Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Het algemene doel van dit experiment is om barcoded genomische sequencinggegevens te genereren van tienduizenden enkele cellen met behulp van een reeks microfluïdische apparaten. Deze methode bereikt ongekende single-cell sequencing doorvoer. We gebruiken microfluidica om cellen afzonderlijk te inkapselen, te lyseren en te barcoden, waardoor de onderliggende genomische heterogeniteit behouden blijft, die verloren gaat in conventionele shock bij sequencing studies.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het hoge doorvoer heeft en in staat is om single-cell data te produceren van tienduizenden cellen. Hoewel we in deze demonstratie met microben werken, kan de workflow worden aangepast voor gebruik met verschillende celtypen door kleine wijzigingen in de afmetingen van het microfluïdisch apparaat. Om het protocol te beginnen, bereid je een milliliter van 3% gewicht per volume laagsmeltende temperatuur agarose in 1X Tris-EDTA, of TE, buffer voor.

Houd de agaroseoplossing op een 90 graden Celsius warmteblok tot aan het laden van de spuit. Resuspendeer cellen in een milliliter fosfaat-gebufferd zout, of PBS, en centrifugeer de cellen. Aspireer de supernatant en resuspendeer het celpellet in een milliliter van 17%volume op volume dichtheidsgradiënt medium in PBS, en houd de cellen op ijs tot het laden van de spuit.

Laad vervolgens een drie-milliliter spuit met gefluorineerde olie, of HFE, die een 2%gewicht per gewicht PFPE-PEG oppervlakteactieve stof bevat. Pas deze voorzien van een 27-gauge naald, en plaats deze in een spuitpomp. Laad de celsuspensie en gesmolten agarose in een-milliliter spuiten, beide voorzien van 27-gauge naalden, en plaats deze in spuitpompen.

Stel vervolgens een ruimteverwarming in op hoog en plaats het verwarmingsoppervlak 10 centimeter van de spuit. Zorg ervoor dat de temperatuur gemeten aan de spuit ongeveer 80 graden Celsius is. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen.

Verbind de spuitnaalden met de microfluïdische apparaat inlaten met behulp van stukken polyethyleen, of PE, buis. Verbind een stuk buis met de uitlaat en plaats het vrije einde in een 15-milliliter verzamelbuis. Plaats na het druppelen de verzamelbuis gedurende 30 minuten op vier graden Celsius om de volledige gelering van de agarose te waarborgen.

Verwijder de onderste olie laag van de verzamelbuis met behulp van een drie-milliliter spuit voorzien van een 20-gauge naald, zorg ervoor dat je de bovenste laag van de agarose druppels niet verstoort. Voeg een milliliter van 10%volume per volume PFO in HFE toe om de agarose druppels van hun oppervlakteactieve laag te scheiden. Pipet de oplossing gedurende een minuut op en neer om de emulsies grondig te coaten, die homogeen en vrij van klonten moeten zijn.

Centrifugeer de conische buis gedurende één minuut bij 2.000 keer g om de agarose microgels te verzamelen. Aspireer de PFO/HFE supernatant en zorg ervoor dat de microgels nu vrij zijn van hun oppervlakteactieve laag en helder zijn. Na het wassen van de microgels, verifieer de cel inkapsling in de microgels onder een microscoop bij een 400X vergroting door een 10-microliter aliquot van gels te kleuren met 1X nucleïnezuur kleurstof.

Plug de cellen inlaat van een co-flow druppelmaker apparaat met een klein stukje lood soldeer. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen. Verbind een stuk buis met de uitlaat en plaats het vrije einde in een 0,2-milliliter PCR buis.

Gebruik de stroomsnelheden op het scherm voor het druppelen. Verzamel de druppels in de PCR buizen met ongeveer 50 microliter druppels in elke buis. Na het druppelen, verwijder voorzichtig de onderste laag HFE olie van de emulsies met behulp van gel-laad pipette tips en vervang het met FC-40 gefluorineerde olie bevattend een 5%gewicht per gewicht PFPE-PEG oppervlakteactieve stof.

Programmeer vervolgens de thermische cyclus. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen. Verbind de spuiten bevattend HFE, tagmentation mix, en microgels met de microfluïdische apparaat inlaten met behulp van stukken PE buis.

Verbind een stuk buis met de uitlaat en plaats het vrije einde in een lege een-milliliter spuit met de zuiger getrokken tot de een milliliter lijn. Verifieer vervolgens de microgel inkapslingssnelheid onder een licht microscoop bij 400X vergroting. Pas de spuit bevattend de tagmentation emulsies voorzien van een naald en incubeer deze rechtop in een warmteblok of oven gedurende één uur bij 55 graden Celsius om het genomische DNA te fragmenteren.

Bereid de barcode druppels voor de fusie voor door de FC-40 oliefractie te vervangen door HFE 2%gewicht per gewicht PFPE-PEG. Breng de druppels voorzichtig over in een een-milliliter spuit, pas deze voorzien van een naald en plaats deze in een spuitpomp. Laad de geïncubeerde en getagmenteerde microgel druppel spuit in een spuitpomp.

Verbind vervolgens de drie natriumchloride spuiten met de twee elektrode inlaten en enkele moat inlaat met behulp van stukken PE buis. Voordat je de buizen in het apparaat inbrengt, prime de pompen om de lucht uit de leiding te verwijderen. Verbind de drie HFE spuiten gemonteerd op pompen met de twee spacer olie inlaten en druppelmakende olie inlaat met behulp van stukken PE buis.

Schiet vervolgens alle druppel reinjectie buizen met een antistatische pistool voordat je de buizen verbindt met de spuitnaalden. Verbind de PCR mix spuit, microgel druppel spuit, en barcode druppel spuit met hun respectieve inlaten met PE buis. Verbind de naald van de elektrode spuit met een koude kathode fluorescente omvormer met behulp van een alligator clip.

Stel de DC voeding van de omvormer in op twee volt. Laat het dubbele fusie apparaat draaien met de aanbevolen stroomsnelheden. Verzamel de druppels in PCR buizen met ongeveer 50 microliter emulsie in elke buis.

Voor de thermische cyclus, verwijder voorzichtig de on