Name: Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer een high-throughput microfluidic workflow voor eencellige genoomsequencing met behoud van genomische heterogeniteit. Deze methode sequencet tienduizenden cellen individueel voor nauwkeurige profilering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation via een CAREER Award (subsidie nummer DBI-1253293); de National Institutes of Health (NIH) (subsidie nummers HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); en de Defense Advanced Research projecten Agentschap wonen gieterijen Program (contractnummers HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
<li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14726454">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li>
<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

Octrooien met betrekking tot deze werkstroom kunnen worden is in licentie gegeven aan missie Bio, van welke Adam R. Abate een aandeelhouder.

De SiC-seq microfluidic workflow produceert eencellige genoom sequencing gegevens uit duizenden bacteriecellen. Digitale barcodes verbinding aan de randen op het genoom van microgel-ingekapseld cellen toestaan voor de deconvolutie in silico NGS gegevens in groepen van barcoded luidt die afkomstig zijn uit dezelfde cel. Een controle-experiment met een microbiële Gemeenschap van waarvan de samenstelling bekend is noodzakelijk voor de evaluatie van de zuiverheid van de barcode-groepen. Een groot deel van de laag-zuiverheid groepen geeft aan dat de cel inkapseling tarief te hoog is of dat er belangrijke druppel kruisbesmetting optreedt tijdens de verwerking van de microfluidic stappen. Volgens de statistieken van de Poisson, moeten de barcodes en cellen worden ingekapseld met een doel-verhouding van 1 deeltje voor elke 10 druppels te beperken van het aantal meerdere inkapseling gebeurtenissen tot minder dan 5% van alle niet-lege druppels. Een inkapseling tarief hoger is dan dit verhoogt de tarieven van paren exponentieel, zodat de verificatie van de inkapseling verhouding tijdens het dropmaking van cruciaal belang is. Gebruikers moeten bijzonder voorzichtig zijn van de inkapseling van meerdere cellen in een enkele microgel omdat leest uit verschillende cellen delen dezelfde barcode volgorde kunnen niet bioinformatically gescheiden worden. In het geval dat 1 cel ontvangt 2 verschillende barcodes, de barcode groep zuiverheid wordt beïnvloed, hoewel de overvloed statistieken zijn scheef wanneer tellen door barcode opeenvolging.
Druppel kruisbesmetting kan ook ontstaan als gevolg van suboptimaal fusie voorwaarden. Tijdens een succesvolle operatie, kan het apparaat fusie microfluidic (Figuur 5) controllably koppel 1 druppel van de barcode met 1 microgel en een volume van PCR reagens. Niet-ideale debiet zal resulteren in een droplet koppeling op onjuiste verhoudingen: 1 barcode kan worden gecombineerd met 2 microgels, bijvoorbeeld. Alle stroomsnelheid vermeld in het protocol zijn bedoeld om te worden schattingen en moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van lichte variaties in het apparaat geometrie en druppel maten. Gebruikers met toegang tot camera's met snelle opnamemogelijkheden (> 10.000 frames/s) moet controleren of de juiste druppel fusie aan het begin en in de loop van de microfluidic werking. Gebruikers zonder toegang tot een high-speed camera kunnen verzamelen van een klein volume van de samengevoegde output en handmatig de grootte van de druppel onder een microscoop te meten. De grootte van de druppel moeten uniform: een teveel aan niet-samengevoegde barcodes of microgel druppels geeft aan dat de tarieven voor herinjectie dienovereenkomstig moeten worden verminderd.
Enkele algemene voorzorgen moeten worden genomen bij de behandeling van microgels en microdruppels om hun integriteit te behouden. Microgels, moeten hoewel mechanisch robuust, worden voldoende afgekoeld voordat het breken en wassen stappen om ervoor te zorgen volledige gelering. Niet-bolvormige microgels zijn een indicatie dat de agarose niet was voldoende tijd krijgen om te stollen. Bij het wassen van microgels, draaien de schorsingen neer op de vereiste snelheden om te voorkomen dat een verlies van product. Agarose hydrogel kan heeft een brekingsindex nauw overeenkomen met die van water en moeilijk te zien in een buis22, zodat gebruikers zorgvuldig de grens van de gel-liquid vóór aspiratie herkennen moeten. Water-in-olie druppels zijn vatbaar voor samenvoeging door de opbouw van statische krachten23 op laboratorium handschoenen en buizen. Voor deze reden raden wij laden de druppel herinjectie spuiten met blote handen en het behandelen van alle lijnen van de herinjectie met een anti-statische pistool voorafgaand aan de pomp zelfaanzuigende. Grote samengevoegd druppels kunnen worden verwijderd door langzaam draaien de emulsies in een spuit en handmatig aspirating de grotere druppels, die zich in de buurt van de top als gevolg van hun grotere uitbundige kracht ophopen.
SiC-seq is de eerste technologie om aan te tonen van eencellige genoom sequentiebepaling van > 50.000 bacteriecellen. Dit platform biedt aanzienlijke voordelen in doorvoer ten opzichte van de bestaande benaderingen en stelt gebruikers van een diepere bemonstering van heterogene microbiële gemeenschappen. Tot op heden hebben microfluidic technologieën voor eencellige genoom sequencing werkzaam microchambers9 en microwells24 voor cel isolatie en versterking, maar met doorvoercapaciteit in het bereik van slechts tientallen tot honderden van cellen. Het sorteren van de stroom van afzonderlijke cellen in wellplates5,6 vereist geen gespecialiseerde microfluidic instrumentatie maar bezit een eveneens lage doorvoersnelheid. Gezien het feit dat de bodem- en watermonsters in de omgeving hebben vaak Alfa diversiteit van > 1000 op de soorten niveau25,26, SiC-seq is zeer gunstig op grond van haar vermogen om te genieten van een veel groter aantal organismen. De SiC-seq workflow is aangepast aan cel ingangen van laboratoriumcultuur, het natuurlijke milieu of een levende gastheer. Een cel monster moet alleen in een waterige suspensie en vrij van grote deeltjes (> 10 µm) geschikt voor de inkapseling van de microfluidic. De methode heeft bijvoorbeeld eerder toegepast op een steekproef uit zeewater met behulp van een reeks van wassen en filteren van de stappen voor het vooraf verwerken van de cellen vóór de inkapseling17.
Het SiC-seq-protocol genereert een relatief geringe hoeveelheid sequencing gegevens van elke eencellige en mogelijk niet geschikt voor alle toepassingen. Sommige bioinformatics algoritmen zoals DOVO genoom vergadering of één nucleotide variant (SNV) roepen vereisen hogere dekking diepten om effectief te werken. In plaats daarvan, barcode groepen kunnen geclusterde in silico door taxonomische weggooien methoden27 zodat algoritmen kunnen worden toegepast op grotere sets van luidt als volgt. De relatief lage barcoding totaalrendement van de SiC-seq-werkstroom kan ook uitdagingen presenteren in gevallen waarin de beschikbaarheid van het input monster laag is. SiC-seq berust op een Poisson-verdeelde barcode inkapseling stap, dus ongeveer 10% van de cellen een moleculaire barcode ontvangen en worden versterkt tijdens de definitieve bibliotheek voorbereiding stap. Terwijl dit vergelijkbaar met andere regelingen op basis van microdroplet barcoding10 is, gebruikers die werken met kostbare celsteekproeven kunnen ondervindt bij het bereiken van de opbrengst van de voldoende bibliotheek voor het rangschikken en wellicht te verhogen van het aantal cycli van PCR in de finale versterking stap. Een andere mogelijke oplossing voor gebruikers met microfluidic expertise is positieve barcode druppels na de digitale PCR stap, waardoor de algehele efficiëntie van de barcoding te sorteren > 85%28.
Een mogelijke toekomstige koers voor SiC-seq-technologie is de aanpassing van de werkstroom voor gebruik met zoogdiercellen, de weg vrijmaakt voor nieuwe klinische eencellige studies. Als voorbeeld, een analyse van de kopie nummer variatie onder één kanker cellen mei verder van ons begrip van de rol van heterogeniteit in kanker pathologie2. U kunt ook zouden SiC-seq integreren met bestaande methoden voor de sonde en verrijken van de opeenvolgingen van DNA van belang29 de gerichte eencellige sequencing van subpopulaties of zeldzame soorten cellen. Met milieu monsters, kon genen van binnen een bekende metabolische weg worden gericht en contextueel geanalyseerd samen met naburige genen te identificeren roman genomic eilanden. Vanuit een menselijke gastheer-omgeving, laag-titer pathogene bacteriën monsters kunnen worden geïsoleerd en sequenced op het niveau van de eencellige te onderzoeken meer nauw hun genotypische oorsprong van virulentie.

Het genoom dient als een blauwdruk van cellulaire identiteit en functie, met het geheel van een organisme is potentieel codering. Een goed begrip van cellulaire biologie op het niveau van het genoom kan verklaren de waargenomen fenotypische verscheidenheid binnen heterogene cel populaties. Deze heterogeniteit is herkenbaar in biologische systemen en heeft brede implicaties voor de menselijke gezondheid en ziekte. Bijvoorbeeld, zijn exemplaar nummer variaties van het gen onder tumorcellen gekoppeld aan de evolutie en de verspreiding van kanker1,2. In bacteriële infecties, pathogeniteit eilanden aanwezig zijn in een klein deel van het genoom horizontaal kunnen worden overgedragen en leiden tot de verspreiding van antibiotica-resistente bacteriën3,4. Een primaire uitdaging in het genoom eencellige niveau studeren is de lage hoeveelheden DNA beschikbaar, evenals de noodzaak om te analyseren van duizenden cellen om te proeven van de volledige diversiteit van genotypen. Om deze redenen hebben beperkingen in experimentele doorvoer belemmerd de effectiviteit van eencellige studies, vertekenende resultaten naar de meest voorkomende cellen. Eencellige isolatie technieken zoals stroom sorteren5,6, optisch pincet7, verankering in bulk gels8, en microfluidics9 oplossingen kunnen verwerken van honderden cellen voor het rangschikken; Dit is echter slechts een klein deel van de meeste monsters. Een methode voor eencellige genoom sequencing met aanzienlijk hogere doorvoer zou dieper en meer volledig profilering van cel populaties, waardoor het ophelderen van de rol van de genotypische verscheidenheid binnen deze Gemeenschappen.
Druppel microfluidics kunt de manipulatie van de high-throughput van cellen en biologische reagentia binnen miljoenen picoliter-schaal reactoren. Tot op heden, microdroplet technologieën zijn gebruikt voor het bestuderen van differentiële expressiepatronen onder cellen van heterogene weefsels10,11,12, diep volgnummer lange moleculen13,14 ,15, en gedrag chromatine immunoprecipitation sequencing (ChiP-seq) analyses over de afzonderlijke cellen16. Inderdaad, microdruppels zijn geschikt voor high-throughput, verzuilde operaties, waardoor ze zich lenen voor toepassingen in de eencellige genomica. De ontwikkeling van deze technologie presenteert haar eigen unieke technologische uitdagingen, echter. Cellen moeten worden lysed, gezuiverd en versterkt met minimale bias, uniform monster cel populaties. Bovendien, in tegenstelling tot polyadenylated mRNA afschriften in zoogdiercellen is er geen vergelijkbare moleculaire motief in het genoom ter vergemakkelijking van de opname van het doel nucleic zuur. Eencellige genoom sequencing is al deze redenen moeilijk uit te voeren in microdroplet platformen.
In dit werk bieden wij een gedetailleerd protocol van onze eerder gemelde eencellige microfluidic aanpak staat rangschikkend het genoom van tientallen duizenden van cellen in een enkele experiment17. Met deze technologie, genaamd SiC-seq, bacteriële cellen zijn ingekapseld in micron-schaal hydrogels individueel lysed, tagmented, en samengevoegd met een microdroplet met een unieke oligonucleotide barcode, die is verbinding aan de randen aan de genomic DNA van de cel via een één overlapping extensie polymerase-kettingreactie (PCR). De hydrogels dienen als geïsoleerde containers waarin hoog-moleculair-gewicht genomic DNA is sterically ingekapseld, waardoor kleinere moleculen zoals detergenten en lytische enzymen te openen en te zuiveren van DNA vóór barcoding18. Dit protocol verwerkt > 50.000 afzonderlijke cellen in een kwestie van uren, wat resulteert in een barcoded bibliotheek klaar voor het rangschikken. Na de sequencing zijn de leest demultiplexed volgens hun eencellige barcode volgorde, wat resulteert in een dataset bestaat uit miljoenen leest, elk met een cellulaire index.

<table><tbody><tr><td>3" silicon wafers, P type, virgin test grade</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 fotoresist</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Fotomaskers</td><td>CadArt Servcies</td><td>(op maat)</td><td>Zie aanvullende bestanden voor masker ontwerpen</td></tr><tr><td>PGMEA ontwikkelaar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 siliconen elastomeer kit</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Ontgassingskamer</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm biopsie punch</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Glazen microscoopglazen (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (hydrofobe glasbehandeling)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 polyethyleen buis</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuiten</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge naalden</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Spuitenpomp</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 gefluorineerde olie (HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 gefluorineerde olie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE oppervlakteactieve stof</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>Kachel</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, lage geleertemperatuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7,4</td><td>E&amp;K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (dichtheidsgradiënt medium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (sorbitaan monooleaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbaat 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym Type IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (gist lytisch enzym)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lysostatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumborylsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (nucleïnezuurkleuring)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (octylfenol ethoxylaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermische polymerase)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT buffer van Nextera XT kit (neutralisatiebuffer)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Koude kathode fluorescente omvormer</td><td>(op maat)</td><td>(op maat)</td><td></td></tr><tr><td>DC voeding</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 antistatische pistool</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>3D-geprinte centrifuge spuithouder</td><td>(op maat)</td><td>(op maat)</td><td>Zie aanvullende bestanden voor 3D print bestand</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

een met-throughput microfluidic platform voor eencellige genoom sequencing

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologieën hebben ondergaan een paradigmaverschuiving van bulk naar eencellige resolutie naar aanleiding van een evoluerend begrip van de rol van cellulaire heterogeniteit in biologische systemen. Eencellige sequentiebepaling van grote populaties heeft echter belemmerd door beperkingen in verwerkt genoom voor het rangschikken. In deze paper beschrijven we een methode voor eencellige genoom sequencing (SiC-seq), die gebruik maakt van druppel microfluidics te isoleren, te versterken en barcode het genoom van afzonderlijke cellen. Cel inkapseling in microgels staat de verzuilde zuivering en de tagmentation van DNA, terwijl een fusie microfluidic efficiënt elke genoom met een unieke eencellige oligonucleotide barcode paren, waardoor > 50.000 afzonderlijke cellen te worden sequenced per run. De gegevens rangschikken is door barcode, genereren van groepen die afkomstig zijn van afzonderlijke cellen leest demultiplexed. Als een hoge-doorvoer en lage-bias methode van eencellige sequencing kunnen SiC-seq een breder scala van genomic studies gericht op verschillende cel populaties.

De experimentele workflow van SiC-seq bevat 3 PDMS microfluidic apparaten vervaardigd met behulp van een zachte lithografie procedure (Figuur 1). Een co stroom dropmaker (figuur 3A) genereert 25 µm van digitale barcode druppels voor het labelen van genomic DNA met een unieke id van de eencellige. De barcode oligonucleotides bestaan uit een 15 bp gedegenereerde reeks geflankeerd door PCR grepen voor amplificatie (tabel 2, BAR primer). De streepjescodes zijn verdund tot de concentratie van een femtomolar om de single-molecuul inkapseling, en alle druppels ontvangen ofwel 0 of 1 barcode-fragment(s). De druppels met een streepjescode worden versterkt, vele kopieën van double-stranded barcode waarbij oplevert. Een nucleïnezuur vlek wordt gebruikt om te controleren of de succesvolle versterking en kwantificeren van het tarief van de inkapseling van de barcode fragmenten (figuur 4B). De microgels worden gegenereerd door mede stroomt een bacteriële celsuspensie en een gesmolten agarose gel op gelijke debiet (figuur 2A). De agar bereid is op twee maal de gewenste eindconcentratie, zoals de co stroom dropmaking proces effectief de waterige oplossingen met een factor 2 verdunt. Als de agarose afkoelt, dan stolt het in een 25 µm diameter microgel bezetten de sferische omvang van de druppel.
Een reeks van lysis en wassen stappen zuivert de genomic DNA van hoog-moleculair-gewicht in het microgels (figuur 2B). Na het breken van de emulsies, zijn waterige wast uitgevoerd in grote volumes om te verdunnen uit trace organische oplosmiddelen die de downstream enzymatische behandelingen kunnen remmen. De gewassen microgels worden waargenomen onder een microscoop om te controleren of de snelheid inkapseling cel (figuur 4A). Een cocktail van enzymen met brede lytische activiteit wordt toegevoegd aan de schorsing van de microgel om te verteren de celwanden van de bacteriën en eukaryoten microben19. Een tweede behandeling met proteïnase K en afwasmiddel degradeert de eiwitten en lost cel puin.
Tagmentation van het gezuiverde DNA wordt uitgevoerd in druppels om te voorkomen dat potentiële kruisbesmetting ten gevolge van de verspreiding van kleine tagmented DNA-fragmenten tussen de microgels-18. Een droplet inkapseling apparaat (figuur 3B) compartmentalizes elk microgel met een buffer en tagmentation enzym, die gelijktijdig double-stranded DNA fragmenten terwijl ook "tagging" het met een voorgeladen oligonucleotide20. De microgels worden geladen in de druppels als sluiten boordevol deeltjes, bereiken van inkapseling tarieven naderen van 1 microgel voor elke druppel met enkele paren21 (figuur 4C).
In de laatste stap van de workflow van de microfluidic (figuur 2C) bewerking een apparaat een dubbele fusie combineren 1 barcode druppel, 1 microgel-bevattende drop en de versterking mix in een gecontroleerde stappen. Eerst is een droplet met PCR reagens gekoppeld en samengevoegd met een daling van de streepjescode in de regio weergegeven in geel (Figuur 5). Zoutwater elektroden in het kanaal microfluidic produceren een hoog elektrisch veld verloop die de druppel fusie triggers. Op een vergelijkbare manier, is de eerste samengevoegde druppel gecombineerd met een druppel microgel en een tweede keer samengevoegd in de regio in het rood weergegeven. De druppels zijn verzameld en thermische fietste off-chip in een single-overlapping extensie (SOE) PCR. De overlappende complementaire uiteinden van de barcode en de genomic DNA van tagmented toestaan kernversmelting en de exponentiële versterking van alleen goed barcoded constructies.
De gegevens rangschikken is eerst gefilterd door een lees kwaliteit en vervolgens geparseerd door groepering van het luidt volgens de volgorde van hun 15-bp eencellige barcode. Voor een fractie van de barcode aan als geldig worden beschouwd, moet daarin een minimumaantal leest; Deze drempelmethode beperkt de analyse op cellen met een nuttige hoeveelheid sequencing gegevens en verwijdert de PCR-gemuteerd barcode "wezen" van de dataset. In dit voorbeeld uitvoert, het minimum is ingesteld op 7,5 kbps per groep (50 leest van 150 bp elk). Een histogram van de graven van de barcode ten opzichte van de grootte van de groep blijkt dat een aanzienlijk deel van de geldige barcode groepen net boven de grootte van de drempel (figuur 6A).
In een controle-experiment waar de samenstelling van de microbiële Gemeenschap is bekend, worden de zuiverheid en de relatieve overvloed statistieken gebruikt om te evalueren van de kwaliteit van een SiC-seq uitvoeren. Hier, wordt een synthetische 10-cel-Gemeenschap, bestaande uit 3 gram-negatieve bacteriën, 5 gram-positieve bacteriën, en 2 gisten geanalyseerd. De zuiverheid van de groep van een bepaald streepjescode wordt gedefinieerd als het aantal leest toewijzen aan de meest voorkomende genoom in de groep gedeeld door het totale aantal leest in de groep. De overgrote meerderheid van de barcode-groepen hebben purities groter dan 0.95 (figuur 6B). Relatieve abundantie van de celtypes wordt berekend door het tellen van de ruwe leest en door het tellen van de barcode-groepen, waar de groepen een celtype overeenkomt aan de consensus van zijn lid luidt als volgt (Figuur 6 c) zijn toegewezen. De overvloed van leest en barcode groepen bijhouden in ongeveer dezelfde verhoudingen, die aangeeft dat de populaties van de cel wordt bemonsterd zodanig dat bepaalde soorten niet in onevenredig klein of groot barcode groepen zijn opgenomen. Uitzetten van de statistische dekking van alle groepen van de barcode van een soort geeft een hoge dekking over het gehele genoom, met weinig of geen uitval regio's (Figuur 7). De uniformiteit van de dekking kan worden gecontroleerd met een frequentieverdeling van genormaliseerde dekking waarden, met de meeste waarden gecentreerd rond het gemiddelde (Figuur 7, inzet).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figuur 1 : Fabricage van microfluidic apparaten door fotolithografie. (A) Master mallen met een hoogte van één functie zijn vervaardigd door spin coating van een laag van SU-8 fotoresist op een silicium wafer. De fotoresist is vervolgens patroon met een photolithographic masker en UV-licht, crosslinking de blootgestelde SU-8. Tot slot, uncrosslinked SU-8 wordt opgelost in een bad van de ontwikkelaar. De resulterende schimmel wordt te werpen PDMS die is gebonden aan een glasplaatje te produceren het volledige microfluidic-apparaat gebruikt. ()B) voor een dubbellaags apparaat, de fabricage ook begint met spin coating en blootstelling stappen. Deze stappen worden vervolgens herhaald om een twee-laag-apparaat te creëren. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figuur 2: Overzicht van de werkstroom SiC-seq. (A) A microbiële schorsing is mede vloeide met gesmolten agarose in een dropmaker apparaat om in te kapselen afzonderlijke cellen in microgels. (B) de microgels zijn onderworpen aan een reeks wasbeurten te zuiveren van de bacteriële genomic DNA. Lytische enzymen verteren de celwanden van gram-positieve bacteriën en gisten en wasmiddel lost het cellulaire puin. De microgels zijn opnieuw ingekapselde in druppels voor de tagmentation om de kruisbesmetting. (C) de microfluidic-fusie combineert een digitale PCR barcode, een tagmented microgel genoom en een mix van versterking een tempo > 1 kHz. Off-chip SOE-PCR Splits een unieke eencellige barcode op het tagmented genoom en selectief versterkt volledig barcoded constructies. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figuur 3: Microfluidic apparaten voor de inkapseling van dropmaking en microgel opnieuw. (A) dit paneel toont een co stroom dropmaker (25 µm van functie hoogte). Cellen en gesmolten agarose zijn ingevoerd in het apparaat op gelijk debiet tot 25 µm druppels afslag een 25 µm x 25 µm. Voor de digitale barcode dropmaking, de inlaat van de cel is aangesloten en een PCR-mix wordt binnengebracht in de agarose inlaat. (B) dit paneel toont een microgel opnieuw inkapseling apparaat (25 µm van functie hoogte). De microgels uitmonden in een trechtervormige inlaat te handhaven hun sluiten boordevol bestellen en ontvangen van een volume van tagmentation mix voorafgaand aan de nieuwe inkapseling op een kruispunt van 25 µm x 30 µm. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figuur 4 : Microfoto van druppels en microgels. (A) dit paneel toont 25 µm microgels voorafgaand aan de lysis van de enzymatische gewassen. De bacteriën zijn fluorescently gekleurd voor de kwantificering van de inkapseling tarief. Poisson laden statistieken dicteren dat de cellen moeten ingekapseld met een snelheid van 1: 10 druppels of minder om te minimaliseren van de frequentie van meerdere-inkapseling gebeurtenissen. (B) dit paneel toont een fluorescentie microscopie beeld van 25 µm digitale barcode druppels behandeld met een vlek van nucleïnezuur. De druppels met versterkte barcode fragmenten produceren een sterke fluorescentie-signaal. (C) dit paneel toont microgels opnieuw ingekapseld in 50 µm dalingen. De sluiten-verpakking van de microgels zorgt voor inkapseling tarieven 1 gel per druppel met enkele paren naderen. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figuur 5 : Microfluidic dubbele fusie apparaat voor eencellige genoom barcoding. Een bewerking in twee fasen fusie paren barcode druppels met tagmented genomen op een hoge gegevensdoorvoer. Een druppel van de PCR-mix is eerst gegenereerd en samengevoegd met een barcode-droplet in de regio weergegeven in geel met zoutwater elektroden. Vervolgens is een droplet met een microgel ingevoerd en een tweede keer samengevoegd in de regio in het rood weergegeven. Olie inhammen zorgen voor nauwkeurige controle van de afstand tussen de reinjected druppels. De barcode herinjectie kamer en haar spacer olie worden geplaatst op de kortere laag van 25 µm, blauw gearceerd. Alle andere functies van het apparaat behoren tot de dikkere laag met 45 µm van totale hoogte. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figuur 6 : Barcode groep statistieken voor een 10-cel synthetische microbiële Gemeenschap. (A) dit paneel toont de verdeling van de streepjescode groep maten. Het aantal groepen van een gegeven grootte afneemt exponentieel naarmate de groep groter. Een minimum van 7,5 kbps per groep beperkt de analyse aan groepen met een voldoende hoeveelheid informatie en verwijdert de volgorde van PCR-gemuteerd "wezen." (B) dit paneel toont de verdeling van de barcode groep purities. De overgrote meerderheid (> 90%) groepen zijn van zeer hoge zuiverheid (> 95%). (C) dit paneel toont de relatieve overvloed van 10 soorten berekend op groepsniveau Lees- en barcode. De 2 tellen methoden geven vergelijkbare resultaten, die aangeeft dat de grootte van de groep streepjescode over soorten stroken. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figuur 7 : Aggregate genomic dekking van Bacillus subtilis barcode groepen. Het lezen van alle de barcode-groepen toewijzen aan de bacterie B. subtilis (N = 9,398) worden samengevoegd en geanalyseerd in totaal. Een circulaire dekking kaart illustreert de uniformiteit van de dekking van de SiC-seq luidt, met geen waarneembare dropout regio's. Een onderbroken lijn rond de omtrek geeft aan de gemiddelde dekking (5,55 x). Het histogram van de inzet van de frequenties van de relatieve dekking geeft dat een bulk van de basissen vallen op een diepte in de buurt van het genoom-brede gemiddelde, vertegenwoordigd door de stippellijn. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Apparaat</td>
			<td>1ste laaghoogte (µm)</td>
			<td>1e laag Spin snelheid (rpm)</td>
			<td>2de laaghoogte (µm)</td>
			<td>2de laag Spin snelheid (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Co stroom dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/B</td>
			<td>N/B</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gel re encapsulator</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/B</td>
			<td>N/B</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dubbele fusie</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Microfluidic apparaat fabricage parameters. Deze tabel toont een overzicht van de apparaten van de microfluidic die worden gebruikt in de workflow van de SiC-seq met hun vereiste snelheden voor fotoresist spin coating (gebaseerd op de specificaties van de fabrikant voor SU-8 3025).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Label</td>
			<td colspan="5">Volgorde (5' > 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primer sequenties.
Aanvullende bestand 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken > 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Het algemene doel van dit experiment is om barcoded genomische sequencinggegevens te genereren van tienduizenden enkele cellen met behulp van een reeks microfluïdische apparaten. Deze methode bereikt ongekende single-cell sequencing doorvoer. We gebruiken microfluidica om cellen afzonderlijk te inkapselen, te lyseren en te barcoden, waardoor de onderliggende genomische heterogeniteit behouden blijft, die verloren gaat in conventionele shock bij sequencing studies.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het hoge doorvoer heeft en in staat is om single-cell data te produceren van tienduizenden cellen. Hoewel we in deze demonstratie met microben werken, kan de workflow worden aangepast voor gebruik met verschillende celtypen door kleine wijzigingen in de afmetingen van het microfluïdisch apparaat. Om het protocol te beginnen, bereid je een milliliter van 3% gewicht per volume laagsmeltende temperatuur agarose in 1X Tris-EDTA, of TE, buffer voor.Houd de agaroseoplossing op een 90 graden Celsius warmteblok tot aan het laden van de spuit. Resuspendeer cellen in een milliliter fosfaat-gebufferd zout, of PBS, en centrifugeer de cellen. Aspireer de supernatant en resuspendeer het celpellet in een milliliter van 17%volume op volume dichtheidsgradiënt medium in PBS, en houd de cellen op ijs tot het laden van de spuit.Laad vervolgens een drie-milliliter spuit met gefluorineerde olie, of HFE, die een 2%gewicht per gewicht PFPE-PEG oppervlakteactieve stof bevat. Pas deze voorzien van een 27-gauge naald, en plaats deze in een spuitpomp. Laad de celsuspensie en gesmolten agarose in een-milliliter spuiten, beide voorzien van 27-gauge naalden, en plaats deze in spuitpompen.Stel vervolgens een ruimteverwarming in op hoog en plaats het verwarmingsoppervlak 10 centimeter van de spuit. Zorg ervoor dat de temperatuur gemeten aan de spuit ongeveer 80 graden Celsius is. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen.Verbind de spuitnaalden met de microfluïdische apparaat inlaten met behulp van stukken polyethyleen, of PE, buis. Verbind een stuk buis met de uitlaat en plaats het vrije einde in een 15-milliliter verzamelbuis. Plaats na het druppelen de verzamelbuis gedurende 30 minuten op vier graden Celsius om de volledige gelering van de agarose te waarborgen.Verwijder de onderste olie laag van de verzamelbuis met behulp van een drie-milliliter spuit voorzien van een 20-gauge naald, zorg ervoor dat je de bovenste laag van de agarose druppels niet verstoort. Voeg een milliliter van 10%volume per volume PFO in HFE toe om de agarose druppels van hun oppervlakteactieve laag te scheiden. Pipet de oplossing gedurende een minuut op en neer om de emulsies grondig te coaten, die homogeen en vrij van klonten moeten zijn.Centrifugeer de conische buis gedurende één minuut bij 2.000 keer g om de agarose microgels te verzamelen. Aspireer de PFO/HFE supernatant en zorg ervoor dat de microgels nu vrij zijn van hun oppervlakteactieve laag en helder zijn. Na het wassen van de microgels, verifieer de cel inkapsling in de microgels onder een microscoop bij een 400X vergroting door een 10-microliter aliquot van gels te kleuren met 1X nucleïnezuur kleurstof.Plug de cellen inlaat van een co-flow druppelmaker apparaat met een klein stukje lood soldeer. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen. Verbind een stuk buis met de uitlaat en plaats het vrije einde in een 0,2-milliliter PCR buis.Gebruik de stroomsnelheden op het scherm voor het druppelen. Verzamel de druppels in de PCR buizen met ongeveer 50 microliter druppels in elke buis. Na het druppelen, verwijder voorzichtig de onderste laag HFE olie van de emulsies met behulp van gel-laad pipette tips en vervang het met FC-40 gefluorineerde olie bevattend een 5%gewicht per gewicht PFPE-PEG oppervlakteactieve stof.Programmeer vervolgens de thermische cyclus. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen. Verbind de spuiten bevattend HFE, tagmentation mix, en microgels met de microfluïdische apparaat inlaten met behulp van stukken PE buis.Verbind een stuk buis met de uitlaat en plaats het vrije einde in een lege een-milliliter spuit met de zuiger getrokken tot de een milliliter lijn. Verifieer vervolgens de microgel inkapslingssnelheid onder een licht microscoop bij 400X vergroting. Pas de spuit bevattend de tagmentation emulsies voorzien van een naald en incubeer deze rechtop in een warmteblok of oven gedurende één uur bij 55 graden Celsius om het genomische DNA te fragmenteren.Bereid de barcode druppels voor de fusie voor door de FC-40 oliefractie te vervangen door HFE 2%gewicht per gewicht PFPE-PEG. Breng de druppels voorzichtig over in een een-milliliter spuit, pas deze voorzien van een naald en plaats deze in een spuitpomp. Laad de geïncubeerde en getagmenteerde microgel druppel spuit in een spuitpomp.Verbind vervolgens de drie natriumchloride spuiten met de twee elektrode inlaten en enkele moat inlaat met behulp van stukken PE buis. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen. Verbind de drie HFE spuiten gemonteerd op pompen met de twee spacer olie inlaten en druppelmakende olie inlaat met behulp van stukken PE buis.Schiet vervolgens alle druppel reinjectie buizen met een antistatische pistool voordat je de buizen verbindt met de spuitnaalden. Verbind de PCR mix spuit, microgel druppel spuit, en barcode druppel spuit met hun respectieve inlaten met PE buis. Verbind de naald van de elektrode spuit met een koude kathode fluorescente omvormer met behulp van een alligator clip.Stel de DC voeding van de omvormer in op twee volt. Laat het dubbele fusie apparaat draaien met de aanbevolen stroomsnelheden. Verzamel de druppels in PCR buizen met ongeveer 50 microliter emulsie in elke buis.Voor de thermische cyclus, verwijder voorzichtig de on

an-ultrahigh-throughput-microfluidic-platform-for-single-cell-genome

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes (0,15–1,5 ml) deeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat, en bespreekt methoden om de prestaties en werking van acoustofluïdische apparaten te optimaliseren.

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Nanogaatje sequencing is een nieuwe technologie die het mogelijk maakt kosteneffectieve sequencing in afgelegen locaties en resource-arme instellingen. Hier, presenteren wij een protocol voor het rangschikken van mRNAs van geheel bloed dat met dergelijke voorwaarden compatibel is.

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Het fabricageproces van een op PDMS gebaseerd, meerlaagse, microfluïdisch apparaat waarmee in vitro transcriptie-en vertalings Reacties (IVTT) gedurende langere perioden kunnen worden uitgevoerd, wordt beschreven. Bovendien wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de hardware en software die nodig is voor het automatiseren en onderhouden van deze reacties voor langdurige duur.

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Leer een high-throughput microfluidic workflow voor eencellige genoomsequencing met behoud van genomische heterogeniteit. Deze methode sequencet tienduizenden cellen individueel voor nauwkeurige profilering.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Meer video's verkennen