Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4⁺ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van gastheer-pathogen interacties, zoals wat zijn de unieke kenmerken van de productief geïnfecteerde cellen, welke gastheer cofactoren virussen toestaan om productieve infectie vast te stellen, en hoe deze cellen te richten in therapeutische interventies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kwantitatieve maatregelen biedt voor zowel eiwit als mRNA binnen enkele cellen, en de meeste reagentia zijn commercieel beschikbaar. Het aantonen van de cel-sorteerprocedure zal Matthew Creegan, een senior technicus uit de stroom cytometrie kern in het laboratorium van dokter Michael Eller.

Om te beginnen, in een aangewezen pre-PCR moleculaire biologie werkstation, de test mix voor te bereiden door het combineren van 96 genexpressie testen in een RNase, DNase vrije buis ervoor te zorgen om elke test toe te voegen aan een laatste concentratie van 180 nanomolar van voorwaartse en omgekeerde primers. Voeg DNA-suspensiebuffer toe om de juiste verdunning van het testmengsel te bereiken. Voor elke verwachte 96 bij 96 chip array, pipette zes microliters van elke test in een aangewezen put van een 96 goed PCR plaat, dan verzegelen de plaat met een lijm.

Om te beginnen oppervlak vlekken levensvatbare cellen, in een weefsel cultuur bioveiligheid kabinet, eerst de compensatie monsters en een master mix van fluorescerende antilichaam cocktail zoals beschreven in de tekst protocol. Ontdooi de cryopreserved cellen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten. Voeg hierna tussen de 5 en twee milliliter van de celsuspensie toe aan een buis van 15 milliliter met 12 milliliter PBS.

Centrifuge op 500 G gedurende drie minuten bij 25 graden Celsius, dan aspirate de PBS en resuspend de pellet in drie milliliter verse PBS. Breng dit mengsel over op een vijf milliliter polystyreenbuis. Centrifuge opnieuw op 500 G gedurende drie minuten bij 25 graden Celsius.

Aspirate de supernatant, waardoor ongeveer 10 microliters resterende PBS. Vervolgens, resuspend tot 20 miljoen gewassen cellen in 80 microliter van antilichaam cocktail. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 graden Celsius, terwijl beschermd tegen licht.

Voeg hierna drie milliliter PBS toe. Centrifuge op 500 G gedurende drie minuten en aspirate de supernatant. Grondig resuspend de cellen in 300 tot 500 microliter van PBS.

Filter deze oplossing door het door een 35 micrometer nylon cel-zeef dop. dan houden de cellen op ijs en beschermd tegen licht tot het soort. Terug in de pre-PCR werkstation, eerst de RT preAMP reactie mix in een enkele RNase, DNase gratis steriele buis zoals beschreven in het tekstprotocol.

Met behulp van een multichannel pipet, afzien van 10 microliters van deze reactie mix in het gewenste aantal van 96 goed PCR sort collection platen. Verzegel de plaat met plakfolie en plaats de plaat op een voorgekoeld aluminiumblok van 96 put. Stel hierna het celsorteergatingsschema in en bereid de cytometrische celsorteerder voor, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voer de juiste instrumentinstellingen in om het aantal en de subset van cellen op te geven die in elke put moeten worden gesorteerd. Verwijder de kleefzegel en sorteer de cellen in de voorbereide 96 put PCR-opvangplaten. Hersllijk de plaat opnieuw af met verse kleeffolie.

Onmiddellijk vortex de opnieuw afgenomen plaat en vervolgens centrifugeren op 2000 G voor een minuut op vier graden Celsius. Thermocycle de plaat in een PCR-machine met een voorverwarmd deksel op 50 graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door 95 graden Celsius gedurende twee minuten. Tot slot, thermocycle voor 18 cycli van 95 graden Celsius gedurende 15 seconden en 60 graden Celsius gedurende vier minuten, dan in een post-PCR werkstation, breng vijf microliters van cDNA in 20 microliter van DNA-suspensie buffer in een nieuwe 96 goed PCR-plaat.

Om te beginnen, bereid de qPCR-testplaat door vier microliter van assay-loading reagens in elke put te pipetten. Breng vervolgens vier microliters van elke test van de 2X-testplaat naar de qPCR-plaat. Houd de qPCR-testplaat op vier graden Celsius.

Doe de regelvloeistoffen van de primingspuiten in de twee inlaatkleppen van de chip. Verwijder het beschermende plastic onder de plaat. Plaats de chip op een IFC-controller met de inkepinge kant op de A1-positie en selecteer en voer het prime script uit.

Voor elke microfluïde chip, meng 50 microliter van het monster laden reagens met 500 microliters van PCR master mix om de real-time reactie mix voor te bereiden. Pipette 4.4 microliters van deze reactie meng in elke put van een nieuwe 96 goed PCR plaat nu aangewezen als de monsterplaat. Vervolgens pipette 3.6 microliter van de eerder verdunde cDNA in elke put van de monsterplaat.

Breng hierna vijf microliter van de testplaat naar de overeenkomstige put aan de inkepingenzijde van de chip. Breng vijf microliter van de monsterplaat naar de overeenkomstige put aan de andere kant van de chip. Plaats de geladen chip in de IFC-controller en voer het load mix-script uit.

Breng vervolgens de chip over naar het BioMark-platform en stel het instrument in zoals beschreven in het tekstprotocol en sla vervolgens het bestand voor het uitvoeren van chips op in een aangewezen map. Wanneer de chiprun is voltooid, opent u de realtime PCR-analysesoftware en selecteert u bestand, opent u om de chiprun te openen. bml-bestand.

Zoek in de linkerbovenhoek van het softwarevenster de samenvatting van chip explorer en chiprun. Klik onder het overzicht van de chiprun op de installatie van de detector. Klik onder taak op nieuw en selecteer de SBS-plaat en containernotatie SBS 96 van het containertype SBS.

Klik op de knop met de ellips naast het in kaart brengen en selecteer vervolgens M96-Assay-SBS96.dsp. Klik op analyseweergaven. Selecteer op het tabblad qPCR onder taak basislijncorrectie voor lineaire afgeleide en CT-drempelmethode voor gebruikersdetectoren.

Schakel op het tabblad CT-drempelwaarden het selectievakje initialiseren met automatisch in en klik vervolgens op de knop Analyseren. Klik in het kwadrant rechtsboven van analyseweergaven op het tweede tabblad, de resultatentabel. Selecteer in het vervolgkeuzemenu de weergave heatmap en de warmtekaart met de gegevens wordt weergegeven.

Klik onder de heatmap op drempelwaarde en logboekgrafiek. Pas de CT-drempelwaarden handmatig aan voor elke detector door op tests te klikken, vertegenwoordigd door kolommen op de warmtekaart, en sleep de drempel zo nodig om de versterkingscurven in de exponentiële fase te kruisen. Klik op analyseren wanneer u klaar bent.

Exporteer vervolgens de qPCR-gegevens als een csv-bestand. Breng qPCR-gegevens van de BioMark-computer naar uw bureaublad. Importeer de gegevens in een spreadsheet- of statistische analysesoftware en breng de resultaten in kaart per steekproef en testposities op de chip.

Maak een nieuwe kolom en gebruik een voorwaardelijke formule om de cellen in groepen te organiseren op basis van de expressie van virale genen. Selecteer onder analyseren de optie fit Y op X en plot genexpressie versus groep. Gebruik hierna FlowJo versie negen om FCS-bestanden te openen van FACS-sortering die overeenkomt met een 96-putplaat.

Als de bestandsnaam is gemarkeerd, selecteert u platform, gebeurtenisnummerpoort en maakt u geïndexeerde sorteerpoorten. Afzonderlijke cellen worden weergegeven per rij. Markeer alle 96 cellen en selecteer werkruimte, export, selecteer alle gecompenseerde vloeren.

Selecteer onder gegevens FCS-bestand, klik op exporteren en selecteer een aangewezen map. Sleep de nieuwe FCS-bestanden voor afzonderlijke cellen naar een nieuwe FlowJo-werkruimte. Markeer alle cellen en klik op statistieken toevoegen, vertegenwoordigd door de sigmaknop, gemiddelde en alle fluorescentieparameters.

Open de tabeleditor, markeer vervolgens alle verdiepingen van de eerste cel en sleep ze naar het venster van de tabeleditor. Klik in dit venster op tabel maken en weergeven. Kopieer en uitvoer daarna naar een statistische software door het kopiëren van plakken of door op de knop Toepassing opslaan en starten te klikken.

Voeg de FACS-gegevens met één cel samen met de qPCR-gegevens in JMP op basis van het kenteken en de putpositie. Ten slotte grafische en statistische analyses uitvoeren op de gecombineerde gegevens. In deze studie wordt eencellige eiwitkwantificering door multi-parameter flow cytometrie geïntegreerd met kwantitatieve eencellige mRNA-expressie door zeer multiplexed RTqPCR.

Hier is eencellige kwantitatieve virale genexpressie van FACS gesorteerd Rhesus makaken CD4 positieve T cellen. Tat/rev positieve N van negatieve cellen uiten minder kopieën van tat/rev RNA dan de N van positieve cellen in donkergroen, wat in overeenstemming is met een vroeg stadium van infectie voorafgaand aan stabilisatie en een nucleaire export van gedeeltelijk gespleten viraal RNA. Een grote overvloed aan niet-pliced Gag-RNA in tat / rev positieve N van positieve cellen is in overeenstemming met laat stadium productieve infectie waarin overvloedig genomic RNA wordt uitgedrukt en verpakt in ontluikende virions.

Deze trivariate plot met het virale gen met één cel, gastheergen en gastheeroppervlaktewitexpressie toont aan dat de expressie van oppervlakte-CD4 en CD3-eiwit wordt verminderd in tat/rev-positieve cellen die in het groen worden weergegeven, hoewel CD4- en CD3-transcripties worden volgehouden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in twee tot drie dagen. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe gerichte eencellige prototranscriptional evaluatie uit te voeren om vragen met betrekking tot differentieel uitgedrukte genen en eiwitten in viraal geïnfecteerde cellen te pakken.