FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

Het algemene doel van dit experiment is om het endo- en exocytose-cyclus van synaptische vesicles op de levende bereiding van Drosophila larvale neuromusculaire junctie te observeren met behulp van fluorescerende FM-kleurstoffen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de neurowetenschappen te beantwoorden, zoals welke genen cruciaal zijn voor de functie van de synaptische vesiclecyclus? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je het vesicle-cyclus optisch kunt volgen in een levende bereiding met behulp van drie verschillende soorten stimuli, hoge kaliumdepolarisatie, elektrische stimulatie of met behulp van optogenetica.

Om deze procedure te starten, voegt u het anti-HRP-antilichaam, geconjugeerd aan een lexoflor 647, toe aan de dissectiesaline. Vervolgens voegt u een met elastomeer bekleed dekglas toe aan de dissectiekamer en vervolgens voegt u de dissectieoplossing met HRP-antilichaam toe voor het labelen van de NMJ presynaptische terminal tijdens de dissectie. Gebruik een fijne verfkwast om een wanderende derde instar van het voedselglas op een met elastomeer bekleed dekglas over te brengen.

Vul vervolgens een glazen micropipettip met een kleine hoeveelheid lijm, met behulp van negatieve luchtdruk gegenereerd door de mond. Positioneer vervolgens de larven, rugzijde omhoog, met behulp van een pincet en lijm het hoofd aan het met elastomeer bekleed dekglas met een kleine druppel lijm met behulp van positieve luchtdruk door de mond. Herhaal deze procedure met het achterste uiteinde van de larven, waarbij u ervoor zorgt dat het dier strak gespannen is tussen de twee lijmaantasten.

Maak vervolgens met behulp van een schaar een horizontale snede van één millimeter aan de achterkant en een verticale snede langs de dorsale middenlijn. Verwijder vervolgens voorzichtig de dorsale trachea, darm, vetlichaam en andere interne organen die de musculatuur bedekken. Herhaal de lijmprozedurering voor de vier lichaamswandflappen, waarbij u ervoor zorgt dat het lichaam zowel horizontaal als verticaal voorzichtig wordt uitgerekt.

Til vervolgens het VNC op en snijd voorzichtig de motorische zenuwen met de schaar en verwijder volledig het VNC. Vervang de dissectiesaline door calciumvrije saline om SV-cyclus te stoppen. Voor elektrische stimulatie, bereid een zuigpipet voor met behulp van de micro-elektrodetrekker om de vereiste tapsheid en tipgrootte te verkrijgen.

Polijst vervolgens het micro-elektrodetip met een micro-smid om een strakke pasvorm te creëren bij het opzuigen van een enkele motorische zenuw. Schuif de zuigpipet op de elektrodehouder op een micromanipulator, die is bevestigd aan een lange, flexibele kunststof buis en een spuit. Plaats vervolgens de bereiding met FM-kleurstof op de microscoopstandaard en verhoog de standaard totdat de larven en zuigpipet scherp staan.

Zuig vervolgens een lus van de gesneden motorische zenuw op, die het geselecteerde hemisegment innerveert, met negatieve luchtdruk, gegenereerd door de spuit in de zuigelektrode. Stimuleer vervolgens de motorische zenuw met behulp van de geselecteerde parameters om SV-endocytose en FM 143-kleurstoffopname te stimuleren. De meest cruciale stap op dit punt in de procedure is om een enkele motorische axon met een strakke pasvorm in de zuigelektrode op te zuigen.

Dit kan enige proef en fout vereisen. Zodra een adequate zuigelektrode is gevonden, gebruikt u dezelfde voor alle omstandigheden die worden vergeleken om een consistente stimulatiespanning te garanderen. Voor FM-kleurstoffontlading, zuig dezelfde motorische zenuw in dezelfde elektrode en stimuleer vervolgens de motorische zenuw om SV-exocytose en FM 143-kleurstoffontlading te activeren.

Voor channelrhodopsine-stimulatie, bevestig een blauwe LED aan een programmeerbare stimulator met behulp van een coaxiale kabel en plaats de LED in de camerapoort. Richt de blauwe LED-lichtstraal op de bereiding met FM-kleurstof met behulp van de microscoopzoomfunctie. De meest cruciale stap op dit punt in de procedure is ervoor te zorgen dat de LED-instellingen constant worden gehouden en dat u hetzelfde deel van elk dier belicht voor alle omstandigheden die worden vergeleken om een consistente stimulatiespanning te garanderen.

Start de lichtstimulatie en volg met de timer voor de vooraf bepaalde duur van de optogenetische stimulatieperiode. Wanneer de timer stopt, verwijdert u snel de FM-kleurstoffoplossing en vervangt u deze door calciumvrije saline om de SV-cyclus te stoppen. Voor FM-kleurstoffontlading, start u de lichtstimulatie en volg u met een timer voor de vooraf bepaalde duur van de optogenetische stimulatieperiode.

Wanneer de timerperiode is afgelopen, verwijdert u snel de FM-kleurstoffoplossing en plaatst u deze met calciumvrije saline om de SV-cyclus te stoppen. Om de fluorescente afbeelding te kwantificeren, laadt u deze in image J en maakt u een maximale intensiteitsprojectie door te klikken op Afbeelding, Stapels, Zproject, en vervolgens met behulp van het anti-HRP 647-kanaal, gaat u naar Afbeelding, Aanpassen, Drempel, en schuift u de bovenste werkbalk totdat alleen de NMJ wordt gemarkeerd. Gebruik het toverstokje-gereedschap en klik op de NMJ.

Als de NMJ ononderbroken is, houdt u de shift-knop ingedrukt en selecteert u alle delen. Verander vervolgens de afbeelding naar het FM 143-kleurstoffopnamekanaal en ga naar Analyseren, Meten, om de fluorescentiemeting te verkrijgen. Herhaal deze stappen voor de ongeladen afbeelding van dezelfde NMJ.

Fluorescente FM 143 kan worden fotogeconverteerd naar een geoxideerde DAB-elektronendicht precipitaat voor visualisatie via TEM. Hier is een schematisch diagram van de fotoconversiemethode om de drosophila NMJ te labelen na activiteitsafhankelijke FM 143-kleurstoffopname. Dit is een representatieve TEM-afbeelding van een wildtype synaptisch bouton in rust, die een dichte populatie van uniform gedimensioneerde SV's laat zien.

Deze afbeeldingen tonen de synaptische boutons die zijn gestimuleerd met hoge kaliumzoutoplossingdepolarisatie gedurende vijf minuten zonder fotoconversie of met FM 143-fotoconversie. De bulk end homostructuren kunnen hier worden waargenomen