Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Het doel van deze methode is om biologisch relevante orthotope kankerxenograften voor preklinische studies te vestigen. Neuroblastomacellen van patiënten worden geïnjecteerd in de muisbijnier onder begeleiding van echografie zonder open operatie of langdurige herstelperiode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de kankerbiologie en in translationeel onderzoek, zoals studies van tumorevolutie, therapeutische reacties in de native micro-omgeving en metastasen.

Deze kennis zou de betrouwbaarheid van preklinische studies aanzienlijk verbeteren en de ontdekking van geneesmiddelen vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze van patiënt afgeleid is, weefselgericht, efficiënt en betrouwbaar in het produceren van een orthotopisch xenograafmodel voor kankertherapieonderzoek. De cruciale stappen in de procedure zullen worden gedemonstreerd door Sahiti Chukkapalli, een senior technicus en onze laboratoriummanager, samen met Tina Thomas, een onderzoeksmedewerker in ons laboratorium.

Genereer een enkele, van patiënten afgeleide kankercelsuspensie uit tumorweefsel met behulp van een tumordissociatiekit. Begin door ongeveer een halve gram tumorweefsel over te brengen naar een 100 millimeter celcultuurschaal die vijf milliliter enzymgesupplementeerd RPMI-buffer bevat. Snijd vervolgens het tumorweefsel met schaar en weefseltang in kleine stukjes van twee tot vier millimeter.

Pipetteer de tumormix in een dissociatierobuis en sluit de buis. Draai de buis om, bevestig hem op de manchet van een weefseldissociator en dissocieer het weefsel met behulp van het juiste programma. Na de dissociatie, incubeer de tumorcelsuspensie gedurende een uur op een roterende rek bij 37 graden Celsius.

Tritureer de celsuspensie om de vijftien minuten tijdens de incubatie. Na de incubatie, breng de celsuspensie over naar een nieuwe 50 milliliter conische buis en voeg 10 milliliter RPMI toe. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 314g.

Na de centrifugatie, verwijder het supernatant en suspendeer het pellet in vijf milliliter RPMI. Laat de celsuspensie door een 40 micron celstrainer lopen en verzamel de gezeefde oplossing in een verse 50 milliliter buis. Na het wassen van de zeef met vijf milliliter RPMI-media, centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 314g om een pellet te verzamelen.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Breng vervolgens het pellet in RPMI aan om een ​​eindconcentratie van vier keer 10 tot de vijf cellen per 10 microliter volume te verkrijgen. Breng vijf microliter van deze celsuspensie per injectie over naar een verse buis, en hetzelfde volume basement membraanmatrix om 10 microliter celoplossing voor elke injectie te maken en plaats deze op ijs.

Breng de muis over naar het beeldvormingsplatform met de buikzijde naar beneden. Pas en bevestig de neuskoker om isofluraananesthesie te behouden. Begin de implantatieprocedure met behulp van ontharingslotion en een scheerapparaat om de rug en flank van een goed geanesthetiseerde zes tot acht weken oude immuundeficiënte NSG-muis te ontharen.

Breng optische zalf aan over de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen. Plak vervolgens de muis op zijn plaats om onbedoelde bewegingen te voorkomen. Gebruik vervolgens echografie om de muizenlever, vena cava, milt, linker nier en aangrenzende linkerbijnier te identificeren.

Laad een gekoelde Hamilton-spuiten, uitgerust met een naald met een kleine diameter, met 10 microliter celoplossing. Breng vervolgens onder echografiebegeleiding voorzichtig een gekoelde 22-gauge katheter in door de huid en rugspier, rechtstreeks in de linkerbijnier om een kanaal voor cellulaire injectie te bieden. Verwijder de naald en laat de katheter op zijn plaats.

Visualisatie van de bijnier tijdens het inbrengen van de katheter, samen met de naald en zijn traject, is noodzakelijk om minimale schade aan omliggende structuren en organen te voorkomen en om de morbiditeit van de muis te verlagen. Leid vervolgens de spuit door de katheter die in het midden van de bijnier is gepositioneerd. Terwijl de spuit door de katheter wordt geleid, is het belangrijk om de stabiliteit van de katheter te behouden en het oprukken van de naald te observeren.

Merk op dat de naald zichzelf ongeveer twee millimeter uitstrekt voorbij de beëindiging van de katheter, waarvan de positie gemakkelijk te zien is op echografie. Injecteer de cellen in het beoogde bijnierweefsel. Laat de naald één tot twee minuten op zijn plaats om de basement membraanmatrix te laten instellen.

Nadat de basement membraanmatrix is ingesteld, verwijder langzaam de naald, gevolgd door het verwijderen van de katheter. Plaats de muis ten slotte in een herstelkooi totdat deze voldoende bewustzijn heeft herkregen om op borst te blijven liggen voordat hij terugkeert naar de thuiskooi. Echografie beeldvorming bewaakt de in vivo tumorprogressie.

Deze afbeelding toont een echografie van de bijnier, één week na injectie. Hier toont luminescentiebeeldvorming van een muis geïnjecteerd met neuroblastoom één week na injectie, metingen die niet duiden op tumoraanplanting. Na twee weken toont echografiebeeldvorming tumoraanplanting en progressie naar een gebied van ongeveer 40 vierkante millimeter.

Bioluminescentie twee weken na injectie toonde straling met een meting van 10 tot de zevende, wat wijst op celopname en tumorgroei in overeenstemming met echografiebevindingen. Echografiebeeldvorming acht weken na injectie toonde aanhoudende tumorgroei met een gebiedsmeting van meer dan 100 vierkante millimeter. Nogmaals, bioluminescentie bevestigde de echografiebevindingen met verhoogde stralingsniveaus van 10 tot de negen.

3-D echografie van de tumor toonde een volume van meer dan 100 kubieke millimeter, de basislijn die ons laboratorium gebruikt voor het initiëren van preklinische therapeutische onderzoeken. De uitgesneden tumor meettere ruim een centimeter in grootte, in overeenstemming met echografiemetingen en luminescentiesignalen. Deze media biedt een demonstratie van hoe succesvol orthotopische xenografen van de bijnier kunnen worden gevestigd met neuroblastomacellen van patiënten, met behulp van echografiebegeleiding.

Eenmaal onder de knie, kan deze