Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium
7 juni 2018
Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.
De workflow die hier wordt gepresenteerd, kan helpen om ons begrip van de cellulaire rol van chaperones tijdens oxidatieve stressomstandigheden te vergroten. Specifiek, kan het helpen om te begrijpen hoe chaperones eiwitaggregatie voorkomen tijdens ontvouwende omstandigheden. Voor deze twee gebieden bieden verschillende technieken inzicht in de activiteit van vlaggen gescheiden chaperones.
Het kan ook worden gebruikt om andere eiwitinteracties te bestuderen, zoals enzymatische sociale interacties en eiwitdynamica. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het het gebruik van verschillende instrumenten omvat, wat voor nieuwe gebruikers uitdagend kan zijn. Eerst centrifugeer je een eerder ontdooid eiwitmonster om aggregaten te verwijderen.
Voeg vervolgens vijf millimolar DTT en 20 micromolar zinkchloride toe en incubeer het monster gedurende minimaal 1,5 uur bij 37 graden Celsius. Om de DTT te verwijderen, breng je een ontzoutingskolom in evenwicht met een kaliumfosfaatbuffer van 40 millimolar door de kolom volledig te vullen met de buffer en deze eruit te laten druppelen. Gebruik een pincet om voorzichtig op de witte schijffilter in de kolom te drukken en deze te verwijderen.
Vul de kolom opnieuw met kaliumfosfaatbuffer en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1000 keer G. Breng na het centrifugeren de kolom over in een schone buis en voeg het eiwitmonster langzaam toe aan het midden van de kolom. Centrifugeer de kolom gedurende twee minuten bij 1000 keer G zodat het DTT-vrije eiwit in de doorstroming terechtkomt.
Controleer nu de eiwitconcentratie en meet de absorptie bij 280 nanometer. Verdeel de helft van de eiwitmonsters in aliquoten. Incubeer de aliquoten onder anaërobe omstandigheden gedurende 20 minuten voor volledige verwijdering van zuurstof.
Versluit vervolgens de buizen met plastic folie en bewaar de monsters onder koude omstandigheden. Voeg vervolgens vers bereide vijf millimolar waterstofperoxide toe aan het resterende eiwitmonster en incubeer gedurende drie uur bij 40 graden Celsius terwijl geroerd wordt. Controleer na centrifugatie de eiwitconcentratie en verdeel vervolgens de geoxideerde eiwitten in aliquoten en bewaar ze onder koude omstandigheden.
Bereid het gedenatureerde substraat voor door 12 micromolar citraatsynthase gedurende de nacht in 40 millimolar HEPES en 4,5 molair guanidiniumchloride te incuberen. Open de volgende dag de fluorospectrometersoftware en ga naar tijdsverloopmeting. Stel de excitatiebandbreedte in op 2,5 nanometer.
De excitatiegolflengte op 360 nanometer. De emissiegolflengte op 360 nanometer. De emissiebandbreedte op vijf nanometer.
En het data-interval op 0,5 seconden. Stel de temperatuur in op 25 graden Celsius. Bereid het monster voor door 1600 microliter 40 millimolar HEPES toe te voegen aan een kwarts cuvet.
Plaats de cuvet in de monsterhouder van een fluorospectrometer zodat het monster de gewenste temperatuur bereikt. Nadat het roeren op 600 tpm is ingesteld, begint u met meten totdat de basislijn is vastgesteld. Om de citraatsynthase-aggregatie in afwezigheid van een chaperonne te meten, voegt u 10 microliter gedenatureerde citraatsynthetase toe, 120 seconden na het begin van de meting.
Ga dan door met meten gedurende 1200 seconden. Om de citraatsynthase-aggregatie in aanwezigheid van Hsp33 te meten, voegt u Hsp33 60 seconden na het begin van de meting toe. Voeg na nog eens 60 seconden 10 microliter gedenatureerde citraatsynthetase toe en ga verder met meten gedurende 1200 seconden.
Upload vervolgens het databestand om gegevensanalyse en ruisverwijdering door Kfits uit te voeren. Kies analyseparameters om eventuele ruis te verwijderen, gebruik het automatisch beste model en selecteer dat ruis altijd boven het signaal ligt. Verwijder handmatig duidelijke uitzonderingen met behulp van de groene en rode instelbare lijnen die de ruis boven de groene lijn en onder de rode lijn filteren.
Stel vervolgens de basislijn en de pascurve in. Nadat de ruisdrempel is toegepast, downloadt u de verwerkte gegevens. Bereid eiwit-substraatcomplexmonsters voor door citraatsynthetase toe te voegen aan Hsp33 in een verhouding van 1 tot 1,5 bij 43 graden Celsius.
Gebruik minimaal vier stappen en incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 43 graden Celsius na elke toevoeging om complexvorming mogelijk te maken. Centrifugeer de monsters gedurende 30 minuten bij 16000 keer G bij vier graden Celsius om eventuele aggregaten te verwijderen. Plaats vervolgens de monsters in glazen inserts van 150 microliter en breng ze over in flesjes.
Plaats ze vervolgens in de juiste trays. Houd buffers H en D op 25 graden Celsius en houd de monsters en de blusbuffer op nul tot twee graden Celsius. Schakel vervolgens handmatig alle koeleenheden van de massaspectrometer in.
Zodra alle koelsystemen hun doeltemperatuur hebben bereikt, schakel je handmatig zowel de HPLC- als de laadpompen in. Open de software die beide pompen bestuurt, evenals de software die de massaspectrometer bestuurt en zorg ervoor dat de MS in stand-by staat. Koppel vervolgens de HPLC-uitlaatklep van de MS-bron.
Was het systeem eerst met een drievoudige reinigingsoplossing. Vervolgens met buffer B en tenslotte met buffer A. Plaats vervolgens de pepsinekolom in het systeem. Na het wassen van het systeem met een gelijkmatige stroom en gelijkmatige druk, plaatst u de HPLC-uitlaatklep in de MS-bron en zet u de MS aan.
Open nu de software. Bouw een uitvoersequentie en voer alle tijdstippen, monsternamen en locaties in de trays in, evenals de buffernamen en -locaties. Nadat de run is voltooid, analyseert u de peptidedekking van het monster door de niet-deuteriumcontrolemonsters door de software te laten lopen.
Breng gegevens over naar de HDX Workbench-software en analyseer de resultaten met behulp van de software. Sla de geselecteerde peptiden op en ga verder met de analyse van de deuteriumopname. Chemische denaturatie leidt tot een snelle citraatsynthase-aggregatie geïnduceerd door de heropvouwing van een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden om de rol van moleculaire chaperonnes tijdens oxidatieve stress te onderzoeken, met de nadruk op hun anti-aggregatieactiviteit. De besproken technieken omvatten het monitoren van structurele veranderingen die de functie van chaperonnes bepalen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Oxidatieve stress leidt tot de accumulatie van oxidanten in cellen.
- Moleculaire chaperonnes spelen een cruciale rol bij het voorkomen van eiwitaggregatie.
- Inzicht in de functie van chaperonnes is essentieel voor het begrijpen van cellulaire stressresponsen.
- Methoden zoals HDX-MS zijn waardevol voor het bestuderen van deze processen.
Doel van de studie
- Om het begrip van de cellulaire rollen van chaperonnes tijdens oxidatieve stress te verbreden.
- Om te onderzoeken hoe chaperonnes eiwitaggregatie onder stressomstandigheden voorkomen.
- Om inzicht te verschaffen in eiwitinteracties en -dynamiek.
Gebruikte methoden
- High-Definition Mass Spectrometry (HDX-MS) voor het monitoren van structurele veranderingen.
- Bereiding van eiwitmonsters om aggregaten te verwijderen.
- Visuele demonstraties van technieken voor nieuwe gebruikers.
- Gebruik van diverse instrumenten om chaperone-activiteit te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- De anti-aggregatieactiviteit van chaperonnes werd aangetoond.
- Er werd inzicht geboden in de structurele dynamiek van chaperonnes.
- Het belang van visuele methoden voor het begrijpen van complexe technieken werd benadrukt.
- De studie van eiwitinteracties en -dynamiek werd gefaciliteerd.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden verbeteren het begrip van chaperonnefuncties tijdens stress.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar eiwitaggregatie informeren.
- Visuele methoden zijn essentieel voor effectief leren en de toepassing van deze technieken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het begrijpen van redox-gereguleerde chaperone-mechanismen biedt voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets voor ziekten gerelateerd aan oxidatieve stress. Het in kaart brengen van conformationele veranderingen via HDX-MS maakt mechanische risicoreductie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk in de vroege ontdekkingsfase. Deze workflow ondersteunt de ontwikkeling van assays en de screeninggereedheid voor chaperone-modulerende therapeutica.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de redoxstatus te koppelen aan chaperone-activering en de bescherming van cliëntproteïnen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via kwantitatieve metingen van anti-aggregatieactiviteit met behulp van lichtverstrooiingskinetiek.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door functionele (geoxideerde) van inactieve (gereduceerde) chaperonestatussen te onderscheiden op basis van de functionele output.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor (gereduceerd/geoxideerd Hsp33) voor downstream compound-screening tegen eiwitaggregatie.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van Kfits voor het verwijderen van uitschieters en kinetische fitting, wat de betrouwbaarheid van de gegevens in aggregatie-assays verhoogt.
- Herbruikbaarheid van het platform: Toepasbaar op andere kinetische metingen en studies naar eiwit-eiwitinteracties buiten Hsp33-citraatsynthase.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Verbindt de redox-schakelaar van Hsp33 met modellen van oxidatieve stress, wat de exploratie van translationele biomarkers ondersteunt.
- Mechanische risicoreductie: Brengt interactieplaatsen in het C-terminale domein in kaart, waardoor allostere hindering bij cliëntbinding wordt verduidelijkt.
- Preklinische continuïteit: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk door structurele dynamiek te correleren met functionele uitkomsten over verschillende redox-toestanden.
Pipeline- & workflowintegratie
Plaatst de karakterisering van Hsp33 binnen de workflows van vroege ontdekking tot preklinische fasen, waarbij redox-detectie wordt gekoppeld aan functionele validatie en interactiekaarten.
- Ontdekkingsbiologie: Test hoe oxidatieve stress de chaperonefunctie activeert via conformationele schakeling en clientbinding.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van anti-aggregatieactiviteit voor de validatie van hits in chaperone-gerichte screens.
- Analytiek: Biedt deuterium-opnamemetrieken die conformationele veranderingen en bindingsinterfaces kwantificeren onder gedefinieerde redoxcondities.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door de oxidatietoestand van Hsp33 te koppelen aan functionele bescherming in ziekterelevante stressmodellen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een modulaire workflow voor het bestuderen van andere redox-gereguleerde chaperones of stress-senserende eiwitten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door Hsp33 conformationele dynamiek te correleren met de anti-aggregatiefunctie.
- Operationele waarde: Standaardiseert monsterpreparatie (gereduceerde/geoxideerde toestanden) en gegevensverwerking (Kfits, HDX-MS) voor consistentie tussen studies.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door structurele en functionele bewijzen te leveren voor target engagement onder stress.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van chaperone-modulatoren mogelijk op basis van redox-afhankelijke activiteitsprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in eiwitredox-biochemie, anaerobe hantering en massaspectrometrie.
- Afhankelijk van een fluorospectrometer voor aggregatiekinetiek en een HDX-MS-platform met pepsinekolom en quenching-capaciteit.
- Vereist standaardisatie tussen teams van buffercondities, incubatietijden en temperatuurcontroles over verschillende redoxtoestanden.
- Moet rekening houden met eiwitspecifieke optimalisatie van denaturatiemiddel, pH en temperatuur voor de stabiliteit van het substraat en de chaperone.
- Beperkt door de noodzaak van anaerobe condities tijdens de reductie en zorgvuldige hantering om voortijdige oxidatie te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Preparation of Fully Reduced and Fully Oxidized Proteins
2:37
Light Scattering Aggregation Assay
5:20
Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)
8:01
Results: Investigation of Hsp33 s Redox-regulated Chaperone Activity and Structure Changes
9:34
Conclusion
