Name: Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer echogeleide injectie van neuroblastoomcellen in de bijnier van muizen voor preklinisch kankeronderzoek. Deze methode creëert betrouwbare orthotopische xenograftmodellen zonder chirurgie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk kreeg steun van het Robert Wood Johnson Foundation/Amos medische faculteit ontwikkeling programma, Taubman Research Institute, en de sectie Pediatrische Heelkunde, The University of Michigan. De auteurs willen Kimber Converso-Baran en Dr. Marcus Jarboe bedanken voor de hulp met echografie injectie procedures en het imaging platform. We bedanken Paul Trombley voor zijn hulp met afbeeldingen van de figuur. Wij danken ook de afdeling Radiologie op de Universiteit van Michigan voor het gebruik van het Center for Molecular Imaging en de Tumor Imaging Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door uitgebreide kanker centrum NIH, verlenen P30 CA046592. De Universiteit van Michigan fysiologie fenotypering Core die gedeeltelijk door de subsidiefinanciering uit het NIH (OD016502) en het Frankel cardiovasculair centrum wordt ondersteund. Cel lijn verificatie werd gedaan bij IDEXX RADIL Bioresearch faciliteiten, Columbia, MO. Wij danken Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody en de Mott stevig Tumor oncologie-programma. Onze patiënten en families zijn dankbaar erkend voor hun inspiratie, moed en continue ondersteuning van ons onderzoek.

Alles werd gedaan in overeenstemming met de Universiteit van Michigan institutionele Review Board (HUM 00052430) en voldoet aan de procedures die zijn goedgekeurd door de Commissie van de Universiteit op gebruik en verzorging van dieren (UCUCA). De eenheid voor laboratorium voor dierlijke geneeskunde (ULAM) overzag dierenverzorgers.
Alle werk werd gedaan met de goedkeuring van de Universiteit van Michigan institutionele Review Board (HUM 00052430) en voldoet aan alle menselijke onderzoek ethiek Reglement. Menselijke cellen worden beschouwd als een potentieel biohazardous materiaal, dus volg alle speciale voorzorgsmaatregelen en passende bioveiligheid praktijken die zijn vereist voor uw instelling. NSG muizen zijn ernstig immuungecompromitteerde en vatbaar voor ziekten veroorzaakt door bacteriën die gewoonlijk worden aangetroffen in de omgeving. Gebruik altijd strenge steriele techniek bij de voorbereiding van de materialen voor implantatie en het uitvoeren van de injecties.
1. de celkweek
<ol><li>Gevestigde menselijke NB cellijnen (SH-SY5Y SK-N-BE2 en IMR32) groeien in minimaal essentiële medium, aangevuld met 10% foetale runderserum, 2 mM glutamine, 100 eenheden/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine. Een aanvulling op de cellen van de IMR32 verder met 1 mM pyruvaat en 0,075% NaHCO3. Handhaven van alle cellen bij 37 ° C, 5% CO2 en 70-80% confluence.
</li>
	<li>Groeien menselijke ES cellijnen (TC32, A673, CHLA-25 en A4573) in RPMI medium aangevuld met 10% foetale runderserum en 6 mM L-glutamine. Handhaven van alle cellen bij 37 ° C, 5% CO2 bij 70-80% samenvloeiing.
</li>
	<li>Stuur alle cellijnen voor verificatie. Opmerking: Cel verificatie wordt gedaan op een externe faciliteit, verwijzen wij u naar bevestigingen.</li>
</ol>2. voorbereiding van de primaire Tumor van de patiënt-afgeleide cellen
<ol><li>Met de patiënt toestemming en instemming weggegooid oogst menselijke NB tumor weefsel van patiënten die een chirurgische resectie voor lokale controle en vervoer naar het laboratorium in weefsel opslagoplossing voor behoud. Opmerking: Alle patiënten monsters zijn-geïdentificeerd en behandeld overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele Review Board.</li>
	<li>Genereren een celsuspensie van één patiënt afkomstige kanker (UMNBL001, UMNBL002) van de tumor weefsel met behulp van een tumor dissociatie kit. Ongeveer 0,5 g tumor overbrengen in een 100 mm cel cultuur schotel met 5 mL RPMI buffer, 200 µL van enzym H, 100 µL van enzym R en 25 µL van enzym A uit de menselijke tumor dissociatie kit.</li>
	<li>Gehakt van de tumor in kleine stukjes (elke 2-4 mm) met behulp van schaar en pincet weefsel. Meng deze fragmenten met de oplossingen in stap 2.2.</li>
	<li>Pipetteer van het mengsel van de tumor in een dissociator buis en sluit de tube. Omkeren van de buis en hechten op de mouw van de dissociator van het weefsel. Op het programma h_tumor_01 uitvoeren.</li>
	<li>Incubeer de tumor celsuspensie verkregen boven bij 37 ° C gedurende 1 uur op een roterende rek met intermitterende verpulvering elke 15 min.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een nieuwe conische tube van 50 mL en voeg 10 mL van RPMI. Centrifugeer de celsuspensie bij 314 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet in 5 mL RPMI. Deze oplossing passeren door een zeef van 40 µm cel en het verzamelen van de gespannen oplossing in een conische buis van verse 50 mL. Deze zeef eenmaal met 5 mL van RPMI media wassen en centrifugeren van het mengsel bij 314 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van een pellet.</li>
	<li>Het meten van de celdichtheid met behulp van een hemacytometer15. Opschorten van de pellet in RPMI om een eindconcentratie van 4 × 105 cellen/10 µL van bovenaf verkregen. Neem 5 µL van deze celsuspensie en 5 µL van matrigel te maken 10 µL van cel oplossing voor elke injectie. Opmerking: Hoeveelheid RPMI gebruikt hangt af van de cel dichtheid meting. Bijvoorbeeld, als de gemeten celdichtheid van de verkregen pellet 4 x 105 cellen is, Suspendeer de pellet in 10 µL van RPMI.</li>
</ol>3. luciferase Tagging van kankercellen
<ol><li>Breng 10 mL transductie media met 5 mL van virale supernatant EF1a-Luc2-IRES-mCherry en 5 mL van de media van de cel van de stam. Voeg 7,5 µL van 1 x polybrene.</li>
	<li>Mix 5 × 10-6 kankercellen in signaaltransductie media en plaat in 100 mm ultra-lage bijlage plaat. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 's nachts. Opmerking: Zoals lage bijlage platen worden gebruikt, cellen zal niet houden aan de plaat.</li>
	<li>Na 24u, brengen de 100 mm plaat met cellen onder weefselkweek motorkap en breng het mengsel in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer de celsuspensie bij 314 x g gedurende 5 min om de cel-pellet. Wassen van de cel pellet een keer met 1 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en het opschorten van de cel pellet in 1 mL HBSS met 1% foetale runderserum (FBS).<ol>
<li>Sorteren luciferase cellen op basis van GFP-positieve signaal op fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse. Plaat de gesorteerde cellen op 100 mm Weefselkweek behandeld schotel en handhaven bij 70-80% samenvloeiing, 37 ° C en 5% CO2 totdat vereist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luciferase signaal met luciferase assay kit te bevestigen. Plaat 10 x 104 gesorteerd op cellen per putje in een illuminometer compatibel 96 goed plaat en incubeer cellen 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2. Na 24u, breng de 96 goed plaat op kamertemperatuur en Steady-Glo reagens toevoegen aan gekweekte media in putten in 1:1 verhouding. Cellen lyse voor 5 min en lezen van luminescentie in spectrofotometer toestaan.</li>
	<li>Breng de schotel van 100 mm onder de motorkap van een weefselkweek. Gooi het supernatant media. Wassen van de cellen een keer met 2 mL 1 x PBS.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL trypsine van 0,25% en de 100 mm schotel terugkeren naar de incubator voor 2-3 min. Na 2-3 min, Controleer verdreven cellen onder de Microscoop en 8 mL van RPMI om te deactiveren trypsine toevoegen.</li>
	<li>Het verzamelen van de celsuspensie in een conische tube van 15 mL en centrifuge bij 314 x g gedurende 5 min om te krijgen een pellet. Verwijder het supernatant. Wassen van de cel pellet met 1 mL 1 x PBS, Suspendeer de pellet in 5 mL van RPMI en bepalen van de celdichtheid met behulp van een hemacytometer15. Centrifugeer yhe resterende cell oplossing bij 314 x g gedurende 5 min te verkrijgen van een pellet.</li>
	<li>Suspendeer de pellet in RPMI tot een concentratie van 4 x 105 cellen/10 µL aan. Neem 5 µL van de celsuspensie en 5 µL van matrigel te maken 10 µL van cel oplossing voor elke injectie.</li>
</ol>4. echografie begeleide bijnier (NB) of renale Sub Capsule (ES) implantatie
Opmerking: Alle echografie procedures worden uitgevoerd met een hoge resolutie in vivo imaging systeem. Voor de beschreven procedures, werd de transducer, die een center frequentie van 40 MHz en een bandbreedte van 22-55 MHz heeft gebruikt.
<ol><li>6-8-week-oude immuun-deficiënte NSG muizen voor alle injectie procedures gebruiken.</li>
	<li>Chill de matrigel en gesteriliseerde met autoclaaf Hamilton spuiten uitgerust met een 27G naald (1.25"), en 22G katheters (externe diameter van 0,9 mm, 25 mm lengte) 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Plaats de mobiele oplossing bereid in stap 3 op ijs.</li>
	<li>Anesthetize van de muizen in een inductie-kamer met 2% Isofluraan in O2 geleverd in 2 L/min. Opmerking: Voldoende verdoving wordt bepaald met het gebrek aan actieve beweging en het onderhoud van de spontane ademhaling.</li>
	<li>Zodra verdoofd, ontharen de rug en de flank van de dieren met behulp van haar verwijdering lotion (zoals Nair) en een scheerapparaat.</li>
	<li>Overbrengen in het dier het imaging platform met abdominale zijde naar beneden, waar de neus van het dier wordt geplaatst in een neuskegel en beveiligd terwijl het inademen van Isofluraan.</li>
	<li>Plaats optische zalf in de ogen van het dier om te voorkomen dat het drogen. Tape de muis om te voorkomen dat elke onbedoelde beweging.</li>
	<li>Identificeer de lymfkliertest lever, vena cava, milt, linker nier en aangrenzende linker bijnier met behulp van echografie visualisatie.</li>
	<li>Steriele handschoenen, masker en GLB gebruiken voor persoonlijke bescherming en onderhoud van steriele omstandigheden. Onder echografie-begeleiding, zachtjes invoegen een 22G katheter via de huid en spier terug rechtstreeks in de linker bijnier klier te voorzien in een kanaal voor cellulaire injectie. Verwijder de naald en laat de katheter op zijn plaats.</li>
	<li>Belasting een gekoeld Hamilton spuit uitgerust met een lijst naald met 10 µL van cell oplossing en begeleiden van de spuit stereotactically via de katheter gepositioneerd in het midden van de bijnier.</li>
	<li>Het injecteren van de cellen in het gerichte bijnier weefsel. Laat de naald staan voor 1-2 min om de matrigel in te stellen. Verwijder langzaam de naald, gevolgd door het verwijderen van de katheter.</li>
	<li>Plaats de muizen terug in hun kooi en ervoor te zorgen dat de muis voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding herwint. Opmerking: vanwege de minimaal invasieve aard van deze techniek, post procedurele pijn is minimaal, maar nog steeds gecontroleerd op een dagelijkse basis met muizen gezondheid controles. "moet worden gevolgd met een zin:"als onverwachte tekenen van pijn of leed worden geïdentificeerd in de loop van een experiment, overleg plegen met uw institutionele veterinaire hondensteun voor informatie over analgesie of andere medische zorg. 
</li>
</ol>

<ol><li>Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+optimal+murine+models+to+investigate+immune+checkpoint+blockers+and+their+combination+with+other+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies.</a> Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).</li>
<li>Fidler, I. J., Hart, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+in+metastatic+neoplasms%3A+origins+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications.</a> Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).</li>
<li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Models+are+Necessary+to+Predict+Therapy+of+Transplantable+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).</li>
<li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).</li>
<li>Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+relevant+orthotopic+neuroblastoma+xenograft+models%3A+Primary+adrenal+tumor+growth+and+spontaneous+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis.</a> In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).</li>
<li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+orthotopic+neuroblastoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft.</a> Dev Biol. 407, 344-355 (2015).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+Invasive+Establishment+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts.</a> J. Vis. Exp. (84), e51123(2014).</li>
<li>Teitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+for+Neuroblastoma%3A+Establishing+a+Baseline+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19133(2011).</li>
<li>Braekeveldt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+patient-derived+orthotopic+xenografts+retain+metastatic+patterns+and+geno-+and+phenotypes+of+patient+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours.</a> International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).</li>
<li>Van Noord, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-directed+Implantation+Using+Ultrasound+Visualization+for+Development+of+Biologically+Relevant+Metastatic+Tumor+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts.</a> In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).</li>
<li>Vormoor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Preclinical+Orthotopic+Xenograft+Model+of+Ewing+Sarcoma+and+Other+Human+Malignant+Bone+Disease+Using+Advanced+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 9 (1), e85128(2014).</li>
<li>Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Ewing+sarcoma+of+the+kidney%3A+a+symptomatic+presentation+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature.</a> Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).</li>
<li>Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Antibodies+Targeting+CSF1+Impede+Macrophage+Recruitment+in+a+Xenograft+Model+of+Tenosynovial+Giant+Cell+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor.</a> Sarcoma. 2010, 174528(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Echografie-geleide innesteling van cellen NB en ES is een efficiënte en veilige methode om betrouwbare lymfkliertest xenografts voor preklinische studies in de Kankerbiologie. Cruciaal voor het succes van echografie-geleide weefsel-gerichte innesteling is de aanwezigheid en beschikbaarheid van geschoold personeel met deskundigheid in het anatomisch lokaliseren van het orgel van belang en stereotactische injectie van tumorcellen.
De dissociatie van tumor weefsel bleek te zijn een cruciale stap ...

Dierlijke xenograft modellen zijn essentiële instrumenten voor preklinische studies van nieuwe antikanker therapieën. Standaard lymfkliertest xenografts is afhankelijk van subcutane flank innesteling van cellen, een efficiënt en gemakkelijk toegankelijke site voorziet in toezicht op de tumorgroei. Het nadeel van subcutane modellen is hun gebrek aan tumor-specifieke biologische kenmerken, die hun potentieel beperken kunnen voor het metastaseren1. Dergelijke beperkingen zijn overwonnen door het gebruik van orthotopic xenografts in welke tumor cellen worden geaccepteerd op inheemse weefsel sites, gemetastaseerde potentieel2voorzien van een relevante communicatie. Orthotopic xenograft modellen originele biologische kenmerken behouden en betrouwbare modellen voorzien preklinische drug discovery3,4. De kankercellen gebruikt voor weefsel-geleide innesteling zijn bestaande cellijnen of patiënt-afgeleide cellen van de patiënt tumoren. Xenografts vastgesteld van kanker cellijnen kunnen hoge genetische afwijking van de primaire tumor ten opzichte van patiënten afgeleide xenografts5vertonen. Gezien dit, de oprichting van patiënt-afgeleide orthotopic xenografts de voorkeur standaard geworden voor het testen van nieuwe therapeutics in kanker drugontdekking.
In de pediatrische kanker neuroblastoom (NB), orthotopic xenograft modellen recapituleren primaire tumor biologie en metastase naar typische sites van NB verspreid6,7te ontwikkelen. NB ontwikkelt in de bijnier of langs de sympathieke keten van paravertebral. De meest voorkomende methoden van orthotopic implantatie vereisen open trans-abdominale chirurgische procedures. Deze methoden zijn vaak saai, hebben hoge dierlijke morbiditeit en complexe herstel periodes. Hoge resolutie echografie is onlangs gebruikt voor weefsel-geleide implantatie van tumorcellen in de ontwikkeling van verschillende lymfkliertest modellen voor kanker onderzoek8,9. De techniek is betrouwbare, reproduceerbare, efficiënt en veilig voor de vaststelling van relevante uitgezaaide tumor xenografts10,11.
De oprichting van pediatrische kanker xenografts door echografie-geleide doel orgel lokalisatie en naald implantatie van cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen is aangetoond dat11. De techniek werd gebruikt voor NB gericht op de lymfkliertest bijnier. Het Ewing sarcoom (ES) is voornamelijk een ossaal kanker, vaak gezien in de lange beenderen zoals dijbeen en het bekken beenderen12. Aanvraagrapporten hebben aangetoond dat om te bepalen of de groei van een overwegend werden kanker haalbaar in renal weefsel is, een renale sub kapselvorming locatie werd gekozen voor orthotopic implantatie13. Renale sub kapselvorming cel innesteling van tumorcellen is gebruikt als een veelbelovende model te bestuderen van spontane metastasen voor ES14.

<table><tbody><tr><td>Muizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID</td><td>Charles River</td><td>394</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Cellijn&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMR-32</td><td>ATCC</td><td>CCL-127</td><td>Gevestigde humane neuroblastoomcellijn</td></tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>Gevestigde humane neuroblastoomcellijn</td></tr><tr><td>SK-N-Be2</td><td>ATCC</td><td>CRL-2271</td><td>Gevestigde humane neuroblastoomcellijn</td></tr><tr><td>ES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC32&nbsp;</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Gevestigde humane Ewing's Sarcoma-cellijn</td></tr><tr><td>A673</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Gevestigde humane Ewing's Sarcoma-cellijn</td></tr><tr><td>CHLA-25</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Gevestigde humane Ewing's Sarcoma-cellijn</td></tr><tr><td>A4573</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Gevestigde humane Ewing's Sarcoma-cellijn</td></tr><tr><td>Cellijnmedia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD BioSciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Dissociatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiegereedschap</td><td>KentScientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Human Tumor Dissociation Kit&nbsp;</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Celzeef</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase Tagging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-GFP1 virus</td><td>University of Michigan, Vector Core</td><td></td><td>Luciferase Virus</td></tr><tr><td>Steady Glo-Luciferase Assay Kit</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescentie Beeldvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ivis Spectrum Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferine</td><td>Promega</td><td>E160X</td><td></td></tr><tr><td>Verdoving</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingeademde Isofluran&nbsp;</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-0017-25</td><td></td></tr><tr><td>Echtijden geleide injectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 High Resolution Imaging</td><td>Vevo</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritzen (27 gauge naald)</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Angiocatheter</td><td>BD Biosciences</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>Optische zalf</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>301909</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church &amp; Dwight Co</td><td></td><td>Haarverwijderingsmiddel</td></tr><tr><td>Aquasonic 100 Ultrasound Transmissie gel</td><td>Parker</td><td></td><td>Ultrasound gel</td></tr><tr><td>Histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>DAKO</td><td>M3601</td><td>Primaire Antilichaam</td></tr><tr><td>Tyrosine Hydroxylase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2928</td><td>Primaire Antilichaam</td></tr><tr><td>Secundaire HRP-Polymeer antilichaam</td><td>Biocare</td><td>BRR4056KG</td><td></td></tr><tr><td>Diverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettips</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375E</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettips</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Portable pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Digitale weegschaal voor dieren&nbsp;</td><td>KentScientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td>Sluiploodjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-16</td><td></td></tr><tr><td>6well low attachment platen</td><td>Corning</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide tumor xenografts

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preklinische testen van antikanker therapieën, is afhankelijk van relevante xenograft modellen die de aangeboren tendensen van kanker na te bootsen. Voordelen van standaard subcutane flank modellen zijn procedurele gemak en de mogelijkheid om monitor tumor progressie en reactie zonder invasieve imaging. Dergelijke modellen zijn vaak inconsistent in translationeel klinische proeven en hebben beperkte biologisch relevante kenmerken met lage neiging tot metastase, want er een gebrek aan een eigen communicatie is. Ter vergelijking: orthotopic xenograft modellen op sites van de oorspronkelijke tumor is gebleken nabootsen van de communicatie van de tumor en repliceren belangrijk ziektekenmerken zoals verre metastatische verspreiding. Deze modellen vereisen vaak vervelend chirurgische ingrepen met langdurig verdoving tijd en herstel. Om aan te pakken dit, hebben kanker onderzoekers onlangs gebruikt echografie-geleide injectie technieken om kanker xenograft modellen voor preklinische experimenten, die zorgt voor snelle en betrouwbare inrichting van weefsel geleide lymfkliertest modellen. Echografie visualisatie biedt ook een noninvasive methode voor het longitudinale beoordeling van tumor engraftment en groei. Hier beschrijven we de methode voor echografie-geleide injectie van kankercellen, gebruik makend van de bijnier voor NB en renale sub capsule voor ES. Deze minimaal invasieve benadering overwint vervelend open chirurgie implantatie van kankercellen in weefsel-specifieke locaties voor groei en metastase en voorbij morbide herstel periodes. We beschrijven het gebruik van zowel bestaande cellijnen als patiënt afgeleide cellijnen voor orthotopic injectie. Pre-en-klare commerciële kits zijn beschikbaar voor tumor dissociatie en luciferase tagging van cellen. Injectie van celsuspensie met behulp van beeld-begeleiding biedt een minimaal invasieve en reproduceerbare platform voor het maken van preklinische modellen. Deze methode wordt gebruikt om te maken van betrouwbare preklinische modellen voor andere vormen van kanker zoals lever, blaas en alvleesklier voorbeeldig voor haar onbenut potentieel voor talrijke kanker modellen.

Met behulp van de procedures die zijn gepresenteerd, werd echografie-geleide implantatie van NB cellen in de bijnier gedaan in een speciale procedure kamer is voorzien van een verwarmd chirurgische tabel. Arm en voet pads werden geplaatst voor het toezicht op lymfkliertest hartactiviteit (figuur 1A). Het dier bleef narcose onder Isofluraan met behulp van de neus inademen. Met een hoge resolutie ultrasone sonde, werd de linker nier geïdentificeerd met de bijni...

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Het doel van deze methode is om biologisch relevante orthotope kankerxenograften voor preklinische studies te vestigen. Neuroblastomacellen van patiënten worden geïnjecteerd in de muisbijnier onder begeleiding van echografie zonder open operatie of langdurige herstelperiode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de kankerbiologie en in translationeel onderzoek, zoals studies van tumorevolutie, therapeutische reacties in de native micro-omgeving en metastasen.Deze kennis zou de betrouwbaarheid van preklinische studies aanzienlijk verbeteren en de ontdekking van geneesmiddelen vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze van patiënt afgeleid is, weefselgericht, efficiënt en betrouwbaar in het produceren van een orthotopisch xenograafmodel voor kankertherapieonderzoek. De cruciale stappen in de procedure zullen worden gedemonstreerd door Sahiti Chukkapalli, een senior technicus en onze laboratoriummanager, samen met Tina Thomas, een onderzoeksmedewerker in ons laboratorium.Genereer een enkele, van patiënten afgeleide kankercelsuspensie uit tumorweefsel met behulp van een tumordissociatiekit. Begin door ongeveer een halve gram tumorweefsel over te brengen naar een 100 millimeter celcultuurschaal die vijf milliliter enzymgesupplementeerd RPMI-buffer bevat. Snijd vervolgens het tumorweefsel met schaar en weefseltang in kleine stukjes van twee tot vier millimeter.Pipetteer de tumormix in een dissociatierobuis en sluit de buis. Draai de buis om, bevestig hem op de manchet van een weefseldissociator en dissocieer het weefsel met behulp van het juiste programma. Na de dissociatie, incubeer de tumorcelsuspensie gedurende een uur op een roterende rek bij 37 graden Celsius.Tritureer de celsuspensie om de vijftien minuten tijdens de incubatie. Na de incubatie, breng de celsuspensie over naar een nieuwe 50 milliliter conische buis en voeg 10 milliliter RPMI toe. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 314g.Na de centrifugatie, verwijder het supernatant en suspendeer het pellet in vijf milliliter RPMI. Laat de celsuspensie door een 40 micron celstrainer lopen en verzamel de gezeefde oplossing in een verse 50 milliliter buis. Na het wassen van de zeef met vijf milliliter RPMI-media, centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 314g om een pellet te verzamelen.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Breng vervolgens het pellet in RPMI aan om een ​​eindconcentratie van vier keer 10 tot de vijf cellen per 10 microliter volume te verkrijgen. Breng vijf microliter van deze celsuspensie per injectie over naar een verse buis, en hetzelfde volume basement membraanmatrix om 10 microliter celoplossing voor elke injectie te maken en plaats deze op ijs.Breng de muis over naar het beeldvormingsplatform met de buikzijde naar beneden. Pas en bevestig de neuskoker om isofluraananesthesie te behouden. Begin de implantatieprocedure met behulp van ontharingslotion en een scheerapparaat om de rug en flank van een goed geanesthetiseerde zes tot acht weken oude immuundeficiënte NSG-muis te ontharen.Breng optische zalf aan over de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen. Plak vervolgens de muis op zijn plaats om onbedoelde bewegingen te voorkomen. Gebruik vervolgens echografie om de muizenlever, vena cava, milt, linker nier en aangrenzende linkerbijnier te identificeren.Laad een gekoelde Hamilton-spuiten, uitgerust met een naald met een kleine diameter, met 10 microliter celoplossing. Breng vervolgens onder echografiebegeleiding voorzichtig een gekoelde 22-gauge katheter in door de huid en rugspier, rechtstreeks in de linkerbijnier om een kanaal voor cellulaire injectie te bieden. Verwijder de naald en laat de katheter op zijn plaats.Visualisatie van de bijnier tijdens het inbrengen van de katheter, samen met de naald en zijn traject, is noodzakelijk om minimale schade aan omliggende structuren en organen te voorkomen en om de morbiditeit van de muis te verlagen. Leid vervolgens de spuit door de katheter die in het midden van de bijnier is gepositioneerd. Terwijl de spuit door de katheter wordt geleid, is het belangrijk om de stabiliteit van de katheter te behouden en het oprukken van de naald te observeren.Merk op dat de naald zichzelf ongeveer twee millimeter uitstrekt voorbij de beëindiging van de katheter, waarvan de positie gemakkelijk te zien is op echografie. Injecteer de cellen in het beoogde bijnierweefsel. Laat de naald één tot twee minuten op zijn plaats om de basement membraanmatrix te laten instellen.Nadat de basement membraanmatrix is ingesteld, verwijder langzaam de naald, gevolgd door het verwijderen van de katheter. Plaats de muis ten slotte in een herstelkooi totdat deze voldoende bewustzijn heeft herkregen om op borst te blijven liggen voordat hij terugkeert naar de thuiskooi. Echografie beeldvorming bewaakt de in vivo tumorprogressie.Deze afbeelding toont een echografie van de bijnier, één week na injectie. Hier toont luminescentiebeeldvorming van een muis geïnjecteerd met neuroblastoom één week na injectie, metingen die niet duiden op tumoraanplanting. Na twee weken toont echografiebeeldvorming tumoraanplanting en progressie naar een gebied van ongeveer 40 vierkante millimeter.Bioluminescentie twee weken na injectie toonde straling met een meting van 10 tot de zevende, wat wijst op celopname en tumorgroei in overeenstemming met echografiebevindingen. Echografiebeeldvorming acht weken na injectie toonde aanhoudende tumorgroei met een gebiedsmeting van meer dan 100 vierkante millimeter. Nogmaals, bioluminescentie bevestigde de echografiebevindingen met verhoogde stralingsniveaus van 10 tot de negen.3-D echografie van de tumor toonde een volume van meer dan 100 kubieke millimeter, de basislijn die ons laboratorium gebruikt voor het initiëren van preklinische therapeutische onderzoeken. De uitgesneden tumor meettere ruim een centimeter in grootte, in overeenstemming met echografiemetingen en luminescentiesignalen. Deze media biedt een demonstratie van hoe succesvol orthotopische xenografen van de bijnier kunnen worden gevestigd met neuroblastomacellen van patiënten, met behulp van echografiebegeleiding.Eenmaal onder de knie, kan deze

utilization-ultrasound-guided-tissue-directed-cellular-implantation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, human-derived melanoma cells are implanted subcutaneously into the flank region of an immunocompromised mouse. The PDX model allows preclinical investigation of melanoma cells that better recapitulate the tumor heterogeneity and melanoma aggressiveness observed in in vivo conditions.

Patient-derived Xenograft Modeling: A Technique to Generate Melanoma Mouse Models

De gevestigde techniek om primaire invasieve orthotoop blaaskanker xenotransplantaten te enten vereist laparotomie en mobilisatie van de blaas. Deze procedure toebrengt significante morbiditeit op de muizen, technisch uitdagend en tijdrovend. Daarom hebben wij een hoge precisie, percutane benadering gebruik te maken van echografie begeleiding.

Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Orthotopic humane lever gemetastaseerde ukalfs melanoom xenotransplantaatmodellen is Muismodellen werden gemaakt met behulp van chirurgische orthotopic implantatie technieken met patiënt-afgeleide tumor Brok en naald injectietechnieken met gekweekte menselijke ukalfs melanoom cellijnen.

Generatie van een lever Orthotopic humaan Ukalfs melanoom xenograft platform in Immunodeficiënte muizen

We beschrijven een protocol voor de echografie geleide implantatie van Murine-afgeleide alvleesklier ductaal adenocarcinoom cellijnen rechtstreeks in de inheemse tumor site. Deze aanpak resulteerde in alvleesklier tumoren detecteerbaar door echografie scannen binnen 2-4 weken van injectie, en aanzienlijk verminderd de proportie tumor cel zaaien op de peritoneale muur in vergelijking met chirurgische orthotopic implantatie.

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

Botmetastasemodellen ontwikkelen metastase niet uniform of met een 100% incidentie. Directe intra-osseuze tumorcelinjectie kan leiden tot embolisatie van de long. We presenteren onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot, wat leidt tot reproduceerbare transplantatie en groei.

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Metastase van het centrale zenuwstelsel PDX-modellen vertegenwoordigen de fenotypische en moleculaire kenmerken van menselijke metastase, waardoor ze uitstekende modellen zijn voor preklinische studies. Hier wordt beschreven hoe PDX-modellen en de inentingsroutes kunnen worden vastgesteld die het beste kunnen worden gebruikt voor preklinische studies.

De oprichting en het gebruik van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van metastasen van het centrale zenuwstelsel

We presenteren een protocol om een minimaal invasief orthotopisch pancreaskankermodel te genereren door echogeleide injectie van menselijke pancreaskankercellen en de daaropvolgende monitoring van tumorgroei in vivo door echografie.

Generatie van een orthotopisch xenotransplantaat van pancreaskankercellen door echogeleide injectie

Dit protocol beschrijft een efficiënte, niet-chirurgische methode voor de orthotope implantatie van xenotransplantaten afkomstig van borstkankerpatiënten bij muizen. De techniek omvat enzymatische tumordissociatie gevolgd door directe injectie in de borstvetkussens, waardoor implantatie met hoge doorvoer mogelijk is. Uitgebreide validatie zorgt voor modelgetrouwheid en maakt rigoureuze studies in verschillende subtypes van borstkanker mogelijk.

High-throughput dissociatie en orthotope implantatie van borstkanker Patiënt-afgeleide xenotransplantaten

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer echogeleide injectie van neuroblastoomcellen in de bijnier van muizen voor preklinisch kankeronderzoek. Deze methode creëert betrouwbare orthotopische xenograftmodellen zonder chirurgie.

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts (Video) | JoVE Journal

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Meer video's verkennen