Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

De kleine Rho GTPase is een eiwit van een superfamilie met diverse cellulaire functie. Bijvoorbeeld, deze eiwitten zijn betrokken bij de regulering van het lot van cellen, cellulaire reactie op een stress, cellulaire beweeglijkheid, en celcyclus. De activiteit van een klein Rho GTPase eiwit wordt geregeld door post-translationele modificatie.

Deze wijzigingen zijn betrokken bij een strikte regulering van hun activiteiten. Als voorbeeld, eiwit prenylation en GTP binding zijn de belangrijkste post-vertaling wijziging van deze eiwitten. Mijn lab heeft onlangs een eenvoudige methode ontwikkeld om de post-translationele modificatie van deze superfamilie-eiwitten te onderzoeken.

Hiervoor hebben we 251 glioblastoomcellijnen gebruikt, die ze targeten met simvastatine, en post-translationele modificatie van deze eiwitten hebben gemeten. De methode omvat subcellulaire fractionering en GTP gebonden eiwit aan dit eiwit superfamilie. Hiervoor hebben we lokalisatie van RhoA en GTP aan RhoA gebruikt om de post-translationele wijziging van dit eiwit te meten.

Verwijder cellen uit de 37 graden incubator. Kijk naar de cellen onder de microscoop om samenvloeiing te bevestigen. De cellen moeten op 70 tot 80 procent confluent.

Was de cellen één keer met koude PBS. Voeg vijf milliliter EDTA toe en plaats de cellen vijf minuten terug in de 37 graden incubator. Na vijf minuten incubatie, verzamel EDTA met cellen in een 15 mil buis.

Plaats de buis in een ijskast, en ga naar de centrifuge. Zet de centrifuge op 1500g bij vier graden, en draai de cellen gedurende vijf minuten. Na de spin, verwijder de supernate, en voeg een milliliter koude PBS.

Triturate de cellen goed. Breng het celmengsel over op een nieuwe gelabelde buis van 1,5 milliliter. Na de overdracht, ga naar de centrifuge.

Stel de centrifuge op 1500g op vier graden en draai de cellen gedurende vijf minuten. Controleer de pelletgrootte. Leg de monsters op ijs.

Gooi de supernate volledig weg, zonder de pellet te storen. Buffer 1 toevoegen. Meng goed door pipetting op en neer.

Ga over tot sonicatie. Stel de sonicator voor vijf cycli, vijf seconden per stuk, en herhaal drie keer. Sonicatie moet doorgaan op ijs, maar wordt niet getoond in de video, voor illustratieve doeleinden.

Ga naar de ultracentrifuge. Gebruik een ultracentrifuge om de celhomogenates te scheiden in cytoplasmatische en membraanfracties. Zet de centrifuge op 100,000g gedurende 35 minuten, op vier graden.

Controleer de pelletgrootte. Scheid de supernate. Verzamel de supernate volledig, voorzichtig om niet storen de pellet.

De supernate is de cytosolische fractie. Plaats de supernate in een nieuw gelabelde buis. Voeg Buffer Twee toe aan de pellet.

Dit is de membraanfractie. Meng goed door pipetting op en neer. Ga over tot eiwitbepaling en westerse vlekmonsterbereiding.

Laad de monsters op een SDS-PAGINA met een 15%gel. Bevestig eiwitoverdracht door de moleculaire gewichtsmarker te visualiseren of een Ponceau-vlek te gebruiken. Voeg primaire antilichamen toe voor immunoblotting-analyse.

We gebruiken Rac1/2/3, Cdc42 en RhoA. Haal de cultuurplaten uit de couveuse. Kijk naar de cellen onder de microscoop om samenvloeiing te bevestigen.

De cellen moeten 70 tot 80% confluent zijn. Zet de cultuurplaat op ijs. Spoel de media aan en was de cellen met ijskoude PBS pH'd tot 7,2.

De PBS aanzuigen. Kantel de platen een extra minuut op ijs om alle restanten van PBS te verwijderen. Resterend PBS heeft een negatieve invloed op deze test.

Lyse de cellen in een passend volume van ijskoude lysis buffer met protease en fosforremmers. Oogst cel lysate met de celschraper. Helling de cultuur plaat voor deze techniek.

Breng het lysaat in een ijskoude cryobuis en blijf op ijs. Meng grondig met behulp van een vortex. Houd 10 microliter van het lysaat voor een eiwittest.

Snap bevriest het resterende cellysaat in vloeibare stikstof. Breng de snap bevroren cryotubes naar een min 80 vriezer. Bewaar deze monsters.

Houd er rekening mee dat monsters niet langer dan 14 dagen mogen worden opgeslagen. Bereid cellysates van de andere cultuurplaten door stappen één tot acht, één voor één te herhalen. Werk snel en laat de monsters nooit langer dan 10 minuten op ijs staan.

Behandel nooit alle cultuurplaten tegelijk. Meet de eiwitconcentratie. Bereken het volume van de lysisbuffer om de eiwitconcentratie tussen de monsters te normaliseren.

Opmerking: een milligram per milliliter is meestal de beste, echter, 0,3 tot twee milligram per milliliter kan worden gedetecteerd. Bereid een blanco besturingselement voor door 60 microliters lysebuffer en 60 microliter bindingsbuffer aan een microbuis toe te voegen. Bereid een positieve controle door het toevoegen van 12 microliters van Rho controle eiwit, 48 microliters van lyse buffer, en 60 microliter van bindende buffer.

Haal de Rho affiniteit plaat uit zijn zak en plaats op ijs. Los het poeder in de putten op met 100 microliter ijskoud gedestilleerd water. Hou de plaat in het ijs.

Ontdooi de snap bevroren cel lysates in een waterbad ingesteld op 25 graden Celsius. Voeg het berekende volume van de ijskoude lysebuffer toe aan elk monster om de eiwitconcentratie te normaliseren. Breng 60 microliter genormaliseerde ijskoude monsters over naar microbuisjes en voeg 60 microliterbinden aan bindende buffer toe.

Meng grondig, en houd op ijs. Verwijder het water volledig uit de microplaat door krachtig te vegen, gevolgd door vijf tot zeven harde kranen op een labmat. Voeg 50 microliter van de genormaliseerde monsters, een blanco controle, en een positieve controle aan de putten in tweevoud.

Plaats de plaat 30 minuten op een orbitale shaker bij vier graden Celsius. Let op: de snelheid van de shaker moet worden ingesteld op 300 rpm. Maak de monsters van de plaat door te vegen en was twee keer met 200 microliters van de wasbuffer op kamertemperatuur.

Verwijder de wasbuffer na elke wasbeurt krachtig uit de putten door te vegen, gevolgd door te tikken en de plaat op de bank op kamertemperatuur te houden. Voeg 200 microliters van kamertemperatuur antigeen-presenteren buffer in elke put, en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Veeg de oplossing uit de putten en was drie keer met 200 microliters van de wasbuffer op kamertemperatuur.

Voeg 50 microliter vers bereide tot 250 anti-RhoA primaire antilichaam aan elke put. Plaats de plaat 45 minuten op een orbitale shaker bij 300 tpm, ingesteld op 25 graden Celsius. Veeg de oplossing uit de putten en was drie keer met 200 microliter wasbuffers bij kamertemperatuur.

Voeg 50 microliter vers bereide tot 250 anti-RhoA secundaire antilichaam aan elke put. Plaats de plaat 45 minuten op een orbitale shaker, bij 300 tpm, ingesteld op 25 graden Celsius. Bereid het HRP-detectiereagensagemiddel voor door gelijke volumes reagens A en reagens B.Flick uit elke put en was drie keer met 200 microliters van de wasbuffer voor kamertemperatuur.

Voeg 50 microliter vers bereide HRP-detectiereagens toe aan elke put. Lees het luminescentiesignaal binnen drie tot vijf minuten om een maximaal signaal te verkrijgen. Analyseer de resultaten met behulp van een geschikt softwarepakket.

Onze resultaten tonen aan dat simvastatine de lokalisatie van RhoA in de membraanfractie verminderde. Wat verhoogd is accumulatie in de cytosolische fractie. Interessant, simvastatine verhoogde GTP gebonden aan de RhoA.Why?

We verwachten dat deze activiteit aanzienlijk vermindert. Het is zeer belangrijk dat ze zowel subcellulaire lokalisatie van dit eiwit meten en GTP-binding aan dit eiwit meten om een eindevaluatie van de activiteit van de kleine Rho GTPases te hebben.