

Gebruik de scalpel om eventueel vet te verwijderen in de regio's rond de lekkageplaats. Gebruik vervolgens de pincet en de scalpel om de huidgebieden met gelekte Evans Blue-kleurstof weg te snijden. De uitgesneden huidgebieden moeten van vergelijkbare grootte zijn.

Breng de huidmonsters over naar buisjes van 1,5 milliliter en label dienovereenkomstig. Droog het monster door de open buis in een warmteblok overnacht te plaatsen. Nadat het drogen is voltooid, voegt u 250 microliter de-geïoniseerd formamid toe aan het monster in een afzuigkap.

Sluit het deksel van de buis en plaats het in een warmteblok overnacht om de Evans Dye te extraheren. Centrifugeer de monsters gedurende 40 minuten bij 10.000 g of hoger in een tafelcentrifuge. Breng na de centrifugatie 100 microliter van elk kleurstofbevattend supernatant van het gecentrifugeerde monster over in de putjes van een 96-wellplaat die in een afzuigkap werkt.

Lees de Evans Blue-absorptie af met behulp van een spectrofotometer. Om vasculaire lekkage geïnduceerd door VEGF te bestuderen, wordt de muis geïnjecteerd met 50 nanogram VEGFA in fosfaat gebufferd zout of alleen fosfaat gebufferd zout als voertuig. De afbeelding toont een toename in de accumulatie van gelekte Evans Blue-kleurstof in de huidmonsters geïnjecteerd met VEGFA in vergelijking met de voertuigregeling in situ.

Deze afbeelding van de 96-wellplaat toont de geladen Evans Blue-kleurstof geëxtraheerd in formamid uit het huidmonster. Dit grafiek geeft de genormaliseerde absorptiewaarden weer van gepaarde VEGFA en alleen voertuigcontrole monsters. De grafiek laat zien dat het injecteren van 50 nanogram VEGFA de lekkage van Evans Dye significant verhoogt in vergelijking met alleen het voertuig.

Deze grafiek is verkregen na het kwantificeren van de voudwisselingen in de optische dichtheid voor de VEGFA versus de voertuigmonsters. De grafiek toont een gemiddelde drievoud verhoging van de vasculaire lekkage na toediening van VEGFA in vergelijking met alleen voertuig. Eenmaal beheerst, kan het hoofdsegment van deze techniek in twee uur worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd.