Name: Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Leer hoe u lactaatdehydrogenase-activiteit rechtstreeks in weefsels kunt detecteren met behulp van NAD(P)H-genererende enzymen. Deze methode maakt nauwkeurige ruimtelijke mapping van metabole activiteit in biologische monsters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HAC was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan HAC van nationale Instituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM081686, R01 AR070245, Rijksinstituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM0866465, de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek ( Rose heuvels en Hal Gaba awards), de Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, de maatschappij van de leukemie lymfoom, Impact awards van de Jonsson uitgebreide Cancer Center WEL te HAC. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P50CA092131. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. HAC is een lid van de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de UCLA moleculaire biologie-instituut en het UCLA Bioinformatics interdepartementale programma.

Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Californië, Los Angeles.
1. het genereren van dia's van bevroren muis huid
<ol><li>Euthanaseren muizen overeenkomstig het beleid van de instelling. Opmerking: Volg institutioneel beleid voor beschermende kleding. Alle protocollen waarbij dieren moeten worden goedgekeurd door de Commissie voor de institutionele zorg van dier.</li>
	<li>Verwijderen van de muis haar met een dierlijke tondeuse.</li>
	<li>Maak incisies in de huid met behulp van schaar. Met behulp van Tang, til de huid uit de buurt van de muis. Met behulp van schaar, het gedeelte van de huid weggesneden.</li>
	<li>Vul de cryomold met bevriezing reagens samengestelde (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Plaats huid secties in gevulde cryomolds met behulp van naald-nosed tang. Oriënteren huid zodat weefsel segmenten een dwarsdoorsnede van de huid van de epidermis de dermis en de hypodermis spier (Figuur 2 genereert). Opmerking: indien mogelijk mount experimentele en controle van muizen samen in de zelfde cryomold zodat ze kunnen worden gesegmenteerd op dezelfde dia en samen verwerkt. Wees voorzichtig niet te maken van de bubbels.</li>
	<li>Plaats cryomold op het vlakke oppervlak van een blok van droog ijs in een ijsemmer en laat bevriezen. Blijven observeren van de oriëntatie van de huid. Pas indien nodig. Opmerking: Cryogene handschoenen dragen bij de behandeling van droog ijs.</li>
	<li>Pipetteer cryomolds in een vriezer-80 ° C voor opslag. Monsters kunnen worden gehandhaafd in de vriezer voor ongeveer 3 maanden zonder een significant verlies van enzymatische activiteit. Laat niet bevroren secties uitdrogen.</li>
	<li>Met behulp van een cryostaat bij-20 ° C, segment weefsel maken secties 7-10 µm dik voor de beste huid morfologie21.</li>
</ol>2. voorbereiding van de dia's van de kleuring
<ol><li>Stellen het aantal dia's die moeten worden getest. Omvatten een besturingselement dia waarop NAD zal worden ingehouden en een ander besturingselement dia waarop het substraat, lactaat, zal worden ingehouden. Omvatten een positieve controle dia uit een blok van de bevroren weefsel eerder onderzocht.</li>
	<li>Kort vast dia's met huid secties met 4% formaline voor 5 min hetzij door pipetting 1 mL 4% formaline in de dia verschijnt of bij de verwerking van meerdere dia's, door dompelen van dia's in een container met 4% formaline. Opmerking: De fixatie zorgt dat de huid doet niet schil af uit de dia's gedurende de volgende procedures en behouden de morfologie van de huid. Let op: Formaline is een kankerverwekkende stof en gevaarlijke; Draag handschoenen, laat niet het raken van uw huid en het uitvoeren van deze stap in een chemische zuurkast.</li>
	<li>Wassen dia's met ten minste 1 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4, per dia door pipetteren of dompelen.</li>
</ol>3. voorbereiding van de kleurstofoplossing
<ol><li>Vortex samen reagentia voor lactaat dehydrogenase activiteit kleuring (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium blauwe chloride en 30 mM lactaat) in een gepaste afmetingen buis afhankelijk van de hoeveelheid vlekken oplossing vereist. Opmerking: 1 mL is voldoende voor één dia volledig.</li>
	<li>Bereid een tweede oplossing waarin alle reagentia behalve NAD aanwezig zijn. Bereid een derde oplossing waarin alle reagentia behalve lactaat aanwezig zijn.</li>
</ol>4. Incubeer dia's in de kleurstofoplossing
<ol><li>Pipet zachtjes de kleurstofoplossing of besturingsoplossingen in de voorbereide dia's die betrekking hebben op het gedeelte in zijn geheel (1 mL is voldoende voor één dia). Als u meerdere dia's samen worden verwerkt, dompel u alle dia's in de kleurstofoplossing tegelijkertijd (zorg ervoor dat de container heeft genoeg oplossing voor het volledig bedekt de weefselsectie).</li>
	<li>Incubeer de dia's in een bevochtigde omgeving bij 37 ° C in het donker. Als kleurstofoplossing boven de dia wordt weergegeven, plaatst u de dia in een bevochtigde omgeving ter voorkoming van verdamping.</li>
</ol>5. toezicht op de dia 's
<ol><li>Toezicht op de omzetting van de kleurstofoplossing van duidelijk blauw door visuele inspectie. Wanneer de monsters hebt bereikt het gewenste niveau van blauwheid, zet de reactie stop doordat de kleurstofoplossing. Opmerking: Voor de huid, 10 min is voldoende. De tijd hangt af van het orgel en de enzymatische activiteit.</li>
	<li>Dia's met fosfaat gebufferde zoutoplossing te spoelen door pipetteren (1 mL is voldoende voor elke dia) of dompelen. Opmerking: Alle monsters die moeten worden vergeleken aan elkaar moeten worden gehandhaafd in kleurstofoplossing voor de zelfde hoeveelheid tijd.</li>
</ol>6. counterstain en monteren
<ol><li>Pipetteer een counterstain in de dia's wanneer de dia's een passend niveau van blauwheid hebt bereikt. Opmerking: Counterstains die de kernen rode of groene zorgt voor goed contrast met de blauwe gemaakt door de formazan precipitant.</li>
	<li>Monteren met waterige of niet-waterig medium22montage. Één tot drie druppels (40-50 µL) montage medium is voldoende is afhankelijk van de grootte van de cover slip.</li>
</ol>7. het beeld van dia's en kwantificeren
<ol><li>Dia's voor een afbeelding onder een lichte Microscoop. Neem foto's van experimentele en controlemonsters en alle negatieve controles op 10 X, 20 X en 40 X vergroting.</li>
	<li>Het bepalen van de intensiteit van de blauwe vlek in verschillende regio's met de software van de analyse van de afbeelding.</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
<li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrazolium-formazan+system%3A+Design+and+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li>
<li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Noorden%2C+CJF+%22Enzyme+Histochemistry%3A+A+Laboratory+Manual+of+Current+Methods%22">Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods</a>. , Bios. (1992).</li>
<li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li>
<li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482(2016).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer%3A+A+systematic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li>
<li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li>
<li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A%3A+Therapeutic+potential+in+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li>
<li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+gene%3A+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li>
<li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li>
<li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li>
<li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH%2FNAD%28%2B%29+redox+homeostasis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li>
<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li>
<li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li>
<li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+%5B1-%281%29%283%29C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).</li>
<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).</li>
<li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.

De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de activiteit van lactaat dehydrogenase of andere metabole enzymen die resulteren in NADH of NADPH, verschillende soorten cellen binnen een weefsel of binnen verschillende gedeelten van een weefsel na verloop van tijd te controleren. Lactaat dehydrogenase is een belangrijk enzym voor het begrip van de biologie van stamcellen en tumoren, en de mogelijkheid om lactaat dehydrogenase activiteit in afzonderlijke cellen te controleren is waarschijnlijk belangrijk inzicht verwer...

Inzicht in de locaties binnen weefsels waarin enzymen hoge of lage activiteit hebben is essentieel voor de ontwikkeling van het begrip en fysiologie. Transcript of proteïne niveaus worden vaak gebruikt als surrogaten voor enzymatische activiteit. Hoewel dergelijke studies kunnen informatief, bieden ze geen gegevens die cruciaal worden kan voor het bepalen van een enzymactiviteit, zoals posttranslationele modificaties, de aanwezigheid van eiwitcomplexen, of van het enzym subcellular localisatie. Enzymatische activiteit rechtstreeks wordt gemeten, is het vaak gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysates die niet langer informatie over individuele cellen binnen het mengsel of de ruimtelijke spreiding van de cellen met hoge of lage activiteit binnen een weefsel bevatten.
Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit binnen een weefsel monster. De methodologie is gebaseerd op eerdere onderzoeken die aantonen dat tetrazolium zouten kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van de activiteit van dehydrogenases, reductases en oxidasen in bevroren weefsel1. Met deze methoden wordt een water onoplosbare formazan gevormd wanneer protonen worden overgedragen aan een tetrazolium zout2,3. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase genereert NADPH en een proton en met tetrazolium activiteit is geconstateerd. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase heeft gevolgd in Europese bot hepatocyten4, in alveolaire type 2 cellen van de longen5 en nephrons van de nier-5. Tetrazolium zouten zijn ook gebruikt om transketolase activiteit in bevroren weefsel6te controleren. Een soortgelijke aanpak werd onlangs gebruikt om de activiteit van meerdere dehydrogenases in de dezelfde weefsel op aangrenzende dia's7te controleren.
Hier beschrijven we een methode om met behulp van tetrazolium zouten te controleren van de ruimtelijke spreiding van lactaat dehydrogenase activiteit (Figuur 1). Lactaat dehydrogenase kunt converteren pyruvaat gegenereerd door glycolyse te lactaat en de omgekeerde reactie. Lactaat dehydrogenase activiteit is bijgevolg een belangrijke determinant van pyruvaat de ingang in de tricarboxylic acid cyclus versus de secretie zoals lactaat. Lactaat niveaus in het bloed worden vaak gebruikt voor de diagnose van een aantal ziekten, waaronder kanker8,9,10, omdat het kan signaal dat ziekte of letsel heeft beschadigde cellen en het enzym is vrijgegeven.
Er zijn vier lactaat dehydrogenase genen: LDHA, LDHB, LDHC en LDHD11. LDHA en LDHB worden verondersteld te zijn ontstaan uit een vroege LDHA gen12dubbel. LDH is actief als een tetrameer en LDHA en LDHB kan homotetramers en heterotetramers met elkaar. LDHA wordt gemeld te hebben hogere affiniteit voor pyruvaat, terwijl LDHB aan hebben hogere affiniteit voor lactaat, en bij voorkeur converteren lactaat en pyruvaat13is gemeld. De promotor LDHA bevat bandplaatsen voor de HIF1α, cMYC en FOXM1 transcriptie factoren11. Bovendien, zoals vele andere glycolytic enzymen14,15, kan LDH worden gewijzigd door posttranslationele modificaties. Fibroblast groeifactor receptor 1 kan LDHA Y10, die bevordert tetrameer vorming, of Y83, die bevordert NADH substraat bindende16phosphorylate. Ook kan LDHA geacetyleerd17. Om deze redenen vereist een compleet begrip van LDH activiteit controle niet alleen LDH eiwitniveaus, maar van het enzym activiteit ook.
Naast de methode die we hier presenteren, zijn andere benaderingen gebruikt om lactaat dehydrogenase activiteit te controleren. Lactaat dehydrogenase activiteit kan spectrophotometrically worden gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysate. De generatie van NADH zoals lactaat wordt geconverteerd naar pyruvaat kan worden gemeten op basis van de absorptie bij 340 nm, terwijl de verdwijning van NADH kan worden gecontroleerd dat pyruvaat naar lactaat18is geconverteerd. Lactaat dehydrogenase activiteit heeft ook gevolgd met magnetische resonantie beeldvorming (MRI). 13 C-pyruvaat kan worden beheerd en de omzetting van pyruvaat naar lactaat kan worden gecontroleerd als de verhouding tussen [1 -13C] lactaat / [1 -13C] pyruvaat. Verhoogde ratio's van [1 -13C] lactaat / [1 -13C] pyruvaat zijn waargenomen in kanker weefsel19. Terwijl de MRI-gebaseerde benaderingen kunnen informatie geven over lactaat dehydrogenase activiteit in normale en ziekte weefsels, hebben de methoden niet de resolutie nodig voor het bepalen van het niveau van de activiteit in specifieke cellen. De methodologie die hier geboden kan informatie verstrekken over lactaat dehydrogenase activiteit in weefsel gebieden en zelfs in afzonderlijke cellen.
Met behulp van in situ activiteit testen, vonden we dat de activiteit van lactaat dehydrogenase hoog in de haarfollikel cellen van de stam van muis huid20 is. Wij ook gebruikt de methode aan de activiteiten van lactaat dehydrogenase in gekweekte embryonale stamcellen controleren en vond dat de activiteit is hoger in de cellen van de stam dan de feeder laag. Tenslotte, wij gecontroleerd van de activiteit van lactaat dehydrogenase in verse muis aorta en waargenomen vlekken in de zachte spiercellen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in bevroren muis huid.

<table><tbody><tr><td>Chirurgische instrumenten</td><td></td><td></td><td>Voor het verzamelen van huid van geëuthanaseerde muizen</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>Voor het bevriezen van muizenhuid</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>Voor het monteren van cryomolds</td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Droogig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysine Adhesion Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% formaline</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>Verdund in water</td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Fenazine methosulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazoliumblauwchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumbotery L-lactaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substraat</td></tr><tr><td>37&deg;C incubator (of weefselkweekincubator)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliaanse tegenkleuring</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Tegenkleuring</td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes voor glijmiddel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

toewijzing metabolisme: bewakingsactiviteit lactaat dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Toewijzen van enzymatische activiteit in ruimte en tijd is van cruciaal belang voor het begrip van de moleculaire basis van cel gedrag in normale weefsels en ziekte. In situ metabole activiteit testen kunnen informatie geven over de ruimtelijke spreiding van de metabole activiteit binnen een weefsel. Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toezicht op de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase rechtstreeks in weefselmonsters. Lactaat dehydrogenase is een belangrijke determinant van of verbruikte glucose worden geconverteerd naar energie via aerobe of anaerobe glycolyse. Een oplossing met lactaat en NAD wordt verstrekt aan een bevroren weefselsectie. Cellen met hoge lactaat dehydrogenase activiteit zal omzetten in de meegeleverde lactaat pyruvaat, terwijl tegelijkertijd converteren verstrekt nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) NADH en een proton, die kan worden opgespoord op basis van de vermindering van de nitrotetrazolium blauwe naar formazan, die wordt weergegeven als een blauwe neerslag. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in muis huid. Toepassing van dit protocol, vonden we dat lactaat dehydrogenase activiteit hoog in de cellen van de stam van het sluimerende haarfollikel in de huid is. Toepassing van het protocol aan gekweekte muis embryonale stamcellen, bleek hoger kleuring in gekweekte embryonale stamcellen dan muis embryonale fibroblasten. Onderzoek van vers geïsoleerde muis aorta bleek kleuring in zachte spiercellen loodrecht op de aorta. De methodologie die kan worden gebruikt om de activiteit van enzymen die het genereren van een proton in bevroren of vers weefsel ruimtelijk in kaart.

Resultaten voor in situ activiteit testen in muis huid20hebben we eerder gemeld. Zoals blijkt uit Figuur 3, vastgesteld we hebben dat hoge niveaus van lactaat dehydrogenase activiteit in de haarfollikel stamcellen aan de basis van de haarfollikel als hierboven de procedures beschreven werden gevolgd. Deze bevindingen werden bevestigd door fluorescentie geactiveerd cel sorteren van de huid voor de cellen van de stam van de haar...

We beschrijven een protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit voor enzymen die nicotinatmide adenine dinucleotide-fosfaat (NAD(P)H) + H + rechtstreeks in weefselmonsters genereren.

Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de biologie, zoals de activiteit van enzymen op verschillende locaties binnen weefsels. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeker in staat stelt om enzymatische activiteit direct in de weefselmonsters te detecteren. Om deze procedure te beginnen, verwijdert u het haar van de muis met een trimmer voor dierenhaar.Maak een insnijding in de huid van de rug met een schaar. Til vervolgens de huid op en knip deze weg. Vul vervolgens de Cryomold met vriesreagens. Gebruik pincet om de huidsecties in de Cryomold van het veld te plaatsen. Richt de huidsecties zo dat de dwarsdoorsnede van de huid van de epidermis tot de dermis, hypodermis en spier zichtbaar is. Monteer indien mogelijk de experimentele en controlemuizen samen in dezelfde Cryomold, zodat ze op dezelfde dia kunnen worden gesneden en samen kunnen worden verwerkt.Zorg ervoor dat u geen bubbels maakt. Plaats de Cryomold op een vlakke oppervlakte van een blok droog ijs in een ijsemmer. Voor opslag, breng de Cryomold over naar een vriezer van min 80 graden Celsius.De monsters kunnen ongeveer drie maanden in de vriezer worden bewaard zonder significa

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes a colorimetric assay for lactate measurement in cell lysates by using the lactate dehydrogenase enzyme. This enzyme converts lactate into pyruvate, along with the conversion of NAD to NADH that reacts with tetrazolium dyes and gives a colored product that can be measured spectrophotometrically to quantitate the lactate.

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Dynamische nucleaire polarisatie met daaropvolgende oplossing van het monster heeft real-time studies van metabolisme in biologische systemen mogelijk gemaakt. Gehyperpolariseerd [1-13C]pyruvaat werd gebruikt om lactate dehydrogenase-activiteit te bestuderen in een prostaatcarcinoom-cellijn in vitro.

hypergepolariseerde 13 C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

Hier presenteren we een protocol dat kan worden gebruikt om microscopisch visualiseren en kwantificeren van de activiteit van dehydrogenases in cellen en weefsels en kinetiek, functie en subcellular localisatie.

Metabole Mapping: Kwantitatieve enzym cytochemie en histochemie te bepalen van de activiteit van Dehydrogenases in cellen en weefsels

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Hier presenteren we een protocol om het transport van monocarboxylaten, glucose en ATP in gliacellen en neuronen te visualiseren met behulp van genetisch gecodeerde Förster-resonantie-energieoverdracht-gebaseerde sensoren in een ex-vivo Drosophila-larvale hersenpreparaat.

Visualisatie van monocarboxylaten en andere relevante metabolieten in het ex vivo Drosophila-larvale brein met behulp van genetisch gecodeerde sensoren

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

Leer hoe u lactaatdehydrogenase-activiteit rechtstreeks in weefsels kunt detecteren met behulp van NAD(P)H-genererende enzymen. Deze methode maakt nauwkeurige ruimtelijke mapping van metabole activiteit in biologische monsters mogelijk.

Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Meer video's verkennen