Name: Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer glycoproteïnen met de immunoglobuline-vouw karakteriseren via röntgendiffractie en biofysische technieken. Deze methode biedt inzicht in eiwitfunctie en interactiedynamica voor structureel biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Röntgendiffractie experimenten beschreven in dit document werden uitgevoerd met behulp van de straallijnen 08-ID en 08-BM bij de Canadese lichtbron, die wordt ondersteund door de Stichting van Canada voor innovatie, natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada, de Universiteit van Saskatchewan, de regering van Saskatchewan, Canada westerse economische diversificatie, de Raad Canada van nationale onderzoeksprogramma en de Canadian Institutes of Health Research. Wij willen de structurele & biofysische Core faciliteit, het ziekenhuis voor zieke kinderen, erkent voor de toegang tot de ITC en BLI instrumenten. J.E.O. werd gesteund door Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 van de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek. T.S. is een geadresseerde van een Canada afgestudeerde beurs Master Award en een Vanier Canada Graduate beurs van de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek. Dit werk werd gesteund door de operationele subsidie PJT-148811 (J.-P.J.) van de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek. Dit onderzoek werd uitgevoerd, gedeeltelijk dankzij de financiering van de Canada Research Chairs programma (J.-P.J.).

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Membraan-verankerd glycoproteïnen kritisch zijn voor cel functie en aantrekkelijke therapeutische doelen zijn. Hier presenteren we een protocol voor de structurele en biofysische karakterisatie van het ECD van membraan glycoproteïnen, alleen én in complex met klein molecuul liganden en Fab-fragmenten. We hebben met succes dit protocol gebruikt om te bepalen van de kristalstructuur van de drie domeinen van het N-terminal-meeste Ig van het extracellulaire gedeelte van menselijke CD2228, een kritische co receptor op B cellen die betrokken zijn bij het houden van de Humorale immuniteit in selectievakje79. Wij hebben ook gekenmerkt van de bindende site van CD22 met zijn natuurlijke ligand alpha2-6 sialyllactose, en de wijze van erkenning van een therapeutisch antilichaam naar menselijke CD22 gedefinieerd. Deze resultaten bieden inzicht in de structuur-functie relatie van een belangrijk lid van de Siglecs familie die uitdrukking op de B-cellen en een moleculaire routekaart op weg naar de ontwikkeling van nieuwe CD22 gerichte klein molecuul en antilichaam gebaseerde heeft beperkt Therapeutics. Terwijl dit protocol met succes voor een Ig-bevattende B-cel receptor gebruikt werd, stellen wij voor dat onze aanpak kan worden toegepast voor de structurele en biofysische karakterisatie van een membraan glycoproteïne met een verschillend domein-organisatie. In dergelijke gevallen door ontwerp en combinatorische N-linked glycan mutaties (hetzij Gln of Ala) kunnen worden geëvalueerd om te zoeken naar een constructie geschikt voor kristalgroei en hoge resolutie diffractie te bouwen.
Verkrijgen van een homogene en zuiver glycoproteïne steekproef is van cruciaal belang voor kristalgroei en röntgendiffractie, alsmede voor downstream biofysische karakterisering. N-gebonden glycanen aanwezig op glycoproteïnen zijn per definitie heterogeen, en kan leiden tot conformationele en chemische heterogeniteit binnen de glycoproteïne dat kristal vorming kan afschrikken. Verklein dit micro-heterogeniteit en kunnen strategieën die invoering van puntmutaties Schakel Asn residuen voorspeld dat de haven van N-gebonden glycanen, of met behulp van mutant cellijnen (zoals HEK293S), gevolgd door behandeling met endoglycosidases (zoals EndoH) aanzienlijk kristallisatie succes15,21,22te verbeteren. In dit protocol bespreken we de zuivering van oplosbare glycoproteïnen en Fabs die worden uitgescheiden in de cel bezinken. Glycoproteïne secretie biedt een relatief eenvoudige route naar zuiverheid, zonder de noodzaak voor lysis van de cel of de toevoeging van agressieve chemicaliën of schoonmaakmiddelen. De cel supernatant, verkregen volgende cel oogsten wordt vervolgens direct boven een kolom die affiniteit voor de proteïne van belang (b.v., Ni-NTA voor zijn-gelabeld glycoproteïnen of LC affiniteit voor Fab-fragmenten heeft) uitgevoerd. Echter, afhankelijk van de kolom van het gebruik en de voorwaarden van de cel supernatant (bijvoorbeeld pH), het bindend vermogen van het eiwit van belang zijn voor de kolom kan worden beïnvloed. Als dit het geval is, wellicht te concentreren en buffer uitwisseling de cel supernatant ter verbetering van de binding aan de kolom. Bovendien is het sterk aanbevolen dat de kwaliteitscontrole stappen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd aangewend worden om te helpen beoordelen van eiwit zuiverheid. Een SDS-pagina gel of de westelijke vlek van alle monsters (vóór, tijdens en na de zuivering stappen) uitvoeren kan opleveren inzicht of de zuivering van de voorgestelde regeling geschikt voor de proteïne van belang is. Contaminerende bands zijn zichtbaar op SDS-pagina, of als verschillende soorten worden verkregen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd (bijvoorbeeld diverse toppen op grootte uitsluiting), extra zuivering stappen moet worden overwogen, bijvoorbeeld ionenwisselingschromatografie, om te krijgen in zuiverheid en verhoging van de kans op downstream kristallisatie80.
Voor macromoleculaire kristallisatie is het vaak essentieel zijn voor het verkrijgen van hoge opbrengsten van de proteïne van belang te voorzien in de screening van een groot aantal potentiële kristallisatie voorwaarden bij eiwitrijk concentraties te vinden van de geschikte crystal hits. In het algemeen de HEK293 cellijnen hier besproken (HEK293F en HEK293S) zijn robuuste expressiesystemen, en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald naar produceren meer monster als dit nodig is. Het is echter mogelijk dat de proteïne van belang niet voldoende binnen deze cellijnen uiten kan. In deze gevallen, andere cellijnen, zoals Expi293 cellen81,82, zodat superieure niveaus van eiwit expressie zijn bevonden en moeten worden beschouwd als een alternatief.
Als welgeordende, buigingsinrichting kristallen niet na testen van verschillende constructies van de proteïne van belang ondanks hoge zuiverheid verkregen zijn, is het mogelijk dat het nodig is om uit te breiden van kristallisatie technieken ter bevordering van de vorming van kristallen. Het is gebleken dat Fab fragmenten van antilichamen en nanobodies uitstekende kristallisatie versterkers, en bevordering van welgeordende crystal verpakking83,84,85. Deze fragmenten kunnen worden uitgedrukt en gezuiverd tot homogeniteit en gebruikt in een complex met de proteïne van belang ter bevordering van kristallisatie. Fab fragmenten geproduceerd zoals beschreven in sectie 10 kunnen nog belangrijker is, hebben de neiging om vormen van niet-functionele LC Dimeren86. Deze Dimeren verontreinigingen zijn en moeten worden verwijderd tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. In onze ervaring, LC Dimeren vaak hebben een verschillende retentievolume op uitsluiting van de grootte, of Elueer als een duidelijke piek op ionenwisselingschromatografie, en dus kunnen worden verwijderd uit de Fab reiniging - maar dit niet altijd het geval is. Als deze technieken niet volstaan om LC Dimeren van de Fab zuivering, kunnen extra zuivering methoden, zoals de zuivering van de affiniteit van eiwit G, worden toegepast ter verbetering van de zuiverheid.
Alternatief voor co-complexvorming met Fab-fragmenten, goed gedocumenteerde technieken zoals willekeurige matrix microseeding kunnen het verbeteren van kansen op het verkrijgen van welgeordende kristallen63,70. Deze methode omvat de toevoeging van kleine hoeveelheden verpletterd, suboptimaal kristallen in de kristallisatie conditie, een kristal mononucleate ter bevordering van kristalgroei te verstrekken. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van de kristallen van de proteïne van belang, of degenen met soortgelijke domein architectuur en tertiaire structuur. Bovendien kan willekeurige matrix microseeding worden uitgevoerd in de pogingen om het kristalliseren van het eiwit alleen, of in complex met een Fab fragment of kleine molecule van belang. Recente vooruitgang in cryo-elektronenmicroscopie maken deze techniek ook een aantrekkelijk alternatief voor röntgendiffractie voor het verkrijgen van hoge-resolutie structuurgegevens voor moleculen met passende functies87,88, 89,90,91.
Wanneer van de heer fasering van röntgendiffractie datasets mislukt, kan HA inweken nodig zijn de fase-probleem op te lossen door abnormale dispersie of isomorfe vervanging. Inspectie van de aminozuur-reeks van het eiwit kan voorzien HA bewerking, met inbegrip van optimale pH voor bindende aanwijzingen over de strategie. In het bijzonder kunnen ongepaarde cysteines binnen het eiwit specifiek binden HA verbindingen die kwik bevatten. Inweken van inheemse kristallen met HA verbindingen is een iteratief proces om te bepalen van de identiteit van de optimale HA compound, de concentratie en de vereiste incubatietijd. Als eerste inweken pogingen niet goed diffracting kristallen met een geschikt voor geleidelijke HA opbrengst doen, wellicht om aminozuur vervangingen ter verbetering van de kans op HA bindende en abnormale signaal verbeteren. Voorbeelden zijn mutaties tot een gratis cysteine residu als u efficiënt afhankelijk maken van Hg, Au, Pt of Pb. weergave van de eiwitten voor abnormale phasing-in de media van een seleno-methionine aangevuld bij E. coli uitgebreid voor afwijkende fasering gebruikt is, echter een gelijkwaardig systeem waarin betrouwbaar seleno-methionine is niet beschikbaar voor zoogdiercellen in schorsing92,93, en is een gebied van toekomstige ontwikkeling.
Zodra de unliganded structuur van de glycoproteïne van belang is verkregen, kan de kristallen met klein molecuul liganden inweken worden uitgevoerd om te verkrijgen van een structuur van het immuun receptor-ligand-complex. Deze gegevens geven een blauwdruk voor het rationele ontwerp van meer specifieke en hoge-affiniteit liganden die kan worden gebruikt als kleine-molecuul therapeutics evenals biedt hoge resolutie inzichten in de biologische functie van de glycoproteïne. Wanneer u probeert om te genieten van glycoproteïne kristallen met klein molecuul liganden van belang, kunt inspectie van de kristalstructuur unliganded aangeven of het inweken mogelijk moet zijn. Als sluit crystal-verpakking contactpersonen worden gevonden rond de ligand-bindende plaats of rond gebieden moeten ondergaan conformationele veranderingen op ligand bindend, inweken zal waarschijnlijk worden problematisch. In dit geval moeten andere methoden zoals co-kristallisatie van het eiwit-ligand-complex worden uitgevoerd.

Oppervlakte eiwitten spelen een kritieke rol in de cellulaire functie. Door hun extracellulaire domeinen, kunnen deze membraaneiwitten moduleren cel interacties, hechting, vervoer en signalering van1,2. De extracellulaire lokalisatie van deze proteïnen maakt hen aantrekkelijk doelstellingen voor de ontwikkeling van therapieën voor de behandeling van een breed scala aan ziekten, waaronder kanker en auto-immune ziekten3,4,5 , 6 , 7. een van de meest voorkomende plooien van menselijke membraan eiwit ectodomains is de immunoglobuline-achtig (Ig) vouw, die wordt gevormd door zeven of meer β-strengen gerangschikt in twee β-sheets8,9. Ig-bevattende glycoproteïnen zijn meestal meerdere domeinstructuren met Ig domeinen sequentieel zijn gerangschikt op het extracellulaire gedeelte van het membraan eiwit10. Posttranslationele modificaties van deze cel-oppervlakte-proteïnen, met name N - en O-gebonden glycosylatie, hebben aangetoond dat het spelen een essentiële rol in hun verordening, vouwen, secretie en functie11. Ter verbetering van ons begrip van hun functie en beter ontwerp therapeutics die hen kan richten, technieken vereist zijn waarmee voor hun gedetailleerde moleculaire karakterisering. Hier presenteren we een combinatie van technieken die het mogelijk voor de biofysische maken (biolayer interferometrie (BLI) en isothermische titratie calorimetrie (ITC)) en structuur (röntgendiffractie) karakterisering van het extracellulaire domein van de Ig-bevattende membraan glycoproteïnen, alleen en in complex met hun biologisch relevante liganden en therapeutische moleculen (Figuur 1).
N-gebonden glycosylatie is één van de meest voorkomende wijzigingen na vertaling op eiwitten van zoogdieren, en treedt op tijdens de rijping van de eiwitten in het endoplasmatisch reticulum en het Golgi12,13. Cellijnen, zoals menselijke embryonale nier (HEK) 293 cellen, zijn ontwikkeld voor de recombinante expressie van grote hoeveelheden geglycosyleerde zoogdieren eiwitten14,15. Deze cellijn is ontwikkeld in een indeling van de schorsing, die het mogelijk voor het gemak maakt van schaalvergroting van de productie van eiwitten om grotere hoeveelheden in vergelijking met aanhangend cellijnen. Hier, gebruiken we twee HEK293 cellijnen: HEK293F en HEK293 Gnt ik- / - (HEK293S), die onderling verschillen door het ontbreken van N-acetylglucosaminyl transferase ik (Gnt ik) in het laatste. Op zijn beurt, productie van complexe glycanen (zoals gezien in HEK293F) is niet mogelijk, en in plaats daarvan hoge mannose-type glycanen (overwegend Man5GlcNAc2) bevinden zich glycan N-linked sites18,19,20 . Met behulp van deze twee cellijnen parallel kunt bestuderen van het effect van glycan grootte en ingewikkeldheid op biologische functie en therapeutische targeting. Inderdaad, glycoproteïnen geproduceerd in HEK293F cellen zal hebben grotere, complexere glycanen ten opzichte van de dezelfde glycoproteïne dat wordt geproduceerd in de HEK293S cellen. Glycoproteïnen geproduceerd in de HEK293S cellen zijn meer vatbaar voor kristallisatie, vanwege de verminderde chemische en conformationele heterogeniteit van hun N-gebonden glycanen. Om het crystallizability verder te verbeteren, glycoproteïnen in HEK293S (maar niet HEK293F) cellen geproduceerd kunnen worden behandeld met het enzym endoglycosidase H (Endo-H), wat in de splitsing van hoge mannose glycanen zodanig resulteert dat slechts een enkele N-acetylglucosamine (GlcNAc) deel daarvan blijft op elke N-gebonden glycosylatie site21,22. Andere methoden kunnen ook worden gebruikt om te beperken van N-glycan verwerking binnen de cellen, zoals de toevoeging van glycosyltransferase remmers tijdens glycoproteïne expressie, met inbegrip van kifunensine23. Alternatieve benaderingen omvatten de expressie van inheemse glycoproteïnen (in HEK293F cellen), gevolgd door enzymatische deglycosylation met behulp van peptide N-glycosidase F (PNGaseF). Echter de deglycosylation met PNGaseF is aangetoond dat minder effectief onder inheemse voorwaarden en verhogingen aggregatie in sommige eiwitten; in gevallen wanneer het eiwit oplosbaar na de behandeling blijft, verwerft het negatieve ladingen op het oppervlak als gevolg van de deamidation van het residu asparagine asparaginezuur24, die misschien wel schadelijk voor de kristallisatie. Voorspelde N-glycosylation sites kunnen ook worden gemuteerd, meestal voor alanine of glutamine residuen, ter voorkoming van N-gebonden glycosylatie op deze sites en voor het genereren van glycoproteïne monsters van het hoge homogeniteit. U kunt ook kunnen glycoproteïnen worden geproduceerd in andere eukaryotische cel-culturen, met inbegrip van gist, insect, en plant systemen of andere zoogdieren cellijnen zoals Chinese hamster ovariële (CHO) cellen16,17.
Veel zoogdieren expressievectoren, met inbegrip van pHLsec, zorgen voor de afscheiding van recombinante glycoproteïne ectodomains in de cel middellange25. Secretie van glycoproteïnen van HEK293 cellen zorgt voor snelle en gemakkelijke reiniging zonder de noodzaak voor lysis van de cel. Toevoeging van zuivering tags (bijvoorbeeld zijn-tag, Strep-tag, vlag-tag, Myc-tag, HA-tag) aan de N- of C-terminus van het doel kunt glycoproteïne zuivering door een-voor-stapmodus affiniteitchromatografie. Vervolgens kan grootte uitsluiting chromatografie worden gebruikt om de opbrengst van een monodispers monster voor biofysische en structurele karakterisering.
Een zeer zuivere en homogene glycoproteïne steekproef onder passende omstandigheden kan leiden tot goed diffracting kristallen. Zodra een volledige röntgendiffractie dataset is verkregen van dergelijke kristallen, moeten eerste fasen worden vastgesteld voor de berekening van de dichtheid van de elektronen van de glycoproteïne. Dankzij een steeds groeiend aantal structuren in de Protein Data Bank (PDB), is de meest gebruikte methode voor geleidelijke veruit moleculaire vervanging (MR), die gebruik maakt van een verwante eiwitstructuur te verkrijgen van de eerste fasen26geworden. Wanneer MIJNHEER niet oplossen van het probleem van de fase, zoals af en toe het geval is voor multi-Ig domein glycoproteïnen27,28,29, zijn alternatieve methoden echter vereist. In dit artikel detailleren wij een methode kristallen met zware atomen (HA) weken afbouwen, die nodig was voor het oplossen van de structuur van de CD22 ectodomain28. Het identificeren van het recht HA voor geleidelijke afschaffing is een iteratief proces dat afhangt van de HA reactiviteit, beschikbaar atomen in de glycoproteïne in een bepaalde kristalrooster en de kristallisatie oplossing30,31. Als alternatief, natuurlijke zwavel atomen in cysteïne en methionine residuen kunnen worden gebruikt voor de geleidelijke als aanwezig zijn bij een hoog genoeg verhouding aan andere atomen in de glycoproteïne en röntgendiffractie gegevens kunnen worden verzameld met hoog genoeg redundantie32, 33.
De biologische functie van membraan glycoproteïnen is vaak gemedieerd door eiwit-eiwitinteractie of eiwit-ligand interacties, zoals met koolhydraten. Als het ligand klein genoeg om te verspreiden van de oplossing naar de site van de bindende glycoproteïne in het kristalrooster is, kan inweken experimenten succesvol te verkrijgen van een glycoproteïne-ligand co kristalstructuur ligand erkenning beter te begrijpen zijn.
De protocollen die hier gepresenteerd zijn ook relevant voor het begrijpen van de interacties van oppervlakte glycoproteïnen met synthetische therapeutische liganden34,35 en antilichaam therapeutics36,37. Wanneer gecombineerd met structurele informatie, kunnen bindende kinetiek en thermodynamica krachtige te begrijpen en verbeteren van hun mechanismen van actie. Een techniek die het mogelijk maakt voor de kinetische analyse van therapeutische antistoffen binden aan een glycoproteïne is BLI38,39. BLI maakt gebruik van biosensoren met een geïmmobiliseerdet ligand voor het meten van de associatie en dissociatie kinetiek met een bindende partner, uiteindelijk het bepalen van een dissociatie evenwichtsconstante (KD). BLI is een aantrekkelijke aanpak omdat kleine hoeveelheden glycoproteïnen vereist zijn (< 100 µg), experiment tijd is snel (~ 10-15 min per run), en het kan worden geautomatiseerd. ITC is ook handig voor het bestuderen van verwantschappen tussen glycoproteïnen en bindende partners40,41,42,43. Terwijl ITC meer tijd en reagens intensieve is, kan waardevolle informatie worden verkregen met betrekking tot de thermodynamica van de interactie (ΔG, ΔH, ΔS en stoichiometrie). ITC is ook zeer nuttig zijn voor zwakke interacties die vaak geassocieerd met de voorbijgaande binding van oppervlakte glycoproteïnen aan liganden worden studeren. Bovendien kunnen deze technieken worden gebruikt in combinatie om te evalueren van de binding van verschillende constructies en beoordelen van het effect van verschillende N-linked glycoforms verkregen uit te drukken de glycoproteïne in verschillende cellijnen. Uitvoeren van BLI en ITC met glycoproteïnen geproduceerd in HEK293F, HEK293S en behandeld met Endo H bieden een diepgaande blik op de rol van glycanen in biologische activiteit en therapeutische betrokkenheid.
Wij met succes toegepast deze protocollen karakteriseren het extracellulaire domein (ECD) van menselijke CD2228, een glycoproteïne-lid van de sialic-zuur-bindende Ig-achtige lectines (Siglecs) familie die is essentieel voor het behoud van de B-cel homeostase44 . Wij uitgevoerd diepgaande construct ontwerp om kristallisatie en geleidelijk de X-ray dataset door HA inweken met Hg. Wij ook geweekte CD22 kristallen met haar ligand sialic zuur (alpha2-6 sialyllactose) te verkrijgen van een structuur van het immuun receptor-ligand-complex en aldus vastgestelde de blauwdrukken voor het structuur-geleide ontwerp van glycan mimetics45,46. Bovendien, we genereerden de fragment antigeen bindende (Fab) van de anti-CD22 therapeutisch antilichaam epratuzumab - een therapeutische kandidaat momenteel in fase III klinische proeven voor non-Hodgkin lymfoom47- om te bepalen zijn bindende affiniteit door BLI en ITC aan differentieel geglycosyleerde CD22 ECD construeert. Deze studies bleek een cruciale rol voor N-gebonden glycosylatie in de betrokkenheid van de epratuzumab, met mogelijke gevolgen voor de CD22 erkenning op disfunctionele B cellen.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu;m Steritop filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glycobuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Komt met Endo H reagent</td></tr><tr><td>10x Kinetics Buffer</td><td>PALL Fort&eacute;Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL round bottom 96 well block</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm cover slip</td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 well INTELLIPLATE&nbsp; low volume reservior</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA Start&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293F cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Expression medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Hg</td><td>Hampton research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens M1</td><td>Hampton research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens M2</td><td>Hampton research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Pt</td><td>Hampton research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap Affinity Column</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Mercuric chloride</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro shaker</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega centrifugal device</td><td>PALL Life Science</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA biosensors</td><td>PALL Fort&eacute;Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 crystallizaiton robot</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Platinum chloride</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &micro;m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Tantalum bromide cluster</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 Crystallization Screen</td><td>Rigaku Reagents</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24-well with sealant</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;2-6 sialyllactose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteïnen op het oppervlak van cellen spelen een kritieke rol in cellulaire functie, met inbegrip van signalering, hechting en vervoer. Op leukocyten, verscheidene van deze glycoproteïnen bezitten immunoglobulin (Ig) plooien en staan centraal in de immuun erkenning en verordening. Hier presenteren we een platform voor het ontwerp, de expressie en de biofysische karakterisering van de extracellulaire domein van menselijke B-cel receptor CD22. Wij stellen voor dat deze benaderingen gelden in grote lijnen voor de karakterisatie van zoogdieren glycoproteïne ectodomains met Ig domeinen. Twee schorsing menselijke embryonale nier (HEK) cellijnen, HEK293F en HEK293S, worden gebruikt om uit te drukken glycoproteïnen herbergen van complexe en high-mannose glycanen, respectievelijk. Deze recombinante glycoproteïnen met verschillende glycoforms laten onderzoeken van het effect van glycan grootte en samenstelling op ligand binding. We bespreken de protocollen voor het bestuderen van de kinetiek en thermodynamica van glycoproteïne binding aan biologisch relevante liganden en therapeutisch antilichaam kandidaten. Recombinante glycoproteïnen geproduceerd in de HEK293S cellen zijn vatbaar voor kristallisatie te wijten aan glycan homogeniteit, verminderde flexibiliteit en gevoeligheid voor endoglycosidase H behandeling. We presenteren de methoden voor het inweken van glycoproteïne kristallen met zware atomen en kleine moleculen voor fase bepaling en analyse van ligand bindende, respectievelijk. De experimentele protocollen besproken houdt hier belofte voor de karakterisatie van zoogdieren glycoproteïnen inzicht geven in hun functie te onderzoeken van het werkingsmechanisme van therapeutics.

Verschillende constructies van CD22 ECD werden met succes in de pHLsec expressie vector gekloond en overexpressie in zoogdieren HEK293F en HEK293S cellijnen (Figuur 2 en 3A). Alle constructies werden gezuiverd tot grootte homogeniteit door grootte uitsluiting chromatografie en leverde een zeer zuiver voorbeeld voor kristallisatie studies (figuur 3B en 3 C). De CD22-constructie die hebben geleid tot goed diffracting kristallen was d1-d3 moet worden afgekapt (residuen 20-330), met vijf van de zes locaties van de voorspelde N-gebonden glycosylatie van Asn gemuteerd naar Ala (N67A, N112A, N135A, N164A en N231A), geproduceerd in de HEK293S cellen, zodanig dat alleen de site van glycosylatie op positie N101 werd behouden (deze constructie heet CD2220-330, 5A). Kristallen zijn verkregen onder verschillende omstandigheden van de MCSG-1 sparse-matrix scherm, maar de beste kristallen waren van een voorwaarde met 30% (g/v) polyethyleenglycol 4000, 0,2 M lithium chloride en 0,1 M Tris, pH 8,5. Deze inheemse kristallen eiwitkristallen 2.1 Å resolutie; met behulp van de bekende structuren van Ig domeinen van verwante Siglec eiwitten opbrengst oplossingen in heer zoekopdrachten niet.
Phasing informatie verwerven, doorweekt we inheemse kristallen met een panel van HA-verbindingen die Hg, Pt, Os, Ta en Br opgenomen in concentraties variërend van 1-20 mM van HA samengestelde voor een incubatietijd van 5 min tot en met 1 d (Figuur 4). We gecontroleerd kristallen voor veranderingen in de morfologie, en vond dat kristallen met HA samengestelde bij 20 mM gedrenkt resulteerde in de snelle kraken en ontbinding van de kristallen. We bevroor een totaal van 63 kristallen die behouden hun vorm na instellen incubatie tijden die doorweekt met tantaal bromide cluster, platina chloride, kwik acetaat en kwik chloride waren. Kristallen doorweekt met 7 mM kwik chloridevrij voor 30 min toonde afwijkend signaal op een scan van de fluorescentie bij de Canadese licht bron (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) en waarbinnen multi golflengte abnormale dispersie X-ray gegevensverzameling op een honkslag kristal. Deze datasets stond ons op te lossen van de onderbouw van het kwik van CD2220-330, 5A, waaruit bleek een enkele kwik-atoom gebonden aan een vrije cysteïne op positie C308 en uiteindelijk konden we bouwen de structuur van CD2220-330, 5A in de gefaseerde de kaart die van elektronen dichtheid met behulp van AutoBuild78.
Zodra de unliganded structuur was opgelost, waren we geïnteresseerd in het oplossen van de structuur van CD22 gebonden aan haar ligand, alpha2-6 siallylactose. We berekend eerst de affiniteit van de CD22 richting alpha2-6 sialyllactose met behulp van ITC te karakteriseren de bindende thermodynamica van de interactie. We waargenomen een affiniteit van ~ 280 µM en gebruikt deze informatie om te identificeren van een beginconcentratie (~ 100 x KD) van ligand te gebruiken voor het inweken van onze inheemse CD2220-330, 5A kristallen. We de CD2220-330, 5A kristallen met 25 mM siallylactose voor 5 min, 2 h, 14 h, 40 h en 5 d geweekt en gecontroleerd op veranderingen in de morfologie van het kristal. Een totaal van ~ 75 kristallen waren bevroren van verschillende tijdstippen en verzonden aan de CLS synchrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Canada) voor externe gegevensverzameling. Een totaal van zes X-ray datasets werden verzameld uit goed diffracting kristallen. De structuur van elke dataset X-ray werd opgelost door MIJNHEER met behulp van de unliganded CD2220-330, 5A structuur als een eerste Zoek model. De resulterende dichtheid van het elektron voor alle gegevenssets werd vervolgens geïnspecteerd voor positieve dichtheid in de Fo-Fc-kaart die zou overeenkomen met alpha2-6 sialyllactose voor afhankelijk binnen de bindende site van CD22. Opmerkelijk, alle datasets verzameld, zelfs die uit kristallen gedrenkt na slechts 5 min van de incubatietijd, vervatte positieve dichtheid overeenkomt met de ligand in de bindende site. Algemene structuren van de unliganded en de liganded CD22 waren zeer vergelijkbaar met minimale conformationele wijzigingen, die zou kunnen het succes van inweken experimenten met alpha2-6 sialyllactose verklaren.
We volgende gekenmerkt de antigene oppervlak van CD22 erkend door therapeutisch antilichaam epratuzumab in BLI en ITC experimenten (Figuur 5). Kinetiek en thermodynamica profielen van epratuzumab Fab binding aan CD22-constructs met verschillende glycoforms bleek een groeiende affiniteit met CD22 met verminderde N-linked glycan grootte, met maximaal een 14-fold verbetering van affiniteit voor kleinere glycanen (327 nM vs 24 nM in BLI; 188 nM vs 58 nM in ITC). De CD22 N-linked glycan die de toegang van het antilichaam aan de epitoop werd geïdentificeerd door BLI met behulp van single-point mutanten van CD22 en de epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co kristal structuur28op te lossen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figuur 1 . Overzicht van glycoproteïne karakterisering van construct ontwerp voor biofysische en structurele karakterisering. (1) primaire sequentieanalyse van representatieve glycoproteïne. In het grijs, het extracellulaire domein (ECD); in het groen, de transmembrane (TM)-segment; en in het blauw, het cytosolische domein van de glycoproteïne. Voorspelde N-gebonden glycanen worden aangeduid. (2) klonen van ECD constructies. (3) uitdrukking van ECD constructies in zoogdiercellen. (4) glycoproteïne zuivering. Uitgedrukt in HEK293F eiwitten bevatten complexe glycanen, moeten eiwitten, uitgedrukt in HEK293S hoge mannose glycanen. Enzymatische behandeling van glycoproteïnen geproduceerd in HEK293S cellen met Endo H resultaten in glycoproteïnen met alleen een GlcNAc deel daarvan op N-gebonden glycosylatie sites. (5 bis) glycoproteïnen worden getest op hun binding aan antilichamen door biolayer interferometrie (BLI) en isothermische titratie calorimetrie (ITC). Affiniteit met kleine liganden kan ook worden gemeten door het ITC. (5b) kristallisatie proeven van glycoproteïnen met homogene N-gebonden glycanen, zoals die In sommige gevallen, uitgedrukt in HEK293S en deglycosylated met Endo H. (6) Mutatie van N-gebonden glycosylatie sites is noodzakelijk om het verkrijgen van kristallen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figuur 2 . Ontwerp van CD22 ectodomain DNA voor expressie in zoogdiercellen construeert. A) vertegenwoordiging van de plasmide van de pHLsec gebruikt voor voorbijgaande transfectie van CD22 ECD constructies. AgeI en KpnI sites gebruikt voor het klonen worden aangegeven met rode dozen. B) de CD22 ECD bevat zeven Ig domeinen (d1-d7) en 12 voorspelde N-gebonden glycosylatie sites (in blauw). Vier constructies werden ontworpen van de CD22-ECD. C) 1% agarose gel tonen PCR waarbij van CD22 ECD bouwt voor het klonen in de pHLsec zoogdieren expressie vector. Eerste lane bevat 1 kb DNA marker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figuur 3 . Meningsuiting en zuivering van glycoproteïnen. A) Effect van de celdichtheid op expressie opbrengsten. Glycoproteïne expressie in kleinschalige 25 mL cultuur van HEK293F schorsing cellen transfected met behulp van drie verschillende startende dichtheden van cellen (0,5 x 106 cellen mL-11.0 x 106 cellen mL-1en 1.5 x 106 cellen mL -1). Kwantificering uitgevoerd door densitometrie van SDS-pagina in de linker paneel en kwantitatieve BLI in het rechter paneel. Waarden zijn representatief voor een glycoproteïne voorbereiding. B) Chromatogram van de eerste stap van de zuivering voor construeren CD2220-330, 5A van 600 mL van het supernatans dat met behulp van een Ni-NTA affiniteit kolom. De glycoproteïne was geëlueerd met behulp van een helling van imidazool (grijze lijn), waar 100% correspondeert met de elutie buffer, waarin 500 mM imidazool. Gepoolde fracties worden afgebeeld met verticale lijnen. C) grootte-uitsluiting chromatografische voor construeren CD2220-330, 5A met behulp van een high-performance gel filtratie kolom. Gepoolde fracties van de piek van de elutie worden afgebeeld met verticale lijnen. Inzet: Coomassie gebeitste SDS-pagina gel tonen de zuiverheid van de glycoproteïne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figuur 4 . Crystal inweken met zware atomen. A) monster workstation voor het inweken van inheemse kristallen met HA verbindingen. Alle vereiste hulpmiddelen worden aangeduid. B) stappen gevolgd om te genieten van de kristallen van construeren CD2220-330, 5A met HA verbindingen. Stap 1, Open putje met kristallen en overdracht kristallen met behulp van een lus aan een daling van 0,2 µL op een cover slip met HA oplossing verdund in de kristallisatie toestand zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van HA van 1-10 mM varieert. Stap 2, verzegelen van de daling van de kristallisatie plaat en incubeer kristallen met de HA samengestelde voor verschillende perioden. Stap 3, mount het doorweekte kristal in de lus en rug-weken voor 30 s in drie opeenvolgende 0.2 µl druppels met de moeder liquor oplossing aangevuld met 20% (v/v) glycerol afgeleverd op een cover slip. Stap 4, flash bevriezen van het kristal gemonteerd op een lus met vloeibare stikstof en plaatst u deze in een puck voor verzending naar de synchrotron beamline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figuur 5 . Biolayer interferometrie en isotherme titratie calorimetrie metingen. A) vertegenwoordiger BLI experiment. Bovenste paneel: voorbeeld van plaat setup voor een kinetiek experiment, waar de volgende worden aangeduid: 1 x kinetiek buffer (B), zijn6 x-tagged glycoproteïne laden (L), representatieve Fab concentraties (62,5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 mM regeneratie buffer (R), en 1 x kinetiek neutralisatie buffer (B). Elk bevat goed 200 µL van oplossing. Het nummer van de deelactiviteit voor de kinetiek experiment wordt aangegeven bij de bovenkant van de plaat. Midden paneel: Representatieve onbewerkte gegevens van BLI experiment uitgevoerd met behulp van Ni-NTA biosensoren en de plaat die is beschreven in het bovenste deelvenster. Stapnummers overeen met basislijn (1) zijn6 x glycoproteïne laden (2), basislijn (3), vereniging in seriële verdunning van Fab (4) en dissociatie (5). Regeneratie stappen zijn niet vertegenwoordigd (stap 6-7). Onderste paneel: Representatieve geanalyseerde gegevens waaruit ruwe associatie en dissociatie (blauwe lijn) met de corresponderende 1:1 passen (rode lijn). B) bovenste paneel: vertegenwoordiger plaat setup voor een enkele ITC uitgevoerd over een geautomatiseerde ITC instrument met zeven experimenten in een 96-Wells ronde onderkant blok. Elk experiment bestaat uit drie putten. De eerste put (rood) komt overeen met monster voor de cel (400 µL), de tweede put (groen) komt overeen met het monster voor de spuit (120 µL). De derde goed leeg gelaten en de gemengde monsters wordt teruggeleid naar dit goed na voltooiing van het experiment. Experimenten 1, 2 en 7 zijn buffer in buffer besturingselementen. 3-5 experimenten vertegenwoordigen drievoudige expermenteren glycoproteïne (P) in de cel en Fab of ligand (L) in de spuit. Experiment 6 vertegenwoordigt een ligand hitte van verdunning controle en moet worden afgetrokken van de experimenten 3-5 tijdens de gegevensanalyse. Onderste paneel: Representatieve rauwe (boven) en verwerkte (onder) ITC gegevens waaruit Fab (epratuzumab) binden aan CD22 ECD geproduceerd in de HEK293F cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van glycoproteïnen. Het biedt inzicht in de functie van het eiwit, de rol van N-gekoppelde glycosiden en het mechanisme en de werking van antibiotica die zich richten op het glycoproteïne. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden toegepast op elk glycoproteïne van belang.Het vergemakkelijken van de structurele en biofysische karakterisering van een breed scala aan glycoproteïne-doelen. Het demonstreren van deze procedure zal worden uitgevoerd door Hong Cui, een coördinator van onderzoeksprojecten in ons laboratorium. Om te beginnen, bereid en transfecteer cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Verzamel de cellen door centrifugatie bij 6.371 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Bewaar het supernatant en gebruik vervolgens een 0,22 micron filter om het te filteren. Laad het gefilterde supernatant met vier milliliter per minuut op een Ni-NTA kolom in een tafelchromatografiesysteem.Was de kolom daarna met drie tot vier volumes wasbuffer. Verdun het gezuiverde glycoproteïne van de kolom met behulp van een elutiebuffergradiënt, terwijl je fracties verzamelt. Trek de fracties die de elutiepiek bevatten in een centrifugaalfiltratieapparaat met een nominale molecuulgewichtslimiet van 10 kilodalton.Concentreer vervolgens door centrifugeren bij 4.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten of totdat het monster een volume van 500 microliter bereikt. Injecteer het geconcentreerde glycoproteïne in een 500 microliter monsterlus. Laad het glycoproteïne op een voorgeëquilibreerde hoge prestatiegrootte-exclusiekolom op een FPLC-systeem bij vier graden Celsius terwijl je fracties verzamelt.Voer vervolgens een SDS-PAGE-gel uit om te identificeren welke elutiefracties het glycoproteïne bevatten en trek diegene die dat doen. Gebruik een centrifugaalfiltratieapparaat met een nominaal molecuulgewicht van 10 kilodalton om zuiver degelycosyleerd ECD te concentreren bij 4.000 keer G en vier graden Celsius totdat de gewenste concentratie is verkregen. Na het bepalen van de eiwitconcentratie centrifugeer je het monster bij 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om stof en andere verontreinigingen te verwijderen.Voeg vervolgens 80 microliter van de kristallisatieoplossing van een commerciële kristallisatiescreen toe aan elke reservoirput in een 96-well sitting drop kristallisatieplaat. Gebruik een kristallisatierobot om druppels eiwit in de putjes van de kristallisatieplaat te verdelen. Gebruik een totale druppelvolume van 200 nanoliter bij een een-op-een verhouding van gezuiverd eiwit tot kristallisatieoplossing.Verzegeld de plaat daarna met plakband. Breng de verzegelde plaat over naar een plaatbeeldvormer voor inspectie door zichtbaar en ultraviolet licht. Identificeer de omstandigheden die aanvankelijke glycoproteïnekristalkoppen geven en optimaliseer deze kristallen verder zoals beschreven in het tekstprotocol.Cryoprotecteer de kristallen door ze in een oplossing van moedervocht te weken dat is aangevuld met 20% glycerol. Monteer vervolgens de kristallen in CryoLoops. Gebruik vloeibaar stikstof om de gemonteerde kristallen te flashvriezen voorafgaand aan gegevensverzameling.Na het produceren van goed diffracterende kristallen in een 24-well kristallisatieplaat, bereid een voorraadoplossing van 50 millimolar ligand en 20 millimolar Tris bij pH 9,0 met 150 millimolar natriumchloride. Voeg verschillende concentraties van deze ligandoplossing toe aan de eerder bereide druppel die de ECD-kristallen bevat. Verzegeld de druppel voor incubatietijden variërend tussen vijf minuten en vijf dagen.Gebruik een lichtmicroscoop om de kristallen visueel te volgen om eventuele veranderingen in morfologie te identificeren. Na incubatie monteer je de kristallen met behulp van CryoLoops en cryoprotecteer je ze in moedervochtoplossing die is aangevuld met 20% glycerol. Om Bio-Layer Interferometrie te starten, bereid je 50 millimeter 1X Kinetics Buffer voor van 10X Kinetics Buffer zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg 200 microliter van deze buffer toe aan een voorgewekte plaat. Breng zes Ni-NTA biosensoren over naar de plaat en laat ze 10 minuten hydrateren in de buffer. Verdun vervolgens His-getagd ECD in één milliliter 1X Kinetics Buffer tot een eindconcentratie van 25 nanogram per microliter.En bereid seriële verdunningsreeksen van het gezuiverde FAB voor. Aqueate de reagentia in een 96-well microplaat, zoals hier te zien is. Waar B staat voor 1X Kinetics Buffer, L staat voor het laden van His-getagd glycoproteïne, de numerieke invoer vertegenwoordigt de verdunde FAB-concentraties en R staat voor de regeneratiebuffer.Breng de gehydrateerde biosensoren over naar putjes met 1X Kinetics Buffer gedurende 60 seconden om ze te baselinersen. Laad vervolgens glycoproteïne op een concentratie van 25 nanogram per microliter gedurende 240 seconden bij 1.000 RPM. Plaats de biosensoren terug in de putjes met 1X Kinetics Buffer gedurende 60 seconden voor een tweede baseline.Breng de sensoren over naar de putjes met de seriële verdunningsreeksen van FAB gedurende 180 seconden. Na deze associatiefase, breng je de biosensoren terug naar 1X Kinetics Buffer voor een 180 seconden dissociatiestap. Open vervolgens de analysesoftware.Onder tabblad één, importeer en selecteer vervolgens de gegevens. Onder tabblad twee, stap één gegevensselectie, kies sensorselectie. Markeer de referentieputjes, klik vervolgens met de rechtermuisknop om de referentieput te selecteren.In stap twee, subtraktie, selecteer referentieputjes. Hierna, onder stap drie Y-as uitlijnen, selecteer baseline en stel een tijdbereik in van 0,1 seconden tot 59,8 seconden. In stap vier selecteer je inter-stap correctie en lijn uit naar dissociatie.In stap vijf, verwerk Savitzky-Golay Filtering en klik op gegevens verwerken. De poort naar tabblad drie. Onder stap twee analyseren met een een-op-een model, selecteer associatie en dissociatie, selecteer globale fitting en groepeer op

characterization-glycoproteins-with-immunoglobulin-fold-x-ray

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De 3-D structuur van een molecuul zorgt voor een uniek inzicht in hoe het molecuul functies. De belangrijkste methode voor de bepaling van de structuur bijna-atomaire resolutie is X-ray kristallografie. Hier tonen we de huidige methoden voor het verkrijgen van drie-dimensionale kristallen van een bepaalde macromolecuul die geschikt zijn voor de structuur bepaling door X-ray kristallografie.

Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Meer dan de helft van de eiwitten zijn kleine eiwitten (moleculaire massa &lt;200 kDa) die zijn uitdagend voor zowel de elektronenmicroscoop beeldvorming en driedimensionale reconstructies. Geoptimaliseerde negatieve kleuring is een robuuste en high-throughput protocol hoog contrast en relatief hoge resolutie (~ 1 nm) beelden van kleine asymmetrische eiwitten of complexen onder verschillende fysiologische omstandigheden te verkrijgen.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

We beschrijven een kader dat eenvoudige biochemische en computationele analyses combineert om de karakterisering en kristallisatie van grote coiled-coil-domeinen te begeleiden. Dit kader kan worden aangepast voor globulaire eiwitten of worden uitgebreid om een verscheidenheid aan hoogdoorvoertechnieken te integreren.

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Hier beschrijven we methoden die we vaak toepassen in het laboratorium om te bepalen hoe de aard van de interactie tussen het T-celreceptor en tumorantigenen, gepresenteerd door humane leukocytenantigenen, de functionaliteit van T-cellen bepaalt; deze methoden omvatten eiwitproductie, röntgenkristallografie, biofysica en functionele T-celleproeven.

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Leer glycoproteïnen met de immunoglobuline-vouw karakteriseren via röntgendiffractie en biofysische technieken. Deze methode biedt inzicht in eiwitfunctie en interactiedynamica voor structureel biologisch onderzoek.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken (Video) | JoVE Journal

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Meer video's verkennen