Name: Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer een flexibel, goedkoop hydrocultuursysteem voor plantenonderzoek met Arabidopsis thaliana onder steriele omstandigheden. Deze methode ondersteunt grootschalige moleculaire en fysiologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de São Paulo Research Foundation (FAPESP; Verlenen van 12/19561-0) en de Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), en Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) zijn dankbaar voor de beurzen. De auteurs bedanken Christian Meyer van het Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankrijk) royaal voorzien van antilichamen tegen RPS6. De auteurs bedanken RTV UNICAMP en Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel voor hun technische ondersteuning tijdens het geluid opnemen.

1. bereiding van de voedingsbodems voor vloeibare en vaste
<ol><li>Bereiden van een opgietvloeistof halve sterkte Murashige en Skoog (MS) medium met vitaminen [0,0125 mg/L cobalt(II) chloride pentahydraat 0,0125 mg/L copper(II) sulfaat, pentahydraat, 18.35 mg/L ethyleendiaminetetraacetaat ijzer(III) natrium, 3,10 mg/L Boorzuur, kaliumjodide, 8.45 mg/L van mangaan 0.415 mg/L sulfaat monohydraat, 0,125 mg/L natrium natriummolybdaat (dihydraat) p.a., 4.30 mg/L Zinksulfaat-heptahydraat, 166.01 mg/L calcium chloride, 85 mg/L fosfaat kalium kaliumdiwaterstoffosfaat p.a. in water, 950 mg/L kaliumnitraat 90.27 mg/L magnesium-sulfaat, 825 mg/L van ammoniumnitraat, 1 mg/L van glycine, 50 mg/L myo-inositol, nicotinezuur 0,25 mg/L, 0,25 mg/L Pyridoxinehydrochloride en 0,05 mg/L van thiamine hydrochloride] aangevuld met 0,25 g/L MES, en breng de pH op 5.8 met 10 M KOH.</li>
	<li>Voeg 10 g/L agar te maken een halve sterkte MS-solide medium. Autoclaaf het medium bij 121 ° C gedurende 20 min vóór gebruik.</li>
</ol>2. hydrocultuur systeem montage
Opmerking: Deze stappen moeten worden gevolgd zorgvuldig om te bouwen van de hydrocultuur systeem.
<ol><li>
Materiële sterilisatie
	<ol>
<li>Pak in de zak van de autoclaaf de pipet tip rekken (zonder covers) die wordt gebruikt als minitanks. Autoclaaf de rekken bij 121 ° C gedurende 20 min, 15 psi. Opmerking: Het polypropyleen pipette uiteinde rek we gebruikten had de volgende afmetingen: 120 mm (lengte) x 89 mm (breedte) x 55 mm (hoogte). De pipet tip vlakke ondergrond moet beschikken over een gebied voor de toevoeging van kweekmedium. Andere tip rekken kunnen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Tijdens de procedure van de vergadering van de hydrocultuur systeem is het gebruik van een laminaire flow-kap, die moet worden gereinigd en ontsmet met 70% ethanol vóór gebruik noodzakelijk. De experimentator moet dragen een laboratoriumjas, hun handen wassen en een blootgestelde huid en ontsmetten met 70% ethanol. Handschoenen zijn optioneel, behalve voor de toepassing van de drug.</li>
		<li>Reinig alle bovenstaande (wegwerp plastic dozen, plakband, pipetten, schaar en pincet) met 70% ethanol alvorens de laminaire flow hood accessoires. Als de kap toestaat, schakelt het UV-licht gedurende 10 minuten voorafgaand aan de montage van de hydrocultuur systeem om te houden van het werkgebied ontsmet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Minitank montage
	<ol>
<li>Het zegel van de bovenkant van het uiteinde van de pipet plat met plakband (figuur 1B). Indien mogelijk, laat het onder UV-licht voor 10 min.</li>
		<li>Voeg 180 µL van gesmolten solide MS kweekmedium (veel te warm) aan elke goed met een meerkanaalspipet (Figuur 1 c). Opmerking: Bij de voorbereiding veel tanks, gebruik een kookplaat om te voorkomen dat het MS medium stollen.</li>
		<li>Het toestaan van het medium te stollen volledig (voor ongeveer 30 min). Opmerking: Tijdens de periode van de stolling, het UV-licht kan worden ingeschakeld.</li>
		<li>Vul het pipet tip rack compleet met vloeibare MS kweekmedium (Figuur 1 d) en zorgen er nauw contact tussen de vaste en de vloeibare media.</li>
		<li>Verwijderen van de lijm-tapes van de hogere oppervlakte van de pipet tip plat en past op de pijnbank zorgvuldig. De hydrocultuur systeem is nu klaar om te ontvangen van de gesteriliseerde zaden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. zaad sterilisatie
<ol><li>500 Arabidopsis zaden in een 1,5 mL microtube plaatsen. Gebruik zo veel slangen als nodig volgens het aantal planten die nodig zijn voor het experiment.</li>
	<li>Wassen van de zaden met 70% ethanol gedurende 2 minuten met een zachte agitatie. Laat de zaden settelen en deze vervolgens verwijdert de ethanol zorgvuldig.</li>
	<li>Voeg 1 mL van een 10% natriumhypochloriet-oplossing met 2 µL van een Polysorbaat 20 detergens. Agitate de oplossing voor 5 min. verwijderen de oplossing zorgvuldig.</li>
	<li>Spoel de zaden met steriel gedistilleerd water totdat al het bleekmiddel residu volledig is verwijderd (ongeveer 5 x). Opmerking: Na de oppervlakte sterilisatie, de zaden werden ondergedompeld in steriel gedistilleerd water en gelaagde bij 4 ° C in het donker voor 5 d voor het synchroniseren van de kiemkracht. Opmerking: Zaden van Setaria viridis (toetreding A10.1) werden gepreïncubeerd in geconcentreerd zwavelzuur gedurende 15 minuten (te breken de fysieke ruststadia), grondig gewassen in steriel gedistilleerd water en vervolgens disinfested met een 5% natriumhypochloriet-oplossing die 0,1% Polysorbaat 20 voor 5 min met een zachte agitatie21bevatten. De resterende stappen van de sterilisatie waren identiek aan die welke beschreven voor Arabidopsis zaden.</li>
</ol>4. zaad toepassing
<ol><li>Gesneden enigszins het uiteinde van een 200 µL tip met behulp van een steriel scalpel.</li>
	<li>Pipetteer de zaden van Arabidopsis in de solide kweekmedium op de hogere oppervlakte van de Pipet van platte tip. Zorg dat het medium doet niet los van de flat; anders, de zaden zullen grijs en de zaailingen zal niet goed groeien (figuur 1E). Opmerking: Gebruik een steriel pincet voor Setaria zaden (met het embryo opwaartse gepositioneerd).</li>
	<li>Opslaan minitanks zoveel mogelijk binnen een wegwerp plastic doos houden de omgeving vrij van micro-organismen (figuur 1F) te handhaven van een hoge luchtvochtigheid.</li>
	<li>Verzegel de wegwerp plastic doos grondig met behulp van plakband om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de hydrocultuur systemen in een kamer van de groei met de voorwaarden van de juiste groei voor de plant van belang. Opmerking: In dit werk, werden de volgende omstandigheden gebruikt: 75% van vochtigheid en 150 µmol m-2 s-1 van de bestralingssterkte en Equinoctiael voorwaarden van 12 h licht (21 ° C) / 12u donker (19 ° C) Arabidopsisof 300 µmol m-2 s-1 voor bestralingssterkte en 12 h licht (28 ° C) / 12u donker (25 ° C) voor Setaria (figuur 1G en 1 H).</li>
</ol>5. valideren het gebruik van deze hydrocultuur systeem voor de remming van het doel van Rapamycin Kinase
Opmerking: Deze hydrocultuur systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld om het beheer van chemische stoffen voor de planten, die in het algemeen, zijn erg duur worden toegepast in grootschalige experimenten. Als een bewijs van concept werkte de ATP-concurrerende remmer AZD-8055, waarvan bekend is dat de ATP-binding site van de TOR proteïne kinase22specifiek te richten, te volgen van de onderdrukking van TOR activiteit in zaailingen van A. thaliana Columbia-0) De Nottingham Arabidopsis voorraad centrum, de NASC-ID: N22681). Het gebruikte protocol is hier, kort beschreven.
<ol><li>Groeien zaden hydrocultuur totdat fase 1.04 volgens de BBCH schaal23 (voor ongeveer 11 d) onder de klimatologische omstandigheden zoals hierboven beschreven. Vervangen van de voedingsoplossing, hetzij met het verse medium met 0,05% DMSO (control), 2 µM AZD-8055 (TOR-remmer) verdund in DMSO, of zonder behandeling (mock), aan het einde van de nacht (nl).</li>
	<li>Oogst van sommige zaailingen op verschillende tijdstippen na de behandeling en ze scheiden in roots en shoots. Bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof, ze vermalen tot een fijn poeder in een robotachtige slijper (Zie Tabel of Materials), en het poeder bij-80 ° C bewaren tot gebruik.</li>
	<li>Immunoblot tegen gefosforyleerd en niet-phosphorylated vormen van 40S ribosomal eiwit S6 (RPS6) volgens Dobrenel et al. 24.</li>
	<li>Bleekmiddel intact zaailingen voor monster depigmentatie, was ze in gedistilleerd water dompelen hen in een jodiumoplossing voor 5 min25en fotograferen van de zaailingen in een stereomicroscoop (0.63 X 7,5 x omvang, doelstelling en 20 x onderlinge aanpassing) voor een kwalitatieve beoordeling van het zetmeelgehalte.</li>
	<li>Het zetmeel na de enzymatische afbraak en de waardering van de vrijgegeven glucose spectrophotometrically door het te koppelen aan de vermindering van NADP+ aan NADPH26,27te kwantificeren.</li>
	<li>Uitvoeren van een totale extractie van RNA, cDNA synthese en kwantitatieve RT-PCR-testen zoals beschreven door Caldana et al. 28 tot en met het niveau van de expressie van genen aan verschillende soorten benadrukt gerelateerde te evalueren.</li>
	<li>Optioneel, groeien zaailingen op een tuinbouw substraat in kunststof potten met een capaciteit van 0,1 L onder vergelijkbare klimatologische omstandigheden [60% luchtvochtigheid, 150 µmol m-2 s-1 van bestralingssterkte, Equinoctiael van 12 h licht (21 ° C) / 12u donker (19 ° C )] om te vergelijken met de zaailingen hydrocultuur gegroeid. Opmerking: De doelgenen gebruikt voor het testen van gen expressie werden ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), en TPS5 (At4g17770), en hun niveaus van de expressie waren genormaliseerd dienst van de delta-Ct methode29 met behulp van ACT2 (At3g18780) of PDF2 (At4g04890) als de interne verwijzing genen, ervan uitgaande dat 100% van de PCR-amplificatie efficiëntie over alle monsters. De oligonucleotide-paren die worden gebruikt voor de kwantitatieve PCR waren: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), en PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze geoptimaliseerde hydrocultuur structuur maakt het mogelijk de succesvolle in vitro cultuur van planten. Zaden ontkiemen goed op de solide medium op de pipet tip plat oppervlak, een aanzienlijke winst in vergelijking met systemen waar zaden doorweekt met de voedingsoplossing zijn. Een groot voordeel van dit systeem is dat tijdens de ontwikkeling van zaailing, wortels rechtstreeks contact met de vloeistof zonder de behoefte aan overdracht krijgen. Bovendien, chemische behandeling kan gemakkelijk worden toegep...

De voordelen van groeiende planten met behulp van hydrocultuur hebben algemeen erkend in de productie van grote uniforme planten en reproduceerbare experimenten1,2,3inschakelen. In dit systeem kan de compositie van de voedselkwaliiteit oplossing naar behoren wordt gecontroleerd en gerecycleerd langs alle stadia van plantengroei en ontwikkeling. Wortels zijn bovendien niet onderworpen aan de abiotische stress, zoals kan gebeuren in de bodem geteelde planten, zoals nutriënten honger en water deficiëntie4. Als planten gekweekt hydrocultuur aanwezig morfologische en fysiologische eigenschappen redelijk vergelijkbaar met degene die worden gekweekt in de bodem, dit systeem is in grote lijnen nog werkzaam zijn in onderzoek omdat het mogelijk de monitoring van wortel/schieten groei en hun oogsten maakt zonder verwondingen2,5.
Te wijten aan de mogelijkheid van het wijzigen van de samenstelling en de concentratie van de voedselkwaliiteit oplossing, is het meeste onderzoek met behulp van hydrocultuur voorwaarden verricht karakteriseren van de functies voor micro- en macronutriënten1,3 ,6,7,8. Nochtans, heeft dit systeem bleek zeer nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen in plantenbiologie, zodanig ophelderen van de functies van hormonen en chemische stoffen in planten. Bijvoorbeeld, de ontdekking van strigolactones als een nieuwe klasse van hormonen9 en het fenotype van de versnelde groei veroorzaakt door brassinosteroïde toepassing10 werden uitgevoerd onder hydrocultuur voorwaarden. Bovendien maakt dit systeem experimenten met gelabelde isotopen (b.v., 14N /15N en 13CO2)11,12 te evalueren hun opneming in de eiwitten en metabolieten door de Spectrometrie van de massa.
Gezien het belang van dit systeem in plantenonderzoek, een groot aantal hydrocultuur culturen is ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van systemen die gebruikmaken van (i) de overdracht van zaailingen uit platen met hydrocultuur containers3, 13; (ii) rockwool dat beperkt de toegang tot de vroege stadia van wortel ontwikkeling2,14,15; (iii) polyethyleen granulaat als het zwevende lichaam, waardoor de homogene toepassing van kleine moleculen/behandelingen moeilijk16; of (iv) een verminderd aantal planten9,17. Het volume van hydrocultuur tanks beschreven in veel van deze protocollen zijn meestal grote (kleine hoeveelheden variërend van 1-5 L, maximaal 32 L)18, waardoor de toepassing van chemische stoffen extreem duur. Hoewel weinig studies een hydrocultuur teelt onder aseptische condities8,beschrijven is19, de vergadering van het systeem meestal heel moeizaam, bestaande uit de perfecte aanpassing van nylon mazen in plastic of glas containers5,8,17,20.
Vanwege het belang van Arabidopsis thaliana als een model-plant, werden de meerderheid van hydrocultuur systemen ontworpen voor dit soort1,2,8,14,18, 19 , 20. niettemin, er zijn een paar studies rapportagefuncties de hydrocultuur groei van andere plantensoorten met een voorbehandeling van zaden ter verbetering van hun kiemkracht en synchronisatie tarieven in vitro8,16 . Om te kunnen werken op grote schaal, ontwikkelden we een protocol voor het opzetten van een eenvoudige en goedkope hydrocultuur onderhoudssysteem waarmee steriele omstandigheden voor de teelt van planten, met inbegrip van A. thaliana en andere soorten, zoals het gras Setaria viridis. De hier beschreven methode is geschikt voor verschillende experimenten, zoals de zaailing groei kan worden gemaximaliseerd, gesynchroniseerd en gemakkelijk gecontroleerd. Bovendien, dit systeem heeft vele voordelen als: (i) de montage is eenvoudig en de componenten ervan kunnen worden hergebruikt; (ii) hierdoor de gemakkelijke toepassing van verschillende chemische stoffen in de vloeistof; (iii) de zaailingen ontkiemen en groeien rechtstreeks in het kweekmedium zonder de behoefte aan overdracht aan de hydrocultuur systeem; (iv) de shoot en wortel ontwikkeling/groei nauw kunnen worden gecontroleerd en de zaailingen worden geoogst zonder schade; en (v) het maakt het mogelijk om te werken op grote schaal, behoud van fysiologische toestanden.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochlorietoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbaat 20&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Murashige en Skoog (MS) medium inclusief vitaminen&nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morfolino)etaansulfonzuur (MES) monohydraat</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7921</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire stroomkap</td><td>Telstar</td><td>BH-100</td><td></td></tr><tr><td>Heetplaat</td><td>AREC</td><td>F20510011</td><td></td></tr><tr><td>Kweekkamer</td><td>Weiss Technik</td><td>HGC 1514</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Petrischaal (150 mm x 25 mm)</td><td>Uniglass</td><td>189.006</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipettip racks&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K8-200-5 *</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu;L multikanaalspipet</td><td>Eppendorf</td><td>3122000060</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu;L pipettips</td><td>Eppendorf</td><td>30073088</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipet&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipettips</td><td>Eppendorf</td><td>30000870</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Tramontina</td><td>25912/108</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>ABC Instrumentos</td><td>702915</td><td></td></tr><tr><td>Schelpblad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevend transparant plakband (45mm x 50m)</td><td>Scotch 3M</td><td>5803</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef plastic dozen, buitenafmetingen: 353 mm (L) x 178 mm (B) x 121mm (H)</td><td>Maxipac</td><td>32771</td><td></td></tr></tbody></table>

een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

Een breed scala van studies in plantenbiologie zijn uitgevoerd met behulp van hydrocultuur culturen. In dit werk, wordt een in vitro hydrocultuur groei systeem ontworpen voor de beoordeling van de plant reacties op chemische stoffen en andere stoffen van belang gepresenteerd. Dit systeem is zeer efficiënte bij het verkrijgen van homogene en gezond pootgoed voor de C3 en C4 model soorten Arabidopsis thaliana en Setaria viridis, respectievelijk. De steriele teelt vermijdt algen en micro-organismen verontreiniging, waarvan bekend is dat beperkende factoren voor de normale groei van planten en de ontwikkeling in hydrocultuur. Bovendien is dit systeem schaalbaar, waardoor de oogst van plantaardig materiaal op grote schaal met kleine mechanische schade, evenals de oogst van afzonderlijke delen van een plant indien gewenst. Een gedetailleerd protocol aan te tonen dat dit systeem een eenvoudige en goedkope assemblage heeft, aangezien het pipet rekken als het belangrijkste platform gebruikt voor de teelt van planten, wordt verstrekt. De haalbaarheid van dit systeem werd gevalideerd met behulp van Arabidopsis zaailingen te beoordelen van het effect van de drug AZD-8055, een chemische inhibitor van het streefcijfer van rapamycin (TOR) kinase. TOR remming ontdekt efficiënt zo spoedig 30 min na de behandeling van een AZD-8055 in roots en shoots. Bovendien weergegeven AZD-8055-behandelde planten het verwachte zetmeel-overmaat fenotype. We voorgesteld dit hydrocultuur systeem als een ideale methode voor onderzoekers van de plant gericht op het controleren van de actie van de fabriek inductoren of remmers, evenals evalueren van metabole fluxen met behulp van isotopen-labeling verbindingen waarvoor, in het algemeen, het gebruik van dure reagentia.

De TOR-kinase is een belangrijke regulator dat integreert voedingsstoffen en energie signalering ter bevordering van celproliferatie en groei in alle eukaryoten. Inspanningen om te verhelderen TOR functies in planten omvatten de generatie van Arabidopsis transgene lijnen met TOR voorwaardelijke repressie door middel van RNA-interferentie of kunstmatige microRNA28,30,31, gegeven het embry...

Een eenvoudige, veelzijdige en goedkope in vitro hydrocultuur systeem werd met succes geoptimaliseerd, inschakelen van grootschalige experimenten onder steriele omstandigheden. Dit systeem vergemakkelijkt de toepassing van chemische stoffen in een oplossing en hun efficiënte absorptie door wortels voor moleculaire, biochemische en fysiologische studies.

Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Een eenvoudig, veelzijdig en goedkoop in vitro hydrocultuursysteem werd met succes geoptimaliseerd, waardoor grootschalige experimenten onder steriele omstandigheden mogelijk werden. Dit systeem vergemakkelijkt het aanbrengen van chemicaliën in oplossing en hun efficiënte opname door wortels voor moleculaire, biochemische en fysiologische studies. We toonden aan dat dit systeem zeer efficiënt was in het verkrijgen van homogene zaailingen tijdens de initiële ontwikkeling, evenals het scheiden van wortels en scheuten met behulp van arabidopsis thaliana zaden.De volgende items zijn noodzakelijk om het hydrocultuursysteem op te bouwen en planten te kweken onder steriele, gecontroleerde omstandigheden. 7%ethanol, 10%bleekoplossing, polysorbaat 20, MS-medium inclusief vitaminen. MES-monohydraat, agar, kaliumhydroxide.Laminaire stroomkap, hotplate, groeikamer. Wegwerp plastic dozen, steriele glazen Petri-schalen, plakband, steriele 200 en 300 microliter pipettenpunten, schaar, 300 microliter meerkanaalspipet, 200 microliterpipet, scalpelmesje, pincetten en 200 microliter pipettenpuntendragers. Het is cruciaal dat de pipettenpuntendrager een gebied heeft om te worden gevuld met het vaste medium.Steriseer de pipettenpuntendragers zonder deksels die als minitanks zullen worden gebruikt in de autoclaaf bij 121 graden gedurende 20 minuten. Om besmetting te voorkomen, werden alle eerder genoemde materialen gesteriliseerd in de autoclaaf. Wanneer dit niet mogelijk was, zoals in het geval van de wegwerp plastic dozen, werden de materialen gereinigd met 7%ethanol voordat ze de laminare stroomkap binnenkwamen.Als de kap het toelaat, kan UV-licht 10 minuten voorafgaand aan de assemblage van het hydrocultuursysteem worden ingeschakeld. Verzegeld de bovenste oppervlakte van de pipettenpuntendrager met plakband. Indien mogelijk, laat ze 10 minuten onder UV-licht.Voeg vervolgens 108 microliters gesmolten vast medium toe aan elke put met behulp van een meerkanaalspipet. Als u veel tanks aan het voorbereiden bent, gebruik een hotplate om te voorkomen dat het MS-medium stolt. Laat het medium volledig stollen, ongeveer 30 minuten.Tijdens de stolperio de kan UV-licht worden ingeschakeld. Vul de tipbox volledig met vloeibaar kweekmedium. Zorg voor een goede aansluiting tussen vast en vloeibaar medium.Verwijder plakband van de bovenste oppervlakte van de pipettenpuntendrager en plaats deze voorzichtig op de houder. Het hydrocultuursysteem is nu klaar om de gesteriliseerde zaden te ontvangen. De hier beschreven vloeibare bleeksterilisatie is een praktische methode om zaden te steriliseren.Eerst plaats je 500 arabidopsiszaden in een 1,5 ml microbuisje. Gebruik zoveel microbuisjes als nodig is volgens het aantal planten dat nodig is voor het experiment. Was de zaden gedurende twee minuten met 7%ethanol met agitatie.Verwijder het ethanol voorzichtig. Voeg één ml van 10%bleekoplossing met twee microliters polysorbaat 20-detergent toe. Agiteer gedurende vijf minuten.Verwijder de oplossing voorzichtig. Spoel de zaden uiteindelijk af met gesterileerd gedistilleerd water tot alle bleekresiduen volledig zijn verwijderd, ongeveer vijf keer. Dit protocol is haalbaar voor arabidopsis, maar dit systeem kan ook worden gebruikt voor andere plantensoorten.Voor dit doel moet de genoemde sterilisatieprocedure worden aangepast aan de soortvereisten. Na oppervlaktesterilisatie werden de zaden ondergedompeld in steriel gedistilleerd water en gestratificeerd bij vier graden in het donker gedurende vijf dagen om de kieming te synchroniseren. Snijd de uiteinden van 200 microliter pipettenpunten lichtjes door met behulp van een steriele scalpel.Pipet de arabidopsiszaden in het vaste kweekmedium op het bovenste oppervlak van de pipettenpuntendrager. Zorg ervoor dat het medium niet losraakt van de drager, anders zullen de zaden in de schaduw komen en zullen de zaailingen niet goed groeien. Bewaar zoveel mogelijk minitanks in een wegwerp plastic vak om een hoge luchtvochtigheid te behouden en de omgeving vrij te houden van micro-organismen.Verzegeld het wegwerp plastic vak met plakband. De hydrocultuursystemen zijn nu klaar om de groeikamer binnen te gaan. Dit hydrocultuursysteem werd oorspronkelijk ontwikkeld om de toediening van chemicaliën aan planten te vergemakkelijken, zoals isotoopgelabelde verbindingen, die over het algemeen erg duur zijn om toe te passen in grootschalige experimenten.Als bewijs van concept gebruikten we de ATP-competitieve remmer AZD8055, die specifiek het ATP-bindingsgebied van de doel-rapamycine-eiwitkinase target. TOR-kinase is een belangrijke regulator die nutriëntensensing en energiesignalering integreert om celproliferatie en groei te bevorderen. Om primaire reacties op TOR-remming gemedieerd door AZD te beoordelen, werden arabidopsiszaden hydroponisch gekweekt tot het gewenste ontwikkelingsstadium onder een fotoperiode van 12 uur.Verse medium bevattende twee micromolar AZD of 0,05%DMSO als controle werden aan het einde van de nacht vervangen in de hydrocultuurtanks. Zaailingen werden op verschillende tijdstippen na behandeling geoogst, gescheiden in wortels en scheuten, ingeslagen in vloeibare stikstof, vermalen tot een fijn poeder en bewaard bij min 80 graden tot gebruik. Het fosforylatiepatroon van ribosomaal eiwit S6-kinase, RPS6, een van de bekende doelen van de TOR-route.Immunoblotting toont de hoeveelheid totale en gefosforyleerde RPS6 in wortels, grafiek A, en scheuten, grafiek B. Repressie van fosforylatie in aanwezigheid van ADZ855 vond plaats zodra 30 minuten na drugbehandeling in zowel wortels als scheuten, wat aantoont dat onder de gebruikte experimentele omstandigheden ADZ ook een krachtige TOR-remmer bleek te zijn die snel zijn kinase-activiteit onderdrukt. Transgene arabidopsislijnen met verminderde expressie van het TOR-gen of componenten van het TOR-complex vertonen een duidelijke overtolligheid van zetmeel. Kwalitatieve analyse van zet

a-flexible-low-cost-hydroponic-system-for-assessing-plant-responses

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Een eenvoudige methode is voorzien die het mogelijk maakt voor de snelle extractie en analyse van veelvoudige plantaardige hormonen uit kleine weefselmonsters. De procedure maakt gebruik van dampfase extractie als de plechtige zuiveringsstap. Monsters worden geanalyseerd door GC / MS met chemische ionisatie, die voornamelijk produceert (M +1) + ionen.

Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties

Source: Nathoo, N., et al. A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a hydroponic co-cultivation system for studying plant–bacteria interactions under sterile conditions. Plant seedlings are transferred into a sterile, acidic growth medium, incubated, and inspected for contamination before inoculation with Agrobacterium. The activated bacteria attach to plant...

A Co-Cultivation System to Study the Molecular Responses of Plant Hosts and Interacting Bacteria

Hier presenteren we een eenvoudig te volgen protocol om een succesvol hydrocultuursysteem op te zetten voor studies naar plantenvoeding. Dit protocol is uitvoerig getest op Arabidopsis en kan eenvoudig worden aangepast aan andere plantensoorten om specifieke voedingsbehoeften of de invloed van niet-essentiële elementen op plantengroei en -ontwikkeling te bestuderen.

Hydrocultuur: Een veelzijdig systeem om Nutrient Toewijzing en Plant Responses to beschikbaarheid van voedingsstoffen en de blootstelling aan giftige elementen Studie

Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Dit artikel laat zien hoe cultuur Arabidopsis thaliana zaailingen in een twee-laag microfluidic platform dat de belangrijkste wortel en root haren op een interne optische vlak beperkt. Dit platform kan worden gebruikt voor real-time optische beeldvorming van fijne wortel morfologie alsook wat betreft hoge resolutie beeldvorming door andere middelen.

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Hier beschrijven we een hydroponische plantengroei test om de aanwezigheid van soorten te kwantificeren en de ruimtelijke verdeling van bacteriën te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na hun overdracht in verschillende groei omgevingen.

Monitoring van bacteriële kolonisatie en onderhoud op Arabidopsis thaliana wortels in een drijvend Hydroponisch systeem

Wij bieden een methode voor het identificeren van modulatoren van bladtranspiratie door grootschalige screening van een samengestelde bibliotheek.

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

We gebruiken eenvoudige laboratoriumtools om de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Arabidopsis en Medicago te onderzoeken. De plantjes worden hydroponisch over gaas gekweekt en verspreid met behulp van een kunstkwast om de RSA te onthullen. Foto's worden gemaakt met behulp van scannen of een camera met hoge resolutie en vervolgens geanalyseerd met ImageJ om eigenschappen in kaart te brengen.

Een eenvoudig protocol voor het in kaart brengen van de eigenschappen van de plantwortelsysteemarchitectuur

We presenteren een protocol voor een op glas gebaseerd, semi-hydroponisch experimenteel systeem dat de groei ondersteunt van een verscheidenheid aan fylogenetisch verschillende planten met of zonder microben. Het systeem is compatibel met verschillende groeimedia en maakt niet-destructieve bemonstering van wortelexsudaat mogelijk voor stroomafwaartse analyse.

Een veelzijdig glazen pottensysteem voor semihydroponische wortelexsudaatprofilering

Leer een flexibel, goedkoop hydrocultuursysteem voor plantenonderzoek met Arabidopsis thaliana onder steriele omstandigheden. Deze methode ondersteunt grootschalige moleculaire en fysiologische studies.

Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden (Video) | JoVE Journal

Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden

Meer video's verkennen