Name: Visualisatie van amyloïde β-depositos in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer amyloïde β-deposito's visualiseren in menselijke hersenen met MALDI-IMS voor Alzheimeronderzoek. Deze methode onthult de ruimtelijke verdeling van amyloïde peptiden in hersenweefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (hersenen eiwitten veroudering en dementie controle 26117004; mi en T.M.). Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het strategische onderzoeksprogramma voor hersenen Wetenschappen van het Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren voor het aankomen.

Hier, werden weefselsteekproeven verzameld in het Tokyo Metropolitan geriatrisch ziekenhuis, waarmee gemeenschapsgerichte medische zorg aan ouderen in Japan. De hersenen autopsie monsters gebruikt in de studie werden geregistreerd aan de hersenen Bank voor veroudering onderzoek (BBAR) met de geïnformeerde toestemming van de overledene familieleden. De BBAR is goedgekeurd door de ethische commissie van de Tokyo Metropolitan geriatrisch ziekenhuis en Instituut voor gerontologie. Voor alle hersenen geregistreerd bij de bank van de hersenen, verkregen we schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het gebruik ervan voor medisch onderzoek de patiënten en hun families. De patiënten werden geplaatst in een kamer koud (4 ° C) binnen 2 uur na dood om postmortem veranderingen in de hersenen. Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door Doshisha University en de hersenen Bank voor veroudering onderzoek, Tokyo Metropolitan geriatrisch ziekenhuis en Instituut voor gerontologie.
1. bereiding van weefselsecties IMS
<ol><li>Verwerking van weefsel specimen van een menselijk autopsied brein Opmerking: Zorg ervoor dat de sample voorbereiding stap voor IMS de oorspronkelijke toestand van het weefsel behoudt. Vermijd besmetting en post mortem veranderingen. De volgende stap is cruciaal.<ol>
<li>Menselijke corticale specimens voor IMS verkrijgen hersenen die werden verwijderd, verwerkt en opgeslagen bij-80 ° C binnen 8 uur postmortem. Het model van de hersenen van de occipital cortex van AD patiënten en leeftijd-matched controles21te nemen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van bevroren weefselsecties
	<ol>
<li>Snijd de weefselsecties op een cryostaat. Geleidende ITO beklede Microscoop glas dia's binnen de cryostaat21plaats.</li>
		<li>Warm de autopsie hersenen specimen van-80 ° C tot-22 ° C binnen de cryostaat.</li>
		<li>Een nieuw wegwerp mes hechten aan de cryostaat voor elk experiment. Probeer altijd een schoon deel van het blad te gebruiken.</li>
		<li>Zet de hersenen bevroren autopsie op het podium samen met een kleine hoeveelheid OCT compound (voldoende ter dekking van het centrale gedeelte van het werkgebied; Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Kies de voorwaarden voor dunne segmenteren. Voor IMS, een dikte van 10 – 12 μm voor menselijk brein secties te gebruiken. Voor IMS en IHC, gesneden vijf tot zes secties van elk monster van weefsel.</li>
		<li>Wanneer het mes net begonnen is aan het snijden van het weefsel, draai het wiel en "gezicht" het blok tot alle van het weefsel wordt blootgesteld. Als er een kleine streak of scheur in de sectie, wacht een beetje meer in de cryostaat, totdat de kleurtemperatuur automatisch probleem hiermee is opgelost. Een paar seconden alvorens de anti-roll te openen met een tissue onder tellen.</li>
		<li>Onmiddellijk plaats het weefsel segment op de ITO-coated kant van het glasplaatje. Ontdooi het weefsel segment door de invoering van een vinger onder het schuifje op de niet-ITO-coated kant. Het weefsel zal vasthouden aan de dia; Zorg ervoor dat het weefsel zo plat mogelijk met geen rimpels. Voer deze stap bij kamertemperatuur. Opmerking: Draag handschoenen, maskers en een laboratorium jurk omdat de menselijke specimens biologische contaminanten kunnen bevatten. Als alle secties zijn aangebracht voor de dag, reinig de cryostaat, borstels en chucks met laboratorium doekjes en 200 mL ethanol 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>Spoelen van de weefselsecties
	<ol>
<li>Onderdompelen van de monsters in de 40-100 mL 70% ethanol voor 30 s om endogene lipiden en anorganische zouten te verwijderen. Gebruik een glazen pot kleuring.</li>
		<li>Wassen van de monsters met 40-100 mL voor 100% ethanol voor 30 s, 40-100 mL Carnoy de oplossing voor 3 min, 40-100 mL voor 100% ethanol voor 30 s, 40-100 mL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) voor 1 min en 40-100 mL voor 100% ethanol voor 30 s. gebruik een glas kleuring pot. Opmerking: Carnoy de oplossing is een hechtmiddel bestaat uit zes delen ethanol, azijnzuur drie delen en enerzijds chloroform.</li>
		<li>Droog in een vacuüm voor 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Behandeling van de weefselsecties met een mierenzuur damp voor een betere ionisatie van de Aβ eiwitten uit autopsie hersenen weefsels
	<ol>
<li>De oven en incubatie glasplaatje moet worden gebruikt voor de latere verdamping met 5 mL mierenzuur van 100% voor te bereiden. Bereiken van een bevredigend zure behandeling, houd de luchtvochtigheid in de incubatie glazen schotel op verzadigingsniveau gedurende deze stap en houden van de temperatuur bij 60 ° C. Plaats het weefsel dia's in het incubatie-glas schotel terwijl het vermijden van onderdompeling in de mierenzuur en behandelen voor 6 min.</li>
		<li>Neem een optische beeld van de monsters met behulp van een film scanner, gel scanner of een digitale Microscoop, etc. waarnemen zulks trede bij kamertemperatuur. De uitlijning van het optische beeld van de monsters is noodzakelijk wanneer het doel van het monster in het instrument wordt geplaatst. Meestal zal het niet mogelijk zijn om te herkennen van de weefselsectie onder de laag van de matrix. Opmerking: De meest handige manier een optische opname te maken is het gebruik van een office-toepassingen. Het is een goed idee om de afbeelding opslaan in de beeldvorming map van de data-opslag.</li>
		<li>Maken om de correlatie tussen de optische beelden en de monsters, gids merken die zichtbaar zijn in het optische beeld zowel onder de laag van de matrix in de optiek van de camera. De gemakkelijkste manier is om ter plaatse ten minste drie correctie vloeistof merken rond het monster alvorens het optische beeld.</li>
	</ol></li>
	<li>Matrix toepassing
	<ol>
<li>
Bereiding van de oplossing van de matrix
		<ol>
<li>In een organisch oplosmiddel-tolerante microtube, bereid een 10 mg/mL SA oplossing in 50% acetonitril (ACN) en 0,1% TFA. Grondig ontbinden de SA samengestelde door vortexing of korte ultrasoonapparaat voor 10 min. opslag de oplossing op kamertemperatuur tot gebruik. Opmerking: Er zijn drie verschillende opties voor het spuiten van matrix: met een airbrush, een ultrasone sproeier of een automatische sproeier.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
De matrix spuiten met een airbrush
		<ol>
<li>Het uitvoeren van de bewerking op een constante kamertemperatuur (20-23 ° C) en luchtvochtigheid (40%-60%). De parameters aan te passen voor het spuiten van de optimale omvatten de grootte van de druppel, het bedrag van de mist, de hoek en afstand tussen de spuitmond en de weefselsectie, laboratorium temperatuur en de vochtigheid. Deze voorwaarden aanpassen door het controleren van de resultaten van de microscopie. Opmerking: Zoals beperkende factoren de grootte van het kristal en de homogeniteit van de dekking van de matrix en de ongewenste migratie/verspreiding van analyten zijn, kleinere is beter voor de daling van de grootte. Homogeniteit is ook het punt van de inspectie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
De matrijs te spuiten met een ultrasone sproeier
		<ol>
<li>Verwijder het weefsel te worden gespoten uit de exsiccator en plaats deze in de zaal. Zorg ervoor dat het weefsel is niet die betrekking hebben op het venster van de sensor.</li>
			<li>De voorbereiding start door het indrukken van de knop Start ; prep tijd is meestal ongeveer 90 min. De opstelling zal automatisch worden geregeld via de bewaking van de dikte van de laag van de matrix en nattigheid. Nadat de voorbereiding voltooid is, de dia verwijderen en sla het in de exsiccator gedurende 15 minuten voordat het wordt gelezen in de MALDI-instrument.</li>
			<li>Reinig de sproeier met 2-3 mL voor 100% MeOH totdat het hoofd spray verschijnt schoon. Opmerking: Een fijne nevel van matrix druppels is toegestaan te zinken in het weefsel door een gravitationele blad. Een gemiddelde druppel grootte van 20 μm wordt gegenereerd; alle diameters van de druppel zijn minder dan 50 μm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
De matrijs te spuiten met een automatische sproeier
		<ol>
<li>Spray de oplossing van de matrix op het oppervlak van het weefsel met een automatische sproeier. Een constante ﬂow van verwarmde schede gas (N2, vastgesteldop 10 psi en 75 ° C) zal gezamenlijk worden geleverd met de matrix oplossing spray. Een pompsysteem van de oplosmiddelen (vastgesteld op 10 psi en 0,15 mL/min) gebruiken om de matrix-oplossing te leveren. Opmerking: Bovenal werken onder een veiligheidskast om te voorkomen dat elke inademing van aërosolen van de matrix. De kamertemperatuur en luchtvochtigheid te reproduceren van homogene matrix kristallisatie bepalen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. MALDI-IMS
<ol><li>
Ultrasnelle massaspectrometrie uitvoeren
	<ol>
<li>High-throughput en hoge ruimtelijke resolutie beeldvormende experimenten uitvoeren met MALDI-IMS uitgerust met een 10 kHz ND: YAG (355 nm) laser.</li>
		<li>Voor metingen van de Spectrometrie van de massa, de gebieden van de weefsel met behulp van de software van de controle van de MALDI en de software van de analyse van de gegevens te definiëren.</li>
		<li>Verwerven van spectra in een positieve lineaire mode met een massa van het aantal m/z 2.000-20.000 en een ruimtelijke resolutie van 20 en 100 µm.</li>
		<li>Om de kalibratie standaard, Los de peptide ijkstandaard en de eiwit ijkstandaard met een verhouding van 1:4 met alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) in TA30-oplossing (ACN:0.1% TFA = 30:70) en vervolgens verdund het 10 x. Plaats 1 μL van kalibratie standaard op de dia op vier verschillende locaties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van moleculaire histologie software (Zie Tabel of Materials), overlay meerdere afzonderlijke afbeeldingen te vinden van de ruimtelijke correlatie van verschillende signalen, zoals verschillende Aβ peptiden colocalizing SPS-overeenkomst en arteriële muren.</li>
</ol>3. de verwerking van de gegevens
<ol><li>Uitlijnen spectrale uitlijning is ingesteld, alle spectra aan een geselecteerde m/z-lijst van een eerdere publicatie21.</li>
	<li>De MALDI-IMS-gegevensset importeren statistische analysesoftware (Zie Tabel van materialen) met aftrekken van de basislijn.</li>
	<li>
Regio's van belang (ROIs) op basis van histologische kennis te traceren.
	<ol>
<li>Een univariate analyses uit te voeren voor de gemiddelde intensiteit, standaardafwijking; blootleggen van discriminatoire m/z-markeringen (ROC analyse), hypothese testen, en ontdekking van colocalized m/z-waarden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Een segmentatie kaart maken.
	<ol>
<li>Een ongecontroleerde multivariate analyses uit te voeren voor de ruimtelijke segmentatie van grote datasets en een analyse van de component voor de extractie van de onderliggende tendensen.</li>
		<li>Selecteer anatomische ROIs gebaseerd op histologische kenmerken, zoals parenchym en de subarachnoïdale ruimte.</li>
		<li>Toewijzen van structuren als afzonderlijke ROIs en correleren van hen met de verwerkte gegevens van de MS teneinde de bijbehorende peptiden waardoor de segmentatie van de afbeelding van de regio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kovacs, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathological+Classification+of+Neurodegenerative+Diseases%3A+Turning+towards+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17, E189(2016).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+genes%2C+proteins%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy.</a> Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).</li>
<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).</li>
<li>Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+Alzheimer+disease-associated+neurofibrillary+pathology+using+paraffin+sections+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry.</a> Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).</li>
<li>Bateman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominantly+Inherited+Alzheimer+Network.+Clinical+and+biomarker+changes+in+dominantly+inherited+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).</li>
<li>Iwatsubo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+A+beta+42%2843%29+and+A+beta+40+in+senile+plaques+with+end-specific+A+beta+monoclonals%3A+evidence+that+an+initially+deposited+species+is+Abeta+42%2843%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43).</a> Neuron. 13, 45-53 (1994).</li>
<li>Reinert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+of+C-terminally+truncated+A%CE%B2+species+A%CE%B237+and+A%CE%B239+in+Alzheimer%27s+disease+and+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 24(2016).</li>
<li>Saido, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+and+differential+deposition+of+distinct+beta-amyloid+peptide+species%2C+A+beta+N3%28pE%29%2C+in+senile+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques.</a> Neuron. 14, 457-466 (1995).</li>
<li>Harigaya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+protein+starting+pyroglutamate+at+position+3+is+a+major+component+of+the+amyloid+deposits+in+the+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).</li>
<li>Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+amyloid+angiopathy.+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral amyloid angiopathy. A critical review.</a> Stroke. 18, 311-324 (1987).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+amyloidogenicity+and+pathogenicity+of+A%CE%B243%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43.</a> Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer%27s+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tissue+content+of+soluble+beta+1-40+is+linked+to+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy.</a> The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).</li>
<li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+newly+deposited+tau+in+neurofibrillary+tangles+and+neuropil+threads%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+%26+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads.</a> Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).</li>
<li>Portelius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+brain+amyloid+beta+isoform+signatures+in+familial+and+sporadic+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).</li>
<li>Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+In-Source+Decay+Applied+to+the+Determination+of+Amyloid-Beta+in+Alzheimer%27s+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains.</a> ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).</li>
<li>Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+amyloid+beta+peptides+in+mouse+brain+sections+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).</li>
<li>Stoeckli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+MS+imaging+of+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">MALDI MS imaging of amyloid.</a> Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).</li>
<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+deposition+of+amyloid-%CE%B2+species+in+brains+with+Alzheimer%E2%80%99s+disease+pathology+visualized+with+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 73(2017).</li>
<li>Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+of+the+brain+and+the+pathophysiology+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease.</a> Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).</li>
<li>Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+changes+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer%27s+disease+and+their+potential+impact+on+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy.</a> Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).</li>
<li>Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+drainage+of+amyloid-beta+peptides+from+the+brain+and+its+failure+in+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).</li>
<li>Morris, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+basement+membranes+as+pathways+for+the+passage+of+fluid+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain.</a> Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).</li>
<li>Hawkes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+drainage+of+solutes+is+impaired+in+the+ageing+mouse+brain+and+in+the+presence+of+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy.</a> Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).</li>
<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).</li>
<li>Matsumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Secretase+associated+with+lipid+rafts%3A+multiple+interactive+pathways+in+the+stepwise+processing+of+%CE%B2-carboxyl-terminal+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).</li>
<li>Morishima-Kawashima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+apolipoprotein+E+allele+epsilon4+on+the+initial+phase+of+amyloid+beta-protein+accumulation+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain.</a> The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).</li>
<li>Takami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Secretase%3A+Successive+tripeptide+and+tetrapeptide+release+from+the+transmembrane+domain+of+%CE%B2-carboxyl+terminal+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).</li>
<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+%CE%B3-secretase+activity+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).</li>
<li>Carlred, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+amyloid-b+pathology+in+transgenic+Alzheimer%E2%80%99s+disease+%28tgArcSwe%29+mice+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wij een gedetailleerd protocol en de resultaten van de visualisatie van Aβ en haar isoforms blijkt uit verschillende autopsied hersenen met AD en CAA met MALDI-IMS. Het profiel van de afzetting van Aβs werd het drastisch veranderd van Aβ1-42 naar de N - en C-terminaal variaties. Aβ1-41 werd voor het eerst geïdentificeerd en gevisualiseerd in menselijke hersenen met het huidige protocol en verder werd gevalideerd met IHC21. Gezien het feit dat de morfologie van gedeponeerde Aβ door IMS met een hoge resolutie analyse (20 μm) moet in goede overeenkomst met IHC, IMS en IHC even dragen bij aan onderscheidende Aβ deposito's door hun locatie en eiwitgehalten, alsmede door hun morfologie. Als het hele experiment hier beschreven werd uitgevoerd in de occipital cortex, zal het bestuderen van de lokalisatie van de verschillende soorten van amyloid-bèta in alle regio's van de hersenen worden veralgemeend met toekomstige experimenten met behulp van het huidige protocol.
Kritische stappen binnen het protocol zijn weefsel voorbereiding stappen voor het verkrijgen van een effectieve behandeling door ionisering van geaggregeerde eiwitten in het menselijk brein weefsels. Een matrix-laag moet de energie van de laser absorberen en veroorzaken desorptie en ionisatie van analyten. In dit proces, is een hele weefselsectie homogeen bedekt met kleine kristallen. Homogene cocrystallization van de analyt met de matrix is cruciaal voor hoge gevoeligheid en artefact-vrije imaging. Elk van de drie spray methoden heeft zijn eigen voordelen. Handmatige spray coating is een van de meest gebruikte methoden. Een airbrush is handig; Nochtans, vereist het bekwame bediening. Nauwkeurige en reproduceerbare experimentele techniek is essentieel, wordt met een ultrasone sproeier en/of een automatische sproeier zoals beschreven in de huidige protocollen aanbevolen. Met betrekking tot een ultrasone sproeier, zal het niet worden beïnvloed door de vochtigheid en de temperatuur van de kamer omdat het is gespoten in een kamer. Ondertussen, met een automatische sproeier, relatief bewaarde ruimtelijke resolutie met goede reproduceerbaarheid wordt verkregen. In het algemeen, de ruimtelijke resolutie verkregen met de verhoging van de drie methoden in de volgorde 1) airbrush, 2) automatisch apparaat, en 3) ultrasone sproeier.
Dit protocol was bovenal oorspronkelijk zijn gegenereerd voor het opsporen en visualiseren van Aβs in autopsie hersenen monsters. De visualisatie van Aβs met MALDI-IMS voor APP23 muizen, die wordt gegenereerd als een dierlijk model van AD op basis van de Zweeds-type mutatie van menselijke APP, heeft eerder door anderen is gerapporteerd met een bestaande methode18,19. Het voormalige protocol toegepast op APP23 was echter niet voldoende om te visualiseren Aβ in zijn laterale resolutie en gevoeligheid. Eerdere werken besproken dat hoge Aβ concentraties buiten de grens van het weefsel zijn duidelijk artefacten in APP23 imaging met hun protocol18,19. Dat betekent dat de zogenaamde 'vervagen' tussen echte SPs en IMS beelden als gevolg van de matrix extractie stap was onvermijdelijk met MALDI-achtige beeldvorming. Echter, in het huidige protocol, de vervaging verdwenen en elke spectrum vertegenwoordigd elke één SP in de hersenen parenchym.
Zoals u hier ziet, wij voor de eerste keer in AD Aβ1-41 kunt traceren en CAA hersenen met MALDI-IMS, alsook met IHC, met een specifiek antilichaam door onze eigen generatie21. Volgens de Aβ verwerkingsmodel, Aβ1-38 is afgeleid van Aβ1-45 via Aβ1-42, terwijl Aβ1-41 is afgeleid van Aβ1-45 door γ-secretase stapsgewijze decollete27,28,29,30,31 . Dit betekent dat het huidige protocol dit model ondersteunt. Wat betreft de beperkingen van deze techniek, moeten we de heterogeniteit van de monsters van de autopsie van de menselijke hersenen. De meest kritische stap, in zekere zin is te beoordelen van gekwalificeerde autopsie hersenweefsel met ethische bewijs. Met het huidige protocol betreffende deze gekwalificeerde autopsie hersenen weefsels, kunt MALDI-IMS afzonderlijk bijhouden de hele distributie van de complexe moleculen hebben meerdere wijzigingen, evenals onbekende factor(en) regulering van de pathogenese van AD, die nog moeten worden gedefinieerd. Bovendien inzicht in de algehele pathogenese van verschillende Neuropathologie in leeftijd menselijke hersenen, moet het haalbaar te nemen MALDI-IMS als een standaard aanpak, in combinatie met de klinische genetische en pathologische opmerkingen in neurologische aandoeningen .
Een andere belangrijke stap van MALDI-IMS is het proces van de mijnbouw gegevens uit de verkregen data set, is altijd tijdrovend. Handmatige datamining van elke piek-distributie vereist de gebruikers doorklikken naar elke afbeelding en kijk voor distributies die aan de morfologie van het geanalyseerde monster correleren kunnen. Automatische ruimtelijke segmentatie kan worden gebruikt als de eerste stap voor data mining, een overzicht van de gegevensset te verstrekken en waardoor de snelle detectie van opvallende kenmerken. In deze benadering gelijkenissen tussen spectra van een bepaald gebied zijn statistisch bepaald en gelijkaardige spectra zijn gegroepeerd in één cluster. Alle pixels zijn kleurgecodeerde volgens hun cluster toewijzing (Figuur 5). In de huidige AD/CAA studie is het gebied van belang de ruimte van Aβ afzettingen in de parenchymal plaque en de subarachnoïdale en parenchymal vasculaire structuren. De twee opvallende pieken die werden verder gevalideerd met IHC waren de m/z-waarden uit de Aβ1-40 en Aβ1-4221. Het is dus gemakkelijk te vinden colocalized m/z met Aβ1-40 en Aβ1-42, die al geannoteerde aan de N - en C-terminaal afgeknotte Aβ, evenals onbekende peptides, voor verdere analyse was.
Weller en collega's hebben gemeld dat Aβ in wanden, meer rond slagaders accumuleert dan rond veins21. Bovendien, er is voorgesteld dat de interstitiële vloeistof (ISF) van de cerebrale parenchym uitgescheiden naar de lymfeklier via een gerelateerde drainage traject22,23,24,25 Aβs bevat ,26. Het huidige protocol voor het genereren van een kaart van de segmentatie op basis van een MALDI-IMS-gegevensverzameling met een 20 µm resolutie ondersteunt het mogelijke bestaan van gerelateerde drainage trajecten van de hersenen (Figuur 5), die aanzienlijk tot de CAA in AD21 bijdragen , 32. Voorts wij marker eiwitten colocalized met plaque en subarachnoïdale therapieën door de berekening van de correlatie van elke m/z-waarden kunt ontdekken. Inzicht in de algehele pathogenese van verschillende Neuropathologie in leeftijd menselijke hersenen, moet het haalbaar te nemen MALDI-IMS als een krachtige aanpak in combinatie met gevestigde IHC gegevens van klinische, genetische, en pathologische observaties in neurologische ziekten.

Om de diagnose te kunnen en te krijgen in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen, is exacte moleculaire identificatie van pathologische deposito's essentieel1. In de loop van AD, Aβ is geproduceerd zodat SPs in de cerebrale parenchym en gedeponeerd in schepen lang voordat de ziekte begin2,3,4,5,6. Terwijl Aβ1-42 de overheersende peptide in de SP van AD hersenen is, andere Aβ varianten, zoals N-terminal of C-terminal afgekapt of Aβs bewerkt, worden ook geïdentificeerd in getroffen AD hersenen7,8,9, 10. Een volledig beeld van de brede waaier van Aβ soorten in de menselijke hersenen, met name met AD en Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA)11, zal helpen wetenschappers begrijpen Aβ productie, metabolisme en depositie.
Als de klassieke benadering van Neuropathologie, is immunohistochemistry (IHC) geweest de meest overtuigende methode om te bepalen van de locatie van Aβs in de hersenen weefsels12,13,14,15. In het algemeen, IHC kan geen onderscheid maken tussen moleculen als verschillende epitopen gelijktijdig naast elkaar bestaan. Daarentegen is een opkomende massa spectrometrie gebaseerde Proteoom-analyse een waardevolle benadering vooral voor het analyseren van een aantal Aβ soorten in de weefsels van de hersenen, die niet kunnen worden gedifferentieerd met antilichamen16,17. De conventionele massa spectrometrie gebaseerde analyse van hersenen lysates en immuno-neergeslagen monsters herkent kleine Aβ peptiden en verliest van informatie van de distributie van Aβ in het hersenweefsel.
In eerdere werken, is visualiseren Aβ deposito's in muis hersenen succesvol geweest met behulp van een transgene diermodel van AD, zoals APP23. Dit proces moet echter nog steeds technische vooruitgang IMS en IHC vergelijken met betrekking tot de resolutie en gevoeligheid18,19,20. AD Neuropathologie moet worden onderzocht op menselijke hersenen, en we gewend MALDI-IMS technologie op menselijke autopsie hersenen weefsels uitgebreide eiwit toewijzing21te verkrijgen. Voor dit doel ontwikkelden we een protocol voor een geavanceerde soort massaspectrometrie dat voordelen in snelheid, gevoeligheid, en reproduceerbaarheid heeft.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Indium tin oxide (ITO)-gecoate microscoopglasplaat</td><td>Bruker Daltonics</td><td>#237001</td><td></td></tr><tr><td>Mes (wegwerp)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland</td><td>#117394</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland</td><td>FSC 22 Blue</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>EPSON</td><td>GT-980</td><td></td></tr><tr><td>Luchtspuit</td><td>GSI Creos</td><td>PS274</td><td></td></tr><tr><td>Compressor</td><td>MRHOBBY</td><td>Mr.Linear compressor L5</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon verneveler</td><td>Bruker Daltonics</td><td>ImagePrep</td><td></td></tr><tr><td>Automatische verneveler</td><td>HTX Technologies</td><td>TM Sprayer</td><td></td></tr><tr><td>Confocal-laser-scanning-microscoop</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Ultra hoge snelheid MALDI instrument</td><td>Bruker Daltonics</td><td>rapifleX MALDI Tissuetyper</td><td></td></tr><tr><td>MALDI control software</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexControl 3.8</td><td></td></tr><tr><td>Data analyse software</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexImaging 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Moleculair histologie software</td><td>SCiLS, Bremen, Duitsland</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Statistisch software</td><td>SCiLS, Bremen, Duitsland</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Sinapinic zuur (SA)</td><td>Nacalai tesque</td><td>30494-91</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnaminezuur (CHCA)</td><td>Wako</td><td>037-19261</td><td></td></tr><tr><td>Calibratiestandaard</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerde anti-muis IgG antilichamen</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerde anti-konijn IgG antilichamen</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidine en biotinyleerde HRP complex.</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidine (DAB)</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Het neuropathologie de ziekte van Alzheimer (AD) wordt gekenmerkt door de accumulatie en de aggregatie van amyloïde β (Aβ) peptiden in extracellulaire plaques van de hersenen. De Aβ peptiden, samengesteld uit 40 aminozuren, worden gegenereerd uit amyloïde precursor-eiwit (APP) door de β - en γ-secretases. Aβ wordt gestort, niet alleen in cerebrale parenchym, maar ook in leptomeningeale en cerebrale wanden, bekend als Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA). Terwijl een aantal Aβ peptiden werden geïdentificeerd, de gedetailleerde productie en distributie van individuele Aβ peptiden in pathologische weefsels van AD en CAA niet volledig zijn opgelost. Hier ontwikkelen wij een protocol van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie gebaseerde imaging massaspectrometrie (MALDI-IMS) op menselijke autopsie hersenen weefsels te verkrijgen van uitgebreide eiwit toewijzing. Voor dit doel, werden menselijke corticale specimens verkregen van de Bank van de hersenen bij de Tokyo Metropolitan Instituut voor gerontologie. Bevroren cryosecties zijn gesneden en overgedragen aan indium-tin-oxide (ITO)-gecoat glas dia's. Spectra worden verkregen met behulp van de MALDI-systeem met een ruimtelijke resolutie tot 20 µm. Sinapinic zuur (SA) is gelijkmatig afgezet op de dia met behulp van een automatische of een handmatige sproeier. Met de huidige technische voordelen van MALDI-IMS, kan een typische gegevensset soorten verschillende Aβ binnen dezelfde baanvakken van menselijke autopsie hersenen worden verkregen zonder specifieke sondes. Bovendien, met een hoge resolutie (20 µm) beeldvorming van een AD-hersenen en ernstige CAA voorbeeld toont duidelijk aan dat Aβ1-36 tot en met Aβ1-41 werden gestort van leptomeningeale schepen, terwijl Aβ1-42 en Aβ1-43 werden afgezet in cerebrale parenchym als seniele plaque (SP). Het is haalbaar te nemen MALDI-IMS als een standaardaanpak in combinatie met de klinische genetische en pathologische opmerkingen in het begrip van de pathologie van AD, CAA, en andere neurologische aandoeningen gebaseerd op de huidige strategie.

Sporadisch AD patiënten met CAA (n = 5; gemiddelde leeftijd = 83,2 y) en de leeftijd van onderwerpen met seniele plaque vrij (SP-O) en CAA (n = 5; gemiddelde leeftijd = 77.2 y) werden geanalyseerd (tabel 1). De CAA fenotypes van patiënt #3 werden meest prominente in deze studie. Distributies van Aβ1-40 en Aβ1-42 stortingen in het hersenweefsel van patiënt #3 waren gevisualiseerd met MALDI-IMS (Figuur 1). Er waren geen belangrijke signalen in nonpathological controle hersenen (patiënten #9 en #10), zoals afgebeeld in Figuur 1. Hier, gevisualiseerd MALDI-IMS duidelijk dat Aβ1-42 is, bij voorkeur in de cerebrale parenchym als SPs worden neergelegd. Kortere Aβs, zoals Aβ1-36 tot en met 1-41, werden daarentegen bij voorkeur afgezet op de leptomeningeale vasculaire gebieden (Figuur 1).
Distributies van Aβ40 en Aβ42 werden verder gevalideerd met IHC met aangrenzende bevroren secties van de weefsels. Het anti-Aβ40-antilichaam label CAA (pijlen in figuur 2B), die in duidelijk contrast met de verdeling van de Aβ42 in de cerebrale parenchym SPs. Voor Aβ1-41, hebben wij zijn de eerste die dit fragment detecteren in menselijke hersenen, en we specifieke antilichamen die Aβ41 van Aβ40 andAβ4221kunnen onderscheiden.
De ruimtelijke resolutie van de MALDI-IMS is over het algemeen de belangrijkste factor te worden verbeterd. In Figuur 1 en Figuur 2 MALDI-IMS Toon met een 100 µm toonhoogte resolutie en verkrijgen van een algehele profiel van de distributie voor een relatief groot gebied21. Het is moeilijk te definiëren amyloïde afzetting precies op de subarachnoïdale ruimte, met inbegrip van vasculaire structuur. Een beeld te schetsen van fijn weefsel structuren van subarachnoïdale vaartuigen en het oppervlak van de cortex, high-resolution MALDI imaging (40 µm: Figuur 3; 20 µm: Figuur 4 en Figuur 5) werd uitgevoerd. Dientengevolge, MALDI-IMS duidelijk aangetoond dat kortere Aβs, zoals Aβ1-36 tot en met 1-41, zich in de wanden van de slagaders bevinden, die vergelijkbaar zijn met IHC is.
MALDI-IMS aangetoond de gedetailleerde distributies van zowel Aβx-40 en Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 11pE) in AD begeleid met gematigde CAA hersenen. Bijvoorbeeld, terwijl Aβx-40 soorten een soortgelijke distribution-profiel aan Aβ1-40 toonde, Aβx-42 soorten toonde een patroon van verschillende distributielijsten met Aβ1-4221. Door het huidige protocol, worden enkele ion beelden van de individuele Aβ peptiden waargenomen met MALDI-IMS toegewezen aan Aβ soorten. Daarentegen, verworven beeld gegevens kunnen worden onderzocht met behulp van ongecontroleerde meerdimensionale statistiek om te bekomen van beeldsegmentatie van anatomische regio's van belang voor de verdere analyse van ongedefinieerde eiwitten. Figuur 5 toont een kaart van segmentatie met een overschrijdt k-means analyse toegepast op dezelfde sectie van patiënt #321 verkregen. Deze clustering methode succesvol geïdentificeerd plaque-achtige structuren in de parenchym (blauw in de figuur 5C) en vasculaire structuren in de subarachnoïdale ruimte (groen in figuur 5C). Het is interessant om te vinden van een kleine cirkelvormige zone in de parenchym, dat wordt vastgesteld slechts rond een kleine arteriole in het parenchym, evenals in de subarachnoïdale ruimte (paars in figuur 5C). Dit wordt gecontroleerd door enkele ion beelden van deze individuele Aβ peptiden in figuur 5D-5F.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig1.jpg"> Figuur 1: MALDI-IMS van een bevroren AD/CAA brain sectie. Verschillende C-terminal afgekapt Aβ peptiden in AD begeleidende ernstige CAA (patiënt #3) worden gevisualiseerd in de linker paneel en besturingselementen (patiënt #9 aan de rechterkant en de patiënt #10 op de links in alle afbeeldingen) in het rechter paneel. Aβ1-36 tot en met Aβ1-41 worden bij voorkeur afgezet in leptomeningeale bloedvaten, terwijl Aβ1-42 en 43-Aβ1 zijn gestort in de cerebrale parenchym als seniele plaques in geval #3, terwijl er geen signaal in de controle patiënten was brains (gevallen #9 en #10). Resolutie = 100 μm. Schaal bar = 5 mm. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Kakuda et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig2.jpg"> Figuur 2: MALDI-IMS van bevroren AD/CAA brain secties en aangrenzende secties van de occipital cortex vanuit AD brains. (A - C) de bevroren AD/CAA hersenen secties en (D en E) aangrenzende secties van de occipital cortex van AD hersenen waren immuun-gekleurd en gericht op arteriole en cerebrale parenchym, met behulp van antilichamen tegen Aβ40 (D: BA27) of Aβ42 (E: anti-Aβ42 polyklonale). Beide analyses aangetoond dat Aβ40 bij voorkeur wordt gestort in leptomeningeale bloedvaten (pijlen in deelvenster D) en de arteriolen in de subarachnoïdale ruimte en de cerebrale parenchym CAA vormen. Daarentegen wordt voornamelijk Aβ42 gestort in SPs. Voor IMS, resolutie = 100 μm. Schaal bar = 5 mm (A, Ben C) = 5 mm, 500 (D en E). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Kakuda et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig3.jpg"> Figuur 3: MALD-IMS van bevroren AD/CAA brain secties (patiënt #3) met een resolutie van 40 µm. Verschillende C-terminal en N-terminal afgekapt en bewerkt Aβ peptiden in AD begeleidende ernstige CAA (patiënt #3). Aβ1-36 tot en met Aβ1-41 worden bij voorkeur afgezet in leptomeningeale bloedvaten, terwijl Aβ1-42 en Aβ1-43 worden afgezet in de cerebrale parenchym als seniele plaques. Schaal bars = 1 mm (A-B), 2 mm (linksboven). Resolutie = 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig4.jpg"> Figuur 4: MALDI-IMS van bevroren AD/CAA brain secties (patiënt #3) met een resolutie van 20 µm. Dit paneel toont verschillende C-terminal en N-terminal afgekapt en bewerkt Aβ peptiden in AD begeleidende ernstige CAA (patiënt #3). Aβ1-36 tot en met Aβ1-41 worden bij voorkeur afgezet in leptomeningeale bloedvaten, terwijl Aβ1-42 en Aβ1-43 worden afgezet in de cerebrale parenchym als seniele plaques. Schaal bars = 200 μm (a, b, c), 1 mm (linksboven). Resolutie = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig5.jpg"> Figuur 5: kaart van de segmentatie, verkregen door MALDI-IMS van een bevroren AD hersenen sectie, onthult putatief seniele plaque, groot subarachnoïdale schip structuren en kleine parenchymal arteriolen. (A) segmentatie kaart verkregen uit een multivariate beeldanalyse van MALDI-IMS-gegevens. (B) Bisecting k-means gebaseerde clustering analyse geïdentificeerd plaque-achtige en vaartuig-achtige structuren in de occipital cortex. De clusters en substructuren en hun relaties worden weergegeven als de knooppunten (e.g.,1-0-0). (C) verschillende Aβ peptide lokalisatie patronen plaques (blauw), die lijkt op subarachnoïdale sloopschepen (groen), en arteriole (rood). Merk op dat een paar rode clusters ook zich in de subarachnoïdale ruimte bevinden. Dit wordt gecontroleerd door enkele ion beelden van deze individuele Aβ peptiden met een 20 µm resolutie: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41, en (F) Aβ 1-42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Geval</td>
			<td>Geslacht</td>
			<td>Leeftijd bij overlijden</td>
			<td>Braak SP</td>
			<td>CAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>M</td>
			<td>88</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>C</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>M</td>
			<td>70</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>M</td>
			<td>73</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: klinische en pathologische gegevens van AD met CAA gevallen en leeftijd SP O onderwerpen. Menselijke corticale specimens voor IMS en IHC werden verkregen van de Bank van de hersenen bij Tokyo Metropolitan Instituut voor gerontologie. Elk specimen van de hersenen is ontleend aan de occipital cortex van vijf AD patiënten en vijf leeftijd-matched controles. De omvang van amyloïde afzetting als blijkt uit een Aβ monoklonaal antilichaam werd gedefinieerd door Braak SP (amyloid) fasen. Stadium O zijn er bijna geen seniele plaques in de isocortex. Stadium C ondervinden problemen vrijwel alle gebieden van de isocortical. AD hersenen zijn onveranderlijk stadium C. Deze tabel is gewijzigd met toestemming van Kakuda et al.21.

Moleculaire beeldvorming met laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie gebaseerde imaging massaspectrometrie (MALDI-IMS) kan de gelijktijdige koppeling van meerdere analyten in biologische monsters. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en de visualisatie van amyloïde β eiwit op weefsels van de hersenen van Alzheimer en Cerebrale amyloïde angiopathie monsters met behulp van MALDI-IMS.

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

De belangrijkste bijdrage van ons papier is dat we een nauwkeurig en fijn landschap van amyloïde bètapathologie van de alzheimerhersenen hebben onderzocht met de beeldvormingstechnologie van de MALDI-beeldvormingsmassaspectrometrie. We bereikten technologische vooruitgang door het genereren van een speciaal protocol met mierenzuur voorbehandeling van de weefselglijbanen. Na MALDI-IMS worden segmentatiekaarten gegenereerd en worden berekeningen uitgevoerd om nieuwe markereiwitten of peptiden te ontdekken die zijn gekoomiseerd met plaque en subarachnoïdale vasculatuur.Verkrijg menselijke corticale specimens voor IMS uit hersenen die werden verwijderd, verwerkt en opgeslagen bij min 80 graden Celsius binnen acht uur na de dood. Neem het hersenexemplaar uit de occipitale cortex van AD-patiënten en leeftijdsgedefgede controles. Om de weefselsecties op een cryostat te snijden, eerste plaats geleidende indium tinoxide of ITO-gecoate microscoopglasdia's in de cryostat.Verwarm de autopsie hersenen specimen van min 80 graden Celsius tot min 22 graden Celsius in de cryostat. Bevestig een nieuw wegwerpblad aan de cryostat voor elk experiment. Probeer altijd een schoon deel van het mes te gebruiken.Zet de bevroren autopsie hersenen op het podium, samen met een kleine hoeveelheid optimale snijtemperatuur verbinding. Voor IMS en immunohistochemie, snijd vijf tot zes secties van elk weefselmonster. Wanneer het mes net begint te snijden het weefsel, draai het wiel en het gezicht van het blok totdat alle weefsel is blootgesteld.Als er een kleine streep of scheur over de sectie, wacht in de cryostat totdat de temperatuur aanpassing automatisch lost. Tel een paar seconden voor het openen van de anti-roll met een weefsel eronder. Plaats het weefselsegment onmiddellijk op de ITO-gecoate kant van de glazen schuif.Ontdooi het weefselsegment door een vinger onder de glijbaan op de niet-ITO-gecoate kant te leggen. Het weefsel blijft aan de glijbaan kleven. Zorg ervoor dat het weefsel zo plat mogelijk is zonder rimpels.Om de weefselsecties te spoelen, dompel de monsters onder in 40 tot 100 milliliter ethanol van 70%ethanol in een glazen kleurpot gedurende 30 seconden om endogene lipiden en anorganische zouten te verwijderen. Was de monsters met behulp van de wasvolgorde in het tekstprotocol. Droog vervolgens de monsters 30 minuten in een vacuüm.Behandel nu de weefselsecties met een mierenzuurdamp voor een betere ionisatie van de amyloïde bèta-eiwitten uit autopsie hersenweefsel. Om dit te doen, bereid de oven op 60 graden Celsius en een incubatieglas schotel met vijf milliliter van 100% mierenzuur. Houd de luchtvochtigheid in de incubatieglazen schotel op verzadigingsniveau.Plaats de weefselglijbanen in de incubatieglazen schotel terwijl onderdompeling in het mierenzuur vermijdt en gedurende zes minuten te behandelen. Neem een optisch beeld van de monsters met behulp van een filmscanner, gelscanner of een digitale microscoop. Voer deze stap uit op kamertemperatuur.De uitlijning van het optische beeld van de monsters is noodzakelijk wanneer het monsterdoel in het instrument wordt geplaatst. Meestal is het niet mogelijk om de weefselsectie onder de matrixlaag te herkennen. Om de optische beelden te correleren met de monsters, maak u geleidemarkeringen die zowel in het optische beeld als onder de matrixlaag in de cameraoptiek zichtbaar zijn.De eenvoudigste manier is om ten minste drie correctie vloeistofmarkeringen ter plaatse rond het monster voor het nemen van de optische afbeelding. Om de matrix te spuiten met een ultrasone sproeier, verwijder het weefsel te worden gespoten uit de desiccator en plaats het in de kamer. Zorg ervoor dat het weefsel het sensorvenster niet bedekt.Start de voorbereiding door op de startknop te drukken. Meestal is de voorbereidingstijd ongeveer 90 minuten. De voorbereiding wordt automatisch geregeld via de monitoring van de dikte en nattigheid van de matrixlaag.Als alternatief, om de matrixoplossing op het weefseloppervlak te spuiten met een automatische sproeier, gebruik dan een oplosmiddelpompsysteem dat is ingesteld op 10 psi en 0,15 milliliter per minuut om de matrixoplossing te leveren. Een constante stroom van verwarmd schedegas zal gezamenlijk worden geleverd met de matrix oplossing spray. Voer beeldexperimenten met hoge doorvoer en hoge ruimtelijke resolutie uit met MALDI-IMS.Voor massaspectrometriemeting, definieer de weefselgebieden met behulp van de MALDI-besturingssoftware en data-analysesoftware. Verkrijg spectra in een positieve lineaire modus met een massa-laadverhouding van 2,000 tot 20.000 en een ruimtelijke resolutie van 20 en 100 micron. Om de kalibratiestandaard te maken, los u de peptidekalibratiestandaard en de eiwitkalibratienorm op in een één-vier-verhouding met CHCA- en TA30-oplossing en verdun deze vervolgens 10 keer.Plaats één microliter kalibratiestandaard op de dia op vier verschillende locaties. Met behulp van moleculaire histologie software, overlay meerdere signaalbeelden om de ruimtelijke correlatie van verschillende signalen te vinden, zoals verschillende amyloïde beta peptiden colocalizing in seniele plaques en arteriële wanden. De cerebrale amyloïde angiopathie of CAA fenotypes van patiënt nummer drie waren het meest prominent aanwezig in deze studie.MALDI-IMS van het hersenweefsel van deze patiënt duidelijk gevisualiseerd dat amyloïde beta 1-42 en amyloïde beta 1-43 werden bij voorkeur afgezet als seniele plaques in de cerebrale parenchyma. Daarentegen werden kortere amyloïde beta's zoals amyloïde bèta 1-36 tot 1-41 bij voorkeur afgezet op de leptomeningeal vasculaire gebieden. Er waren geen significante signalen in de niet-pathologische controle.Distributies van amyloïde bèta 1-40 en amyloïde bèta 1-42 werden verder gevalideerd met immunohistochemie met behulp van aangrenzende bevroren delen van de weefsels. De anti-amyloïde beta 1-40 antilichaam gelabeld CAA en bleek amyloïde beta 1-40 is bij voorkeur afgezet in leptomeningeal bloedvaten, wat duidelijk contrast is met de verdeling van amyloïde beta 1-42 in de cerebrale parenchyma als seniele plaques. Hier wordt een segmentatiekaart weergegeven die is verkregen met een bisecting k-means analyse toegepast op dezelfde sectie van patiënt nummer drie.Deze clustering methode met succes geïdentificeerd plaque-achtige structuren in de parenchyma en vasculaire structuren in de subarachnoïdale ruimte. Het is interessant om een klein cirkelvormig gebied te vinden in het parenchyma dat wordt gedetecteerd net rond een kleine arteriole in de parenchyma en in de subarachnoïdale ruimte. Dit wordt geverifieerd door enkele ionenbeelden van deze individuele amyloïde bètapetiden.Er is een limiet om een breed scala aan amyloïde beta's tegelijkertijd te traceren, zelfs als u de specifieke antilichamen gebruikt. Hier tonen we de verdeling van amyloïde bèta in menselijke hersenen met behulp van de geavanceerde MALDI imaging massaspectrometrie methode. Wij geloven dat deze bijdrage maakt doorbraak in de ziekte van Alzheimer onderzoek, omdat dit rapport biedt de karakterisering van de volledige set van amyloïde beta-eiwitten in de menselijke autopsie hersenen.De meest indrukwekkende bevinding is dat slechts een enkele aminozuur wijziging op de C-terminal van amyloïde beta-eiwit maakt een drastische verandering in hun distributie. De weefselvoorbereidingsstappen zijn van cruciaal belang om een effectieve ionisatie van geaggregeerde eiwitten in menselijk hersenweefsel te verkrijgen. Homogene cocrystallisatie van de analyt met matrixen cruciaal voor hoge gevoeligheid en artefact-vrije beeldvorming.

visualization-amyloid-deposits-human-brain-with-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

BioImaging methoden die worden gebruikt om cellen biodistributie van nanodeeltjes te beoordelen zijn van toepassing voor therapeutische en diagnostische controle van nanoformulated verbindingen. De werkwijzen die hierin beschreven zijn gevoelig en specifiek wanneer beoordeeld door histologische coregistration. De methodieken voor een translationeel weg van knaagdier voor de menselijke toepassingen.

Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

Dopamine vervanging farmacotherapie met L-dopa is de meest gebruikte symptomatische behandeling van Parkinson, maar gaat gepaard met bijwerkingen zoals onwillekeurige abnormale bewegingen, genoemd...

MALDI massaspectrometrie Imaging van neuropeptiden bij de ziekte van Parkinson

The video demonstrates a procedure for preparing human cortical brain slices from Alzheimer's disease patients for analyzing the deposition of amyloid-beta (Aβ) peptides using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry (MALDI-IMS). The steps include preparing the slides, treating the tissue to enhance ionization, and analyzing the spatial distribution of amyloid-beta peptides.

Visualization of Amyloid-Beta Peptides in Human Cortical Brain Slices

Source: Bisht, K., et. al. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J. Vis. Exp. (2016) This video demonstrates the visualization and mapping of Methoxy-X04-labeled amyloid plaques in Alzheimer’s disease mouse brain sections using fluorescence and bright-field microscopy, enabling precise correlation of plaques with anatomical structures for studying Alzheimer’s pathology.

Visualization and Mapping of Methoxy-X04-Labeled Amyloid Plaques in an Alzheimer’s Disease Mouse Brain Section

Dit manuscript beschrijft een procedure om de herinrichting van de cerebrovasculature volgen tijdens amyloïde plaque accumulatie in vivo met behulp van longitudinale twee-foton microscopie. Een uitgedunde schedel bereiden voor de visualisatie van fluorescente kleurstoffen om de progressie van cerebrovasculaire schade te beoordelen in een muizenmodel van de ziekte van Alzheimer.

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Een protocol voor de sublimatie van de DAN-matrix op rattenhersenweefsel voor de detectie van gangliosiden met behulp van MALDI Imaging Mass Spectrometry wordt gepresenteerd.

Sublimatie van DAN Matrix voor de detectie en Visualisatie van gangliosiden in Rat Brain Tissue voor MALDI Imaging Mass Spectrometry

Amyloïde afzetting is een kenmerk van verschillende ziekten en treft vele verschillende organen. Deze paper beschrijft de toepassing van de fluorescentie van de verlichte geconjugeerd oligothiophene in combinatie met fluorescentie microscopie technieken kleuring. Deze kleuringstechniek vertegenwoordigt een krachtige tool voor de detectie en verkenning van eiwit-aggregaten in zowel klinische en wetenschappelijke opstellingen.

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Dit protocol beschrijft een methode om individuele hersenverouderingstrajecten te volgen via een hersendonatieprogramma en de juiste karakterisering van hersenen. Hersendonoren zijn betrokken bij een langdurige longitudinale studie met inbegrip van seriële multi-dimensionale beoordelingen. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de verwerking van de hersenen en een nauwkeurige diagnostische methodologie.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

Er is een geavanceerde methode ontwikkeld voor massaspectrometriebeeldvorming (MSI) van hersenorganoïden die het mogelijk maakt om metabolietverdelingen binnen deze modellen in kaart te brengen. Deze technologie biedt inzicht in metabole routes van de hersenen en metabolietsignaturen tijdens de vroege ontwikkeling en bij ziekte, en belooft een beter begrip van de menselijke hersenfunctie.

Moleculaire beeldvorming van organoïden van het menselijk brein met behulp van massaspectrometrie 

Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.

Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen om rigoureuze en reproduceerbare metingen van zowel glycogeen- als N-gekoppelde glycanen mogelijk te maken met behulp van massaspectrometriebeeldvorming.

Ruimtelijke moleculaire beeldvorming van het glyaom met behulp van massaspectrometrie

Leer amyloïde β-deposito's visualiseren in menselijke hersenen met MALDI-IMS voor Alzheimeronderzoek. Deze methode onthult de ruimtelijke verdeling van amyloïde peptiden in hersenweefsel.

Visualisatie van amyloïde β-depositos in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

Meer video's verkennen