Een Protocol bij het verwerven van de degeneratieve Tenocyte van de mens

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de biologie van menselijke degeneratieve tenocyten, omdat slechts weinig onderzoeken de isolatie en het kweken van menselijke degeneratieve tenocyten in detail hebben beschreven. Het grote voordeel van deze techniek is dat we menselijke degeneratieve tenocyten kunnen verkrijgen zonder aanvullende schade aan de patiënt, omdat het degeneratieve weefsel wordt verkregen tijdens standaard epicondylitis-chirurgie. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Soo-Hong Han, Minjung Baek en Hyung Kyung Kim van mijn niveau drie.

Om een degeneratief tendocytweefselmonster te verkrijgen, gebruikt u een chirurgisch scalpel nummer 15 om een huidsnede van drie tot vijf centimeter te maken, net vooraan mediaal ten opzichte van de laterale epicondyle en proximaal van het gewrichtsniveau om de laterale elleboog bloot te leggen en de extensor carpi radialis longus in de extensor aponeurosis-interface visueel te lokaliseren. Gebruik het scalpel om een splitsende insnijding van twee tot drie millimeter diep te maken tussen de extensor carpi radialis longus en de extensor aponeurosis op het interface. Na anteriore retractie van de extensor carpi radialis longus, lokaliseer het pathologische degeneratieve weefsel door zijn karakteristieke doffe grijze kleur en typisch oedemaatse en broze weefsel, en gebruik het scalpel en mini-blades om voorzichtig, maar scherp, al het degeneratieve weefsel te reseceren.

Wanneer al het weefsel is geoogst, sluit u de wond met niet-absorbeerbaar hechtmateriaal volgens standaardprotocollen en verwijdert u voorzichtig al het omliggende weefsel van een ongeveer een kubieke centimeter groot weefselmonster, waarbij u het schone peesweefsel in 10 milliliter PBS plaatst zodra het is bijgesneden. Fixeer vervolgens ongeveer de helft van het geoogste weefsel in neutraal gebufferd 10% formaline in een chemische fume hood gedurende 12 uur. Om een tenocytencultuur op te zetten, brengt u de andere helft van de geoogste controle- en gedegenereerde weefselmonsters over in afzonderlijke weefselkweekschalen met vers PBS en snijdt de weefsels in een kubieke meter of kleinere stukken, verteer de weefselfragmenten in 30 milliliters DMEM aangevuld met 30 milligram per milliliter collageenase twee per weefselgroep bij 37 graden Celsius gedurende één uur.

Aan het einde van de vertering, filter de celoplossingen door individuele 100 micron celstrainers en deactiveer de collageenase met één milliliter FBS per buis. Verzamel de tenocyten door centrifugatie en suspendeer de pellets op drie keer 10 tot de vijfde cellen per 10 milliliters DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% antibioticum, antimycotische oplossingconcentratie. Zaai vervolgens de cellen in één 100 centimeter kweekschaal per conditie en kweek de tenocyten in een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide-incubator gedurende één week, waarbij het kweekmedium om de drie dagen wordt ververst totdat een 80% confluëntie is bereikt.

Voor immunocytochemische analyse, breng twee keer 10 tot de vijfde cellen in 200 microliters vers medium over naar elke put van één acht-putkamerschaal per experimentele groep en laat de cellen gedurende 24 uur naar confluëntie groeien. De volgende dag, was de cellen met PBS, gevolgd door fixatie met 500 microliters van 4% formaldehyde per put, en permeabilisatie met 0,5% triton X 100 in PBS gedurende 10 minuten. Om niet-specifieke binding te blokkeren, incubeer de cellen met 1% bovien serumalbumine en 0,05% Tween 20 in PBS, zoals experimenteel gepast, gevolgd door incubatie met de fluorescerend gelabelde primaire antilichamen van belang bij vier graden Celsius gedurende de nacht beschermd tegen licht.

De volgende ochtend, label de cellen met de juiste secundaire antilichamen gedurende één uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht en monteer de monsters met 0,5 microliter van een geschikt fluorescentie montagemedium per kamer. Beeld vervolgens de monsters af op een fluorescentiemicroscoop onder een 400-voudig objectief. Voor pathologische analyse van het weefsel, bedden de formele en gefixeerde controle- en gedegenereerde peesweefselmonsters in vier tot vijf milliliter paraffine en verwerf vier tot vijf micrometer secties van elke paraffineblok.

Voor hematoxyline in eosina, of H&E-kleuring, deparaffiniseer de monsters met drie vijf-minuten-onderdompeling in xyleen gevolgd door hydratatie met gegradueerde ethanolonderdompeling en een twee-minuten-tapwaterwas. Label vervolgens de monsters met hematoxyline gedurende vijf minuten, gevolgd door nogmaals een twee-minuten waterwas. Dompel de gespoelde monsters drie seconden in 1% zoutzuur en 70% ethanol, gevolgd door een drie-minuten waterwas.

Neutraliseer het zuur met een 10-seconden-dip in 0,5% ammoniak, gevolgd door nogmaals een drie-minuten waterwas. Label de geneutraliseerde monsters met de eosina gedurende vijf minuten, en dehydrateer de H&E-gekleurde monsters met gegradueerde ethanolonderdompeling. Na drie xyleenonderdompelingen, monteer de monsters met een geschikt montagemedium en een dekglas.

Voer immunohistochemische analyse van de weefselmonsters uit met behulp van de bond-polymeer verfijnde detectiekit volgens de instructies van de fabrikant met de volgende kleine wijzigingen. Na deparaffinisatie met xyleen zoals gedemonstreerd, dompel de monsters gedurende 30 minuten in bond-epitoop-retrieval-oplossing bij 100 graden Celsius voor antigeenretrieval, gevolgd door een vijf-minuten-incubatie in waterstofperoxide om eventuele endogene peroxidase te dempen. Label vervolgens de secties gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur met de primaire antilichamen van belang.

Aan het einde van de incubatie, label de monsters met het geschikte biotin-vrije polymeerpaardenradenzymperoxidase-linker secundaire antilichaamconjugaatsysteem gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur. Monteer vervolgens de secties met een dekglas in het geschikte montagemedium en beeld de monsters af op een lichtmicroscoop bij een 400-voudig vergroting. H&E-analyses onthullen dat weefsel dat is geoogst uit de gedegenereerde laterale epicondylitis disorganiseerde collageenbundels met een verlies van