Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over teken entomologie te beantwoorden, zoals het beoordelen van de aanwezigheid van levensvatbare bacteriën in de teek, zowel ruimtelijk als tijdelijk. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het geen sectie van de teken of dure apparatuur vereist, en dat het ruimtelijke en temporele visualisatie van gentranscripten mogelijk maakt. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze techniek het moeilijk vinden omdat het meerdere stappen en reagentia omvat.

Deze techniek is echter niet arbeidsintensief. Hoewel het ongeveer drie dagen kan duren om te voltooien, is de fysieke tijd slechts een paar uur per dag. Ter voorbereiding, voer de verzamelde teken gedurende 48 tot 72 uur voor de darmcollectie.

Om de darm van de teek te dissekeren, voeg 20 tot 30 microliter MEMFA-oplossing toe aan een schone glazen plaat. Plaats vervolgens de teek in de MEMFA en pas de focus aan op het hoofd van de teek. Gebruik nu een paar steriele hoge koolstofstaal scheermessen om het hoofdgebied bij het scutum af te snijden en laat het lichaam van de teek intact.

Druk vervolgens voorzichtig op het lichaam om de darmdiverticulaire en speekselklieren uit de lichaamscuticula te duwen. Scheid ze vervolgens voorzichtig van de speekselklieren zonder de darmen te beschadigen en schep de snijwonden voorzichtig op een scheermes. Verzamel alle geoogste darmen in een buis van 1,5 milliliter in 500 micrometer MEMFA.

Breng vervolgens de buis gedurende één uur op kamertemperatuur onder zacht schudden. De volgende dag dehydrateer het weefsel zoals aangegeven in het tekstprotocol en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Om een mazenmandje voor te bereiden, gebruik eerst een verwarmd enkelbladig mes op een scalpel om de bodem van een twee milliliter of vijf milliliter snap-top centrifugebuis af te snijden.

Het mes moet mogelijk meerdere keren opnieuw worden verwarmd voordat de snede is voltooid. Snijd vervolgens een vierkant van een 110 micron nylon gaas dat iets groter is dan de nieuwe openingen. Verbind vervolgens het gaas met de opening door de buis lichtjes in het gaas te drukken op een hotplate ingesteld op medium/lage warmte tot een goede sijp is gemaakt.

Nadat het is afgekoeld, snijd het overtollige gaas af en zorg ervoor dat er geen gaten zijn. Maak er 24 van deze manden om te passen op een 24-wellplaat. Snijd vervolgens gaten in de deksel van een 24-wellplaat, zodat de rand van het steekproefmandje het gat zal grijpen en niet erdoor valt.

Wanneer voltooid, moeten de geassembleerde steekproefmanden helemaal in de putjes zitten. Gebruik nu deze passende mandhouder om manden van de ene plaat naar de andere over te brengen met relatieve gemak gedurende de in situ hybridisatie. Gebruik twee van dergelijke platen zodat terwijl de steekproef in één wordt geïncubeerd, de andere kan worden voorbereid voor de volgende wasbeurt.

Deze sectie behandelt bepaalde stappen van de in situ hybridisatie. Zie het tekstprotocol voor een volledige beschrijving. Om te beginnen, breng elk gefixeerd weefselmonster over naar een gelabelde steekproefmand.

Organiseer de plaat op basis van experimentele omstandigheden en kleurt minstens vijf darmen per voorwaarde. Hydrateer eerst de monsters voorzichtig. Vermijd het inbrengen van luchtbellen door geleidelijk de verhouding van PBS-T tot ethanol in elke wassing te verhogen.

Gedurende de eerste dag, na de tweedurende pre-hybridisatie stap, in plaats van de hybridisatie buffer weg te gooien, bewaar het voor toekomstig gebruik tijdens de test. Wanneer u de monsters later behandelt met sonde hybridisatieoplossing, bedek de plaat goed met aluminiumfolie om verdamping van de oplossing te voorkomen. Op de tweede dag, laad de gereserveerde hybridisatiebuffer in de 24-wellplaat en verwarm de plaat op tot 60 graden Celsius.

Later die dag, om alle sporen van sonde en hybridisatiebuffer te verwijderen, was de monsters twee keer gedurende drie minuten per wassing met 2x SSC. Was de monsters vervolgens drie keer met 2x SSC gedurende 20 minuten per wassing bij 60 graden Celsius. Bereid vervolgens het primaire antilichaam in blokkeerbuffer voor.

Laad 500 microliter van deze mengsel in elke put. Na de blokkeerstap, incubeer bij kamertemperatuur gedurende ongeveer vier uur of bij vier graden Celsius overnacht. Op de derde dag voer de kleurreactie uit in chromogeen substraat.

Dek de steekproefplaat af met aluminiumfolie. En tijdens de reactie, controleer regelmatig op overkleuring met de dissectie microscoop. Op de vierde dag is het belangrijk om te incuberen en bleken op een lichtbox, omdat dit pigmentatie in de monsters of kleuring van Bouin's oplossing kan verwijderen, en verbetert het sondesignaal voor duidelijke visualisatie.

Na het wassen met SSC, verplaats zorgvuldig de darmmonsters door de mand om te keren in een nieuwe 24-wellplaat. Terwijl in de putjes, spoel de manden grondig af met 70%ethanol. Ga vervolgens verder met het beeldvormen van de monsters.

Het is van cruciaal belang om de kwaliteit van de RNA-sondes te schatten voordat u ze gebruikt. De sondes kunnen worden gecontroleerd op een formaldehydegel. Als ze eruitzien als heldere, discrete banden, zijn ze van goede kwaliteit.

Bij het kleuren is enige variatie in verdeling normaal tussen biologische replica's en tussen de zeven paar diverticula van individuele darmen. Daarom is het het beste om minstens vijf darmen per voorwaarde te kleuren om een idee te krijgen van het gemiddelde kleuringspatroon. De algehele succes is het beste beoordeeld door de kleuring van zin en antizin monsters voor elke voorwaarde te vergelijken.

Beide moeten gedurende dezelfde hoeveelheid tijd worden ontwikkeld. De zin monsters zouden minimaal tot geen paarse kleur moeten hebben, terwijl de antizin monsters robuuste kleuring moeten vertonen met minimale achtergrond. Kritisch is dat de weefsels volledig in de kleur moeten zijn ondergedompeld