Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van glycoproteïnen. Het biedt inzicht in de functie van het eiwit, de rol van N-gekoppelde glycosiden en het mechanisme en de werking van antibiotica die zich richten op het glycoproteïne. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden toegepast op elk glycoproteïne van belang.

Het vergemakkelijken van de structurele en biofysische karakterisering van een breed scala aan glycoproteïne-doelen. Het demonstreren van deze procedure zal worden uitgevoerd door Hong Cui, een coördinator van onderzoeksprojecten in ons laboratorium. Om te beginnen, bereid en transfecteer cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verzamel de cellen door centrifugatie bij 6.371 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Bewaar het supernatant en gebruik vervolgens een 0,22 micron filter om het te filteren. Laad het gefilterde supernatant met vier milliliter per minuut op een Ni-NTA kolom in een tafelchromatografiesysteem.

Was de kolom daarna met drie tot vier volumes wasbuffer. Verdun het gezuiverde glycoproteïne van de kolom met behulp van een elutiebuffergradiënt, terwijl je fracties verzamelt. Trek de fracties die de elutiepiek bevatten in een centrifugaalfiltratieapparaat met een nominale molecuulgewichtslimiet van 10 kilodalton.

Concentreer vervolgens door centrifugeren bij 4.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten of totdat het monster een volume van 500 microliter bereikt. Injecteer het geconcentreerde glycoproteïne in een 500 microliter monsterlus. Laad het glycoproteïne op een voorgeëquilibreerde hoge prestatiegrootte-exclusiekolom op een FPLC-systeem bij vier graden Celsius terwijl je fracties verzamelt.

Voer vervolgens een SDS-PAGE-gel uit om te identificeren welke elutiefracties het glycoproteïne bevatten en trek diegene die dat doen. Gebruik een centrifugaalfiltratieapparaat met een nominaal molecuulgewicht van 10 kilodalton om zuiver degelycosyleerd ECD te concentreren bij 4.000 keer G en vier graden Celsius totdat de gewenste concentratie is verkregen. Na het bepalen van de eiwitconcentratie centrifugeer je het monster bij 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om stof en andere verontreinigingen te verwijderen.

Voeg vervolgens 80 microliter van de kristallisatieoplossing van een commerciële kristallisatiescreen toe aan elke reservoirput in een 96-well sitting drop kristallisatieplaat. Gebruik een kristallisatierobot om druppels eiwit in de putjes van de kristallisatieplaat te verdelen. Gebruik een totale druppelvolume van 200 nanoliter bij een een-op-een verhouding van gezuiverd eiwit tot kristallisatieoplossing.

Verzegeld de plaat daarna met plakband. Breng de verzegelde plaat over naar een plaatbeeldvormer voor inspectie door zichtbaar en ultraviolet licht. Identificeer de omstandigheden die aanvankelijke glycoproteïnekristalkoppen geven en optimaliseer deze kristallen verder zoals beschreven in het tekstprotocol.

Cryoprotecteer de kristallen door ze in een oplossing van moedervocht te weken dat is aangevuld met 20% glycerol. Monteer vervolgens de kristallen in CryoLoops. Gebruik vloeibaar stikstof om de gemonteerde kristallen te flashvriezen voorafgaand aan gegevensverzameling.

Na het produceren van goed diffracterende kristallen in een 24-well kristallisatieplaat, bereid een voorraadoplossing van 50 millimolar ligand en 20 millimolar Tris bij pH 9,0 met 150 millimolar natriumchloride. Voeg verschillende concentraties van deze ligandoplossing toe aan de eerder bereide druppel die de ECD-kristallen bevat. Verzegeld de druppel voor incubatietijden variërend tussen vijf minuten en vijf dagen.

Gebruik een lichtmicroscoop om de kristallen visueel te volgen om eventuele veranderingen in morfologie te identificeren. Na incubatie monteer je de kristallen met behulp van CryoLoops en cryoprotecteer je ze in moedervochtoplossing die is aangevuld met 20% glycerol. Om Bio-Layer Interferometrie te starten, bereid je 50 millimeter 1X Kinetics Buffer voor van 10X Kinetics Buffer zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg 200 microliter van deze buffer toe aan een voorgewekte plaat. Breng zes Ni-NTA biosensoren over naar de plaat en laat ze 10 minuten hydrateren in de buffer. Verdun vervolgens His-getagd ECD in één milliliter 1X Kinetics Buffer tot een eindconcentratie van 25 nanogram per microliter.

En bereid seriële verdunningsreeksen van het gezuiverde FAB voor. Aqueate de reagentia in een 96-well microplaat, zoals hier te zien is. Waar B staat voor 1X Kinetics Buffer, L staat voor het laden van His-getagd glycoproteïne, de numerieke invoer vertegenwoordigt de verdunde FAB-concentraties en R staat voor de regeneratiebuffer.

Breng de gehydrateerde biosensoren over naar putjes met 1X Kinetics Buffer gedurende 60 seconden om ze te baselinersen. Laad vervolgens glycoproteïne op een concentratie van 25 nanogram per microliter gedurende 240 seconden bij 1.000 RPM. Plaats de biosensoren terug in de putjes met 1X Kinetics Buffer gedurende 60 seconden voor een tweede baseline.

Breng de sensoren over naar de putjes met de seriële verdunningsreeksen van FAB gedurende 180 seconden. Na deze associatiefase, breng je de biosensoren terug naar 1X Kinetics Buffer voor een 180 seconden dissociatiestap. Open vervolgens de analysesoftware.

Onder tabblad één, importeer en selecteer vervolgens de gegevens. Onder tabblad twee, stap één gegevensselectie, kies sensorselectie. Markeer de referentieputjes, klik vervolgens met de rechtermuisknop om de referentieput te selecteren.

In stap twee, subtraktie, selecteer referentieputjes. Hierna, onder stap drie Y-as uitlijnen, selecteer baseline en stel een tijdbereik in van 0,1 seconden tot 59,8 seconden. In stap vier selecteer je inter-stap correctie en lijn uit naar dissociatie.

In stap vijf, verwerk Savitzky-Golay Filtering en klik op gegevens verwerken. De poort naar tabblad drie. Onder stap twee analyseren met een een-op-een model, selecteer associatie en dissociatie, selecteer globale fitting en groepeer op