Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation
3 mei 2018
Beschrijven we een nieuwe methode voor de levering van DNA plasmide in de cellen van de urothelial van muis blaas in vivo via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Het biedt een snelle en gemakkelijke manier voor het genereren van autochtone Muismodellen van ziekten van de blaas.
Het algemene doel van deze methode is om DNA-plasmiden in het blaasurotheel van levende muizen in vivo te leveren voor genoverexpressie of genoombewerking. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het blaaskankerveld, zoals hoe verschillende genetische mutaties de progressie van blaaskanker bevorderen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en gemakkelijke manier biedt om genen in de blaas te leveren zonder de veiligheidsproblemen en technische belemmeringen die gepaard gaan met virale vectoren.
Ik had eerst het idee voor deze methode om geen gemodificeerd geassocieerd virus te gebruiken voor DNA-levering, wat niet goed werkte in de blaas. De implicatie van deze techniek kan zich ook uitstrekken tot gentherapie omdat elektroporatie een efficiënte levering van DNA-plasmiden in de urotheelcellen kan bereiken. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Ofir Stefanson en Yueli Liu uit mijn laboratorium.
Om deze procedure te beginnen, autoclaveer alle chirurgische instrumenten en steriliseer de werkruimte met 70% ethanol. Spuit chirurgische instrumenten en de handschoenen regelmatig met 70% ethanol tijdens het uitvoeren van de volgende procedures om steriele omstandigheden te behouden. Om te beginnen, verdoof de muis en scheer het chirurgische gebied.
Om de urine te verwijderen, breng smering aan op de katheter en zorg ervoor dat de buitenkant volledig bedekt is. Breng vervolgens de katheter in de urethra-opening van de muis en duw deze langzaam totdat deze de blaas bereikt. Druk zachtjes op de buik om het urineverlies te bevorderen.
Vervolgens, gooi de urine met een pipet in een afvalinische, pipet dan 80 microliters PBS in het uiteinde van de katheter met het andere uiteinde nog in de blaas. Vervolgens, bevestig voorzichtig een millimeter spuit aan de katheter. Druk zachtjes op de spuit om PBS in de blaas te injecteren.
Laat wat PBS in de katheter om luchtbellen in de blaas te voorkomen. Vervolgens, verwijder de spuit en wacht tot het PBS uit de blaas is uitgelopen. Druk zachtjes op de buik om PBS te evacueren, gooi vervolgens het PBS in de katheter weg met een pipet in de afvalinische.
Herhaal het PBS wassen nog twee keer. Voor elke blaas om te transfecteren, bereid minstens 20 microliters DNA-plasmid voor bij één microgram per microliter. Voeg vervolgens één microliter trypanblauw toe aan de 20 microliters plasmide oplossing en een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en pipet om goed te mengen.
Om het plasmide te leveren, breng 70% ethanol aan op de buik. Maak een verticale insnijding van één centimeter om de buikhuid boven de blaas te openen. Snijd vervolgens de spierlaag om de blaas bloot te leggen.
Pipet minstens 20 microliters van de plasmide plus trypanblauw oplossing in het uiteinde van de katheter en los het aan de spuit. Injecteer vervolgens de plasmide oplossing in de blaas. Als de blaas blauw wordt, is de injectie succesvol.
Laat wat vloeistof in de katheter om luchtbellen in de blaas te voorkomen. Vervolgens, pak het externe urethrale oraal en verwijder de katheter en de spuit. Gebruik een touw om het externe urethrale oraal strak te maken.
Maak twee lussen met het touw, en knoop het vervolgens met twee knopen. Dit is een cruciale stap die twee mensen vereist om samen te werken. Zorg ervoor dat de knopen strak zitten zodat de plasmiden niet kunnen lekken.
Nu, zet de elektroporatiegenerator aan. Knijp de blaas met twee elektroden en druk op de voetpedaal om elektroporatie uit te voeren. Om de blaas open te houden, kan je de achterkant van de buiksnede knijpen met pincetten.
Vermijd contact tussen de pincetten en de elektroden, omdat dit een vonk kan veroorzaken. Als het klaar is, naai de buik en huidopening met steriele chirurgische hechting. Verwijder het touw en breng clips aan.
Breng jodium aan op de wond, en verwijder vervolgens het dier uit het isofluraansysteem. Dien buprenorfine pijnstiller subcutaan toe om postoperatieve pijn te verlichten. Houd het dier op de verwarmingsmat en zet het na volledige herstel terug in de thuiscamer.
Controleer het dier minstens eenmaal per dag op normale mobiliteit, drinken en eetgedrag, en geen tekenen van infectie totdat de incisie is genezen. Vervolgens, een week later, verwijder de clips. Dien vervolgende injecties van buprenorfine pijnstiller toe als het dier pijnsymptomen vertoont zoals verminderd verzorgen, verhoogde agressiviteit en vocalisatie.
Om een succesvolle genoverdracht in het blaasurotheel aan te tonen, werd 20 microliters van pCAG-GFP plasmide en trypanblauw oplossing geïnjecteerd via de urethra en vijf elektrische pulsen werden toegediend. Hier is de succesvolle elektroporatie die de blaas groen maakte na 48 uur, terwijl een negatieve controleblaas die geen elektroporatie onderging geen GFP signaal vertoonde. Immunofluorescente kleuring van gesneden blaasweefsels werd uitgevoerd met CK5, CK18, en GFP antilichamen.
GFP signaal werd waargenomen in paraplu, intermediaire en basale cellen, maar niet in de spierlaag, wat wijst op een goede specificiteit van plasmide overdracht in het urotheel. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 15 minuten worden uitgevoerd als het goed wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling ervan, baant deze techniek de weg voor onderzoekers in het gebied van blaaskanker om nieuwe autochtone muismodellen te bouwen om de progressiemechanismen van de ziekte te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het afleveren van DNA-plasmiden in de urotheelcellen van de blaas van muizen in vivo via urethracatheterisatie en elektroporatie. Deze techniek biedt een snelle en handige manier om autochtone muismodellen van blaasziekten te genereren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Gentherapie
- Blasenkankeronderzoek
- Elektroporatietechnieken
Achtergrond
- De methode is bedoeld om DNA-plasmiden in het urotheel van de blaas bij levende muizen over te brengen.
- Het beantwoordt kernvragen over de progressie van blaaskanker.
- Traditionele virale vectoren brengen veiligheidsrisico's en technische barrières met zich mee.
- Deze methode biedt een alternatief voor gentherapie.
Doel van de studie
- Om genoverexpressie of genoommodificatie in blaascellen te faciliteren.
- Om de effecten van genetische mutaties op blaascellenkanker te onderzoeken.
- Om de efficiëntie van DNA-afleveringsmethoden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Urethra-catheterisatie voor plasmidetoediening.
- Elektroporatie om de DNA-opname te verhogen.
- In vivo toepassing in muismodellen.
- Demonstratie door Ofir Stefanson en Yueli Liu.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflevering van DNA-plasmiden in urotheelcellen.
- Snelle en efficiënte methode in vergelijking met virale vectoren.
- Potentiële toepassingen in gentherapie en kankeronderzoek.
- Aangetoonde haalbaarheid in levende muismodellen.
Conclusies
- Deze methode biedt een nieuwe aanpak voor genoverdracht in de blaas.
- Het heeft implicaties voor het bestuderen van blaasziekten en kanker.
- Verder onderzoek zou de toepassingen in gentherapie kunnen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode pakt een kritieke bottleneck in het onderzoek naar blaasjeskanker aan door snelle, niet-virale genoverdracht naar het urotheel in vivo mogelijk te maken. Het ondersteunt targetvalidatie en mechanistische risicoreductie door tijdelijke overexpressie of knockdown van kandidaatgenen in een ziekte-relevant systeem toe te staan. De benadering versnelt de generatie van preklinische modellen, waardoor de tijd en kosten worden verminderd in vergelijking met kiembaanmodellen, terwijl de fysiologische relevantie voor translationele studies behouden blijft.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door plasmiden af te leveren aan urotheelcellen van de blaas voor functionele genmodulatie.
- Operationele waarde: Biedt een snel en handig alternatief voor virale vectoren, waardoor biosafety-beperkingen en vertragingen in de productie worden vermeden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt fenotypische screening in een native weefselcontext, wat het vertrouwen in de selectie van targets voor blaascellulaire oncologische pathways verhoogt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare, kwantificeerbare resultaten (bijv. GFP-expressie) om de transfectie-efficiëntie en genexpressieniveaus te beoordelen.
- Operationele waarde: Standardiseert de afgifte van plasmiden via catheterisatie en electroporatie, wat consistente screening van verbindingen of genetische perturbaties mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de preparatie van gevalideerde blaasmodellen voor downstream drug-response- of biomarker-assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Creëert autochtone muismodellen die de mechanismen van initiatie en progressie van blaaskanker weerspiegelen.
- Operationele waarde: Maakt induceerbare genmodulatie in volwassen muizen mogelijk, wat temporele controle in preklinische studies ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery-bevindingen en preklinische validatie door genetische effecten te testen in een klinisch relevant orgaansysteem.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek, waardoor een snelle iteratie mogelijk is van target-hypothese naar in vivo validatie in blaasweefsel.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en doelwitbevestiging via directe genoverdracht naar urotheelcompartimenten.
- Screening: Levert kwantitatieve fluorescentie- of immunohistochemische resultaten voor het beoordelen van de efficiëntie van transfectie en genmodulatie.
- Analytiek: Biedt meetbare eindpunten (bijv. GFP-signaalintensiteit, celtypespecificiteit) om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Maakt preklinische modellering van blaaskankerfenotypes mogelijk met behulp van genetisch gemanipuleerd urotheel.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Creëert een herbruikbaar platform voor genoverdracht voor meerdere doelwitten en studies binnen urologisch ziekteonderzoek.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door de afhankelijkheid van kunstmatige overexpressiesystemen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde chirurgische en electroporatieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de generatie van modellen te versnellen en uitval door een slechte targetselectie te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets voor blaasjeskanker mogelijk op basis van functionele in vivo data.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in muischirurgische technieken, catheterisatie en electroporatie.
- Afhankelijk van steriele chirurgische instrumenten, een electroporatiegenerator en compatibele elektroden.
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor een consistent plasmidvolume, pulseparameters en blootstelling van de blaas.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten plasmidgrootte, promoterkeuze en de turnoverrate van het urotheel, die de duur van de expressie beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten transiënte expressie (piek na 48 uur) en technische uitdagingen bij het behouden van de integriteit van de blaas tijdens de procedures.
