Isolatie van de mandibulaire klier Reservoir inhoud van Borneose ' exploderende mieren (Formicidae) voor Volatilome analyse door GC-MS en MetaboliteDetector
26 augustus 2018
Minderjarige werknemers van de mier soorten Colobopsis explodens worden ontleed om te isoleren van de inhoud van de wasachtige opgeslagen in hun hypertrophied mandibulaire klier reservoirs voor latere oplosmiddel-extractie en analyse met gaschromatografie-massaspectrometrie. De aantekening en de identificatie van vluchtige bestanddelen met behulp van de open-source software MetaboliteDetector wordt ook beschreven.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de metabolomics van insecten te beantwoorden. De metaboliet-profileringsbenadering kan worden gebruikt om de chemische ecologie van mieren te bestuderen door de rol van de vluchtige stoffen in de interactie met andere organismen te verduidelijken. Het belangrijkste voordeel van de gepresenteerde workflow is: dat deze bestaat uit twee verschillende delen die in principe onafhankelijk van elkaar kunnen worden toegepast.
Eerst, de fysieke isolatie van het reservoir van de mandibulaire klier en zijn inhoud, en ten tweede, de niet-doelgerichte profilering en identificatie van vluchtige organische bestanddelen, in het biologische monster van belang. De procedure zal worden gedemonstreerd door Michaela Hoenigsberger, een getalenteerde promovendus uit mijn laboratorium. Voordat je de mieren dissecteert, reinig in een afzuiging een glazen petrischaal en de dissectie-instrumenten met papieren zakdoeken en een een op een volumeverhouding van methanol en water.
Bewaar de schaal op min 20 graden Celsius. Neem vervolgens de massa van 1,5 milliliter korte draadbuisjes inclusief hun schroefdopjes die silicium PTFE Septa bevatten. Bewaar de buisjes op ijs.
Plaats vervolgens een bevroren vervormbaar koude pak in een polystyreenschuimdoos. Laad vervolgens de petrischaal op het koude pak en plaats een bevroren mier in de schaal. Onderzoek nu de mier met een stereomicroscoop.
Controleer de integriteit van zijn gastrale compartimenten. De mier moet een intacte gaster-regio hebben. Gebruik geen mieren met platte gasters of sporen van verharde inhoud van de mandibulaire klierreservoir op hun lichaamsoppervlakken.
Isoleer nu de inhoud van het reservoir van de mandibulaire klier van de mier. Gebruik pincetten om de propodium en de petiolus vast te grijpen en trek deze lichaamssegmenten voorzichtig uit elkaar. Pak vervolgens de gaster bij tergite vier vast met fijne pincetten.
Met een ander paar pincetten grijpt u tergite één en verwijdert u deze voorzichtig door hem eraf te pellen. Herhaal dit proces om tergites twee en drie af te scheuren, zodat de gastrole portie van de reservoirs van de mandibulaire klier grotendeels zichtbaar is. De reservoirs van de mandibulaire klier zijn geel van kleur bij C. Explodens arbeidersmieren, maar de kleur kan variëren van wit via geel tot rood bij andere soorten.
Verwijder vervolgens met behulp van een dissectienaald voorzichtig de wasachtige inhoud van de gepaarde reservoirs van de mandibulaire klier door ze uit het gastrale compartiment te krabben. Verwijder alleen die delen van de inhoud van het reservoir van de mandibulaire klier die kunnen worden geïsoleerd zonder druk uit te oefenen op de andere klieren en lichaamsstructuren die aanwezig zijn in de gaster van de mier. Het is niet nodig om alle inhoud van het reservoir van de mandibulaire klier te verzamelen.
Pak nu de inhoud van het reservoir van de mandibulaire klier op door ze voorzichtig aan te raken met de punt van de dissectienaald totdat ze eraan kleven. Breng vervolgens de klieri-inhoud over in een koude 1,5 milliliter korte draadbuis. Het kan nodig zijn om de punt van de naald langs de wand van de buis te bewegen en de klieri-inhoud op de wand van de buis te smeren.
Houd de collectie bedekt en op ijs totdat deze kan worden geanalyseerd. Reinig tussen dissecties de instrumenten en de schaal opnieuw met het methanol en water mengsel. Om één analytisch monster te maken, combineer de inhoud van het reservoir van de klieren van meerdere mieren.
In dit geval wordt de klieri-inhoud van vijf C. Explodens arbeidersmieren gepoold. Verzamel voor een controle monsters die bestaan uit Dufour's klier, die naast de reservoirs van de mandibulaire klier ligt. Bepaal vóór het extraheren van de klieri-inhoud de massa's van de analytische monsters.
Voeg vervolgens 14 delen ijskoud hoogzuiver ethylacetaat toe aan één deel weefsel per massa. Vorm de bereiding gedurende vijf minuten onder gekoelde omstandigheden. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten en verzamel de supernatanten.
Er wordt ongeveer 55 tot 75 microliter supernatant verwacht van een monster van vijf mieren. Breng elk supernatant over in een voorgekoelde 1,5 milliliter korte draadbuis met een micro-inzetstuk van 0,1 milliliter, en sluit de buisjes stevig af met schroefdopjes met gaten en rode rubberen PTFE Septa. Bereid voor een volledige GCMS-meetsequentie een 1,5 milliliter korte draadbuis voor met een retentie-index-kalibratiemengsel, gemaakt door commercieel verkrijgbare alkaan standaardoplossing in Hexaan te verdunnen tot acht milligram per milliliter per verbinding.
Bereid vervolgens een andere buis met zuiver ethylacetaat om als oplosmiddel-blank te dienen. Laad op de gekoelde autosamplerlade van de gaschromatograaf eerst de oplosmiddel-blank, tweede, het retentie-index-kalibratiemengsel, derde, het extract van het inhoud van het reservoir van de mandibulaire klier en vierde, het extract van de inhoud van Dufour's klier. Plaats de monsters met de lade op ijs voor transport naar de gaschromatograaf.
Plaats de lade in de gekoelde autosampler. Injecteer voor elk monster een een microliter aliquot in de GC-massaspectrometer voor chromatografische scheiding op een kolom die geschikt is voor de doelverbindingen. Bijvoorbeeld een HP-5MS UI kolom.
Stel vervolgens de juiste GC-parameters in. Gebruik bijvoorbeeld helium als dragergas met een constante kolomstroom van één milliliter per minuut. Gebruik een oventemperatuurstijging beginnend bij 40 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door een stijging van 10 graden Celsius per minuut tot 330 graden Celsius.
Gevolgd door een vasthoudtijd van zeven minuten. Met deze parameters, stel de inlaattemperatuur in op 270 graden Celsius. Pas indien nodig de splitsverhoudingen voor de GC-massaspectrometer aan.
injectie zodat ze voldoende piekvormen en intensiteiten voor de belangrijke verbindingen bieden. Stel de hulptemperatuur in op 350 graden Celsius. Voor de massaspectrometer.
Gebruik de volgende parameters. Een MS-brontemperatuur van 230 graden Celsius, een MS-quadtemperatuur van 150 graden Celsius, een scanbereik van laag massa 30 tot
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het isoleren en analyseren van de wasachtige inhoud van de reservoirs van de mandibulaire klier in kleine werkers van de mierensoort Colobopsis explodens. De aanpak combineert fysieke dissectie met gaschromatografie-massaspectrometrie voor metabolietenprofilering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Insectenmetabolomics
- Chemische ecologie
- Gaschromatografie-massaspectrometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van de chemische ecologie van mieren is cruciaal voor het bestuderen van hun interacties met andere organismen.
- De reservoirs van de mandibulaire klier bevatten vluchtige organische verbindingen die een rol spelen bij deze interacties.
- Eerdere methoden ontbraken aan een allesomvattende aanpak voor het isoleren en analyseren van deze verbindingen.
- Deze studie presenteert een tweeledige workflow voor een effectieve analyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het isoleren en analyseren van vluchtige bestanddelen uit de mandibulaire klieren van mieren.
- Het verduidelijken van de rol van deze vluchtige stoffen in de chemische communicatie van mieren.
- Het leveren van een reproduceerbaar protocol voor onderzoekers in de insectenmetabolomics.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de reservoirs van de mandibulaire klier uit werkmieren van C. explodens.
- Oplosmiddelextractie van de klierinhoud met behulp van ethylacetaat.
- Gaschromatografie-massaspectrometrie voor het profileren van vluchtige verbindingen.
- Gebruik van MetaboliteDetector voor de annotatie en identificatie van metabolieten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van wasachtige inhoud uit de mandibulaire klieren.
- Identificatie van diverse vluchtige organische verbindingen middels GC-MS.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het profileren van mierenmetabolieten.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van de chemische ecologie van mieren.
Conclusies
- De gepresenteerde methode biedt een betrouwbare aanpak voor het analyseren van de inhoud van mierenklieren.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van chemische communicatie bij mieren.
- Deze workflow kan worden aangepast voor andere insectensoorten en studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol maakt de isolatie en het vluchtige metabolietenprofiel van gespecialiseerde klierweefsels bij niet-modelinsecten mogelijk, wat doelvalidatie in de chemische ecologie en mechanistische risicoreductie voor de ontdekking van bioactieve verbindingen ondersteunt. Door een reproduceerbare workflow te bieden voor de analyse van het reservoir van de mandibulaire klier, faciliteert het de identificatie van nieuwe vluchtige stoffen met potentiële toepassingen in de ontwikkeling van pesticiden of studies naar interspecies-signalering. De aanpasbaarheid van de methode over verschillende biologische systemen vergroot de bruikbaarheid in discovery-pipelines in een vroeg stadium die gestandaardiseerde, schaalbare monstervoorbereiding vereisen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door bioactieve kliersecreties te isoleren voor functionele karakterisering.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd dissectieprotocol dat metabole veranderingen na collectie minimaliseert door behandeling via een koudeketen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de identificatie van leadverbindingen door vluchtige profielen te koppelen aan ecologische functies, zoals defensie of signalering.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve GC-MS-gegevens die assay-standaardisatie mogelijk maken voor de detectie van vluchtige verbindingen over verschillende monsterbatches heen.
- Operationele waarde: Faciliteert solventextractie en supernatantbereiding die compatibel zijn met geautomatiseerde vloeistofbehandelings- en GC-MS-injectiesystemen.
- Schaalbaarheid: Gepoolde mierenmonsters maken herhaalde metingen mogelijk, wat het statistische vertrouwen in de identificatie van metabolieten verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt vergelijking van metabolietprofielen over verschillende omgevingscondities of soorten mogelijk, wat de ontdekking van biomarkers in chemische communicatiesystemen ondersteunt.
- Mechanische risicoreductie: Maakt onderzoek naar de specificiteit van verbindingen mogelijk door te controleren op kruiscontaminatie vanuit aangrenzende klieren (bijv. de klier van Dufour).
- Voorspellende betrouwbaarheid: Het gebruik van de retentie-index en spectrale matching in MetaboliteDetector verhoogt de betrouwbaarheid van annotaties voor daaropvolgende functionele assays.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege doelwitexploratie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder in pijplijnen voor de ontdekking van natuurproducten waarbij kliersecreten bronnen zijn van bioactieve moleculen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over de rol van vluchtige stoffen bij interspecies-interacties door de isolatie van klierspecifieke metabolieten mogelijk te maken.
- Screening: Levert extracten op die geschikt zijn voor screening via GC-MS met hoge resolutie, waardoor de detectie van tientallen vermoedelijke verbindingen per monster mogelijk is.
- Analytica: Genereert chromatografische en massaspectrale gegevens die een vergelijkende analyse tussen experimentele monsters en controlemonsters mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt klier-metabolietprofielen aan ecologische functies, wat bijdraagt aan de selectie van verbindingen voor verdere functionele validatie.
- Hergebruik in de sector: De extractiestappen en GC-MS kunnen worden toegepast op andere insectensoorten, micro-organismen of plantensystemen, waardoor de veelzijdigheid van het platform wordt vergroot.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door mechanistische ambiguïteit te verminderen via klierspecifieke isolatie en contaminatiecontroles.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde koudeketen-afhandeling van monsters en solventextractieverhoudingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontdekking van natuurproducten door vroegtijdige gegevens over vluchtigheid en zuiverheid te verschaffen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van metabolieten mogelijk op basis van detectiefrequentie, abundantie en de betrouwbaarheid van de vermoedelijke identificatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microdissectie en stereomicroscopie om klierreservoirs te isoleren zonder kruiscontaminatie.
- Afhankelijk van GC-MS instrumentatie met een gekoelde autosampler en de capaciteit voor temperatuurgeprogrammeerde runs tot 330°C.
- Necessiteert gestandaardiseerde solventextractieprotocollen (volumeratio ethylacetaat ten opzichte van massa) en handhaving van de koudeketen van collectie tot analyse.
- Vereist aanpassing van de kalibratie van de retentie-index en de MetaboliteDetector parameters voor verschillende biologische matrices.
- Beperkt door de noodzaak van gepoolde monsters om voldoende supernatantvolume te bereiken (55–75 µL van vijf mieren), wat de doorvoersnelheid voor zeldzame soorten beïnvloedt.
