Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

De belangrijkste bijdrage van ons papier is dat we een nauwkeurig en fijn landschap van amyloïde bètapathologie van de alzheimerhersenen hebben onderzocht met de beeldvormingstechnologie van de MALDI-beeldvormingsmassaspectrometrie. We bereikten technologische vooruitgang door het genereren van een speciaal protocol met mierenzuur voorbehandeling van de weefselglijbanen. Na MALDI-IMS worden segmentatiekaarten gegenereerd en worden berekeningen uitgevoerd om nieuwe markereiwitten of peptiden te ontdekken die zijn gekoomiseerd met plaque en subarachnoïdale vasculatuur.

Verkrijg menselijke corticale specimens voor IMS uit hersenen die werden verwijderd, verwerkt en opgeslagen bij min 80 graden Celsius binnen acht uur na de dood. Neem het hersenexemplaar uit de occipitale cortex van AD-patiënten en leeftijdsgedefgede controles. Om de weefselsecties op een cryostat te snijden, eerste plaats geleidende indium tinoxide of ITO-gecoate microscoopglasdia's in de cryostat.

Verwarm de autopsie hersenen specimen van min 80 graden Celsius tot min 22 graden Celsius in de cryostat. Bevestig een nieuw wegwerpblad aan de cryostat voor elk experiment. Probeer altijd een schoon deel van het mes te gebruiken.

Zet de bevroren autopsie hersenen op het podium, samen met een kleine hoeveelheid optimale snijtemperatuur verbinding. Voor IMS en immunohistochemie, snijd vijf tot zes secties van elk weefselmonster. Wanneer het mes net begint te snijden het weefsel, draai het wiel en het gezicht van het blok totdat alle weefsel is blootgesteld.

Als er een kleine streep of scheur over de sectie, wacht in de cryostat totdat de temperatuur aanpassing automatisch lost. Tel een paar seconden voor het openen van de anti-roll met een weefsel eronder. Plaats het weefselsegment onmiddellijk op de ITO-gecoate kant van de glazen schuif.

Ontdooi het weefselsegment door een vinger onder de glijbaan op de niet-ITO-gecoate kant te leggen. Het weefsel blijft aan de glijbaan kleven. Zorg ervoor dat het weefsel zo plat mogelijk is zonder rimpels.

Om de weefselsecties te spoelen, dompel de monsters onder in 40 tot 100 milliliter ethanol van 70%ethanol in een glazen kleurpot gedurende 30 seconden om endogene lipiden en anorganische zouten te verwijderen. Was de monsters met behulp van de wasvolgorde in het tekstprotocol. Droog vervolgens de monsters 30 minuten in een vacuüm.

Behandel nu de weefselsecties met een mierenzuurdamp voor een betere ionisatie van de amyloïde bèta-eiwitten uit autopsie hersenweefsel. Om dit te doen, bereid de oven op 60 graden Celsius en een incubatieglas schotel met vijf milliliter van 100% mierenzuur. Houd de luchtvochtigheid in de incubatieglazen schotel op verzadigingsniveau.

Plaats de weefselglijbanen in de incubatieglazen schotel terwijl onderdompeling in het mierenzuur vermijdt en gedurende zes minuten te behandelen. Neem een optisch beeld van de monsters met behulp van een filmscanner, gelscanner of een digitale microscoop. Voer deze stap uit op kamertemperatuur.

De uitlijning van het optische beeld van de monsters is noodzakelijk wanneer het monsterdoel in het instrument wordt geplaatst. Meestal is het niet mogelijk om de weefselsectie onder de matrixlaag te herkennen. Om de optische beelden te correleren met de monsters, maak u geleidemarkeringen die zowel in het optische beeld als onder de matrixlaag in de cameraoptiek zichtbaar zijn.

De eenvoudigste manier is om ten minste drie correctie vloeistofmarkeringen ter plaatse rond het monster voor het nemen van de optische afbeelding. Om de matrix te spuiten met een ultrasone sproeier, verwijder het weefsel te worden gespoten uit de desiccator en plaats het in de kamer. Zorg ervoor dat het weefsel het sensorvenster niet bedekt.

Start de voorbereiding door op de startknop te drukken. Meestal is de voorbereidingstijd ongeveer 90 minuten. De voorbereiding wordt automatisch geregeld via de monitoring van de dikte en nattigheid van de matrixlaag.

Als alternatief, om de matrixoplossing op het weefseloppervlak te spuiten met een automatische sproeier, gebruik dan een oplosmiddelpompsysteem dat is ingesteld op 10 psi en 0,15 milliliter per minuut om de matrixoplossing te leveren. Een constante stroom van verwarmd schedegas zal gezamenlijk worden geleverd met de matrix oplossing spray. Voer beeldexperimenten met hoge doorvoer en hoge ruimtelijke resolutie uit met MALDI-IMS.

Voor massaspectrometriemeting, definieer de weefselgebieden met behulp van de MALDI-besturingssoftware en data-analysesoftware. Verkrijg spectra in een positieve lineaire modus met een massa-laadverhouding van 2,000 tot 20.000 en een ruimtelijke resolutie van 20 en 100 micron. Om de kalibratiestandaard te maken, los u de peptidekalibratiestandaard en de eiwitkalibratienorm op in een één-vier-verhouding met CHCA- en TA30-oplossing en verdun deze vervolgens 10 keer.

Plaats één microliter kalibratiestandaard op de dia op vier verschillende locaties. Met behulp van moleculaire histologie software, overlay meerdere signaalbeelden om de ruimtelijke correlatie van verschillende signalen te vinden, zoals verschillende amyloïde beta peptiden colocalizing in seniele plaques en arteriële wanden. De cerebrale amyloïde angiopathie of CAA fenotypes van patiënt nummer drie waren het meest prominent aanwezig in deze studie.

MALDI-IMS van het hersenweefsel van deze patiënt duidelijk gevisualiseerd dat amyloïde beta 1-42 en amyloïde beta 1-43 werden bij voorkeur afgezet als seniele plaques in de cerebrale parenchyma. Daarentegen werden kortere amyloïde beta's zoals amyloïde bèta 1-36 tot 1-41 bij voorkeur afgezet op de leptomeningeal vasculaire gebieden. Er waren geen significante signalen in de niet-pathologische controle.

Distributies van amyloïde bèta 1-40 en amyloïde bèta 1-42 werden verder gevalideerd met immunohistochemie met behulp van aangrenzende bevroren delen van de weefsels. De anti-amyloïde beta 1-40 antilichaam gelabeld CAA en bleek amyloïde beta 1-40 is bij voorkeur afgezet in leptomeningeal bloedvaten, wat duidelijk contrast is met de verdeling van amyloïde beta 1-42 in de cerebrale parenchyma als seniele plaques. Hier wordt een segmentatiekaart weergegeven die is verkregen met een bisecting k-means analyse toegepast op dezelfde sectie van patiënt nummer drie.

Deze clustering methode met succes geïdentificeerd plaque-achtige structuren in de parenchyma en vasculaire structuren in de subarachnoïdale ruimte. Het is interessant om een klein cirkelvormig gebied te vinden in het parenchyma dat wordt gedetecteerd net rond een kleine arteriole in de parenchyma en in de subarachnoïdale ruimte. Dit wordt geverifieerd door enkele ionenbeelden van deze individuele amyloïde bètapetiden.

Er is een limiet om een breed scala aan amyloïde beta's tegelijkertijd te traceren, zelfs als u de specifieke antilichamen gebruikt. Hier tonen we de verdeling van amyloïde bèta in menselijke hersenen met behulp van de geavanceerde MALDI imaging massaspectrometrie methode. Wij geloven dat deze bijdrage maakt doorbraak in de ziekte van Alzheimer onderzoek, omdat dit rapport biedt de karakterisering van de volledige set van amyloïde beta-eiwitten in de menselijke autopsie hersenen.

De meest indrukwekkende bevinding is dat slechts een enkele aminozuur wijziging op de C-terminal van amyloïde beta-eiwit maakt een drastische verandering in hun distributie. De weefselvoorbereidingsstappen zijn van cruciaal belang om een effectieve ionisatie van geaggregeerde eiwitten in menselijk hersenweefsel te verkrijgen. Homogene cocrystallisatie van de analyt met matrixen cruciaal voor hoge gevoeligheid en artefact-vrije beeldvorming.