Name: Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Leer hoe je stabiele 3D-celassemblages bouwt zonder kunstmatig steiger met behulp van optische pincetten en hydrofiele polymeren zoals Dextran. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Shu Hashimoto, Aoi Yoshida en Taeko Ohta Doshisha Universiteit voor hun gulle hulp bij de experimentele opzet. Dit werk werd ondersteund door KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) en door het MEXT-Supported-programma voor de strategische Research Foundation aan particuliere universiteiten. Deze studie werd ook ondersteund door een Poolse subsidie van het KNOW (toonaangevende nationale centrum voor onderzoek) wetenschappelijk Consortium "Gezond dier - veilig voedsel", besluit van Ministerie van Wetenschappen en hogeronderwijs nr. 05-1/KNOW2/2015...

1. bereiding van cellen
<ol><li>Onderhouden NAMRU muis melkklier epitheliale cellen (NMuMG cellen) met 5 mL D-MEM met 10% (v) foetale runderserum (FBS) en 1% (v) penicilline-streptomycine (P/S) in een maatkolf van 25 cm3 . Verwijderen Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (D-MEM), met 10% FBS en 1% P/S.</li>
	<li>3-5 mL 37 ° C-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (-) Voeg aan de maatkolf. Merk op dat de pH van PBS 7,1-7.3 is.</li>
	<li>Verwijder alle de PBS uit de kolf met behulp van een aspirator.</li>
	<li>Voeg 1,5 mL trypsine van 37 ° C (0,25%, w/v) aan op de maatkolf.</li>
	<li>Incubeer de kolf gedurende ongeveer 1-2 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 .</li>
	<li>Voeg 3,5 mL D-MEM met 10% FBS en 1% P/S tot de kolf. Pipetteer te mengen.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL en Centrifugeer het gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Merk op dat de straal van de rotatie en de rotatiesnelheid van de centrifuge 16,6 cm en 1500 rpm, respectievelijk. Onder deze voorwaarde is de relatieve centrifugale kracht 417 x g.</li>
	<li>Voeg 5 mL van de verse D-MEM (10% FBS en 1% P/S) aan op de maatkolf na aspirating van het medium (indien nodig, cryopreserve de cellen met cryopreservatie oplossing, na instructies van de fabrikant).</li>
</ol>2. voorbereiding van Dextran (DEX)
<ol><li>Bereiden van 80 mg/mL DEX-oplossing door het mengen van 10 mL van de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) en 0.8 g van DEX. Merk op dat de oplossing van DEX kan worden gefilterd met een spuit filter (0,22 µm) nadat de cellen hebben gekweekt voor een voldoende tijd.</li>
	<li>Bereid een celsuspensie met 40 mg/mL DEX medium door het mengen van 200 µL van DEX oplossing en 200 µL van de celsuspensie bereid in 2.1. Merk op dat de nummer dichtheid van de cellen in de oplossing ongeveer 2.3 × 10 is5 cellen/mL.</li>
</ol>3. voorbereiding van de Laser en microscopie
<ol><li>Inschakelen van de laser (continu golven, golflengte van 1,064 nm) (Figuur 1een). Merk op dat het gebruik van een laserstraal, met een golflengte in het rood tot nabij-infrarood regio is het meest effectief; deze golflengte regio heet de diagnostische en therapeutische venster10 aangezien het minimaal wordt geabsorbeerd door de cellen.</li>
	<li>Dubbelklik op het pictogram software.</li>
	<li>Dubbelklik op die de pictogrammen voor de ① camera, ② light - emitting diode (LED), ③ focus aanpassen, en ④ fase verplaatsen. De displays overeenkomt met ①-④ verschijnt (Figuur 1b).</li>
</ol>4. cel manipulatie met behulp van het lasersysteem overvullen
<ol><li>Plaats 20 µL van het monster dat is bereid in stap 2.2 op de bodem cover glas (0,17 mm dikte, grootte = 30 mm × 40 mm), en bedek het met de hoogste dekking glas (0,17 mm dikte, grootte = 18 mm × 18 mm), met scheiding geboden door twee afstandhouders (0,17 mm dikte grootte = 10 mm × 24 mm), zoals afgebeeld in Figuur 2. Merk op dat deze bril niet een speciale coating vereisen.</li>
	<li>Plaats van de cel van de steekproef bereid in stap 4.1 op de lagere objectief (water onderdompeling met ca. 10 μl, vergroting = 60 X, afstand = 0,28 mm, numerieke diafragma = 1.2)).</li>
	<li>Bevestig het bovenste objectief (water onderdompeling met ca. 10 μl, vergroting = 60 X, afstand = 2 mm, numerieke diafragma = 1.0) aan de bovenkant van de cel van de steekproef.</li>
	<li>Zet de LED licht door te klikken op pictogram 2 (Figuur 1b).</li>
	<li>Pas de afstand tussen het monster en de lagere objectief door te klikken op de pictogrammen op paneel 3 (Figuur 1b) totdat het is in focus.</li>
	<li>Het bestralen van de laserstralen op positie 1 en positie 2 (Figuur 1B) van het monster door te klikken op pictogrammen I, II en III (Figuur 1b).</li>
	<li>De intensiteit van elke laserstraal ingesteld op 1.500 mW door het invoeren van deze waarde op pictogram IV (Figuur 1b).</li>
	<li>Zet de monster fase door te klikken op pictogram 4 aangeeft richtingen (Figuur 1b) tot een cel is gevangen in positie 1 (Figuur 1b).</li>
	<li>Sleep de cursor positie 2 (Figuur 1b) tot een andere cel aangeeft is gevangen in positie 2.</li>
</ol>5. bouw van een 3-dimensionale (3D) celstructuur
<ol><li>Manipuleren een eencellige zodat er in contact met een andere cel. Handhaven van deze voorwaarde voor 300 s; dat wil zeggen, elke cel wordt blootgesteld aan een laser voor 300 s.</li>
	<li>De X-en Y-as weergegeven in Figuur 1bopnemen.</li>
	<li>Construeer een willekeurige 2D cel vergadering door het vangen en transporteren van een andere cel aan de cellen.</li>
	<li>Bouw een 3D cellulaire vergadering door het podium op en neer te bewegen.</li>
	<li>Bevestigen dat de vergadering stabiel blijft na de laser wordt uitgeschakeld.</li>
</ol>

<ol><li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577(2015).</li>
<li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li>
<li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%22%5BJournal%5D)">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li>
<li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li>
<li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29248729">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/9/8/319">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319(2017).</li>
<li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photothermolysis%3A+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li>
<li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261416303207">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li>
<li>Rauch, P., Jähnke, T. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/optical-tweezers-for-quantitative-force-measurements-and-live-cell-experiments/D4853D94DFD7AE988E656F49A1DA49FB">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li>
<li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315348">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige studie toont een concrete toepassing van onze recente rapporten9,11 op het gebruik van oplosbare polymeren voor de bouw van 3D eencellige assemblages. Dergelijke vergaderingen worden stabiel gevormd in de bulk-oplossing wanneer het aantal cellen maximaal 10 is, en kan worden gehouden door een enkele laserstraal. Assemblages neerslaan op het glasoppervlak wanneer er meer dan 10 cellen. Hoewel de experimenten nog in een primitieve stadium zijn, we verwachten dat de nieuwe methodologie zou een krachtig instrument voor de bouw van de volgende generatie 3D eencellige assemblages, die onmisbaar voor de vooruitgang op het gebied van celbiologie zijn en regeneratieve geneeskunde.
In een oplossing met geen polymeer, afstoten cellen elkaar als gevolg van de elektrostatische afstoting die voortvloeien uit de oppervlakte lading, de kracht van de afkeer hydratatie, glycocalyx repulsion effect en membraan golving. Onze vorige studie toonde aan dat cel paren kunnen stabiel voor een lange tijd wanneer de cellen worden behandeld met PEG. Wat nog belangrijker is, suggereert het succesvolle vervoer van een paar van de cel naar een regio zonder PEG, nadat de cellen hadden plaatsgevonden in contact gedurende 5 minuten in PEG, dat cellulaire contact op een stabiele wijze is onderhouden. Dit wordt goed uitgelegd in de termen van de uitputting effect11, en in wezen hetzelfde mechanisme is van toepassing op de cellulaire assembly's gegenereerd met behulp van DEX9. Onze huidige resultaten suggereren dat andere soorten natuurlijke macromoleculen kunnen ook worden gebruikt voor de bouw van stabiele 3D cellulaire assemblages.
Voor het snelle vervoer van cellen is de concentratie van polymeer belangrijk. In het algemeen verhoogt de viscositeit van de oplossing drastisch wanneer het polymeer wordt opgelost boven de concentratie van de overlapping. Onder deze voorwaarde is het moeilijk om te manipuleren van cellen met optisch pincet. Vandaar, is het experiment moet worden uitgevoerd onder de overlap concentratie. Voor een oplossing van DEX, de overlapping concentratie is ca. 50 mg/mL (de kinetische viscositeit is 5,5 mm2/s). Zoals blijkt uit Ref. 9, werd een stabiele cellulaire vergadering waargenomen toen de concentratie van DEX 10 mg/mL tot 40 mg/mL. Dit resultaat wijst erop dat het effect van uitputting voldoende grote stabiele cel om contact te houden zelfs wanneer de DEX-concentratie lager dan de concentratie van de overlapping is. Het is aangetoond dat de toevoeging van DEX heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen tot 40 mg/mL 9.
De oprichting van een methode voor de bouw van 3D cellulaire assemblages is belangrijk op het gebied van regeneratieve geneeskunde, sinds het nabootsen van een in vivo cellulaire communicatie door het structureren van afzonderlijke cellen kan vergemakkelijken stamcel afkomstige weefsel vorming. Tot nu toe hebben we dit protocol gebruikt voor de bouw van cellulaire samenstellen met behulp van Neuro2A cellen9 naast NMuMG cellen. Wij hopen om een experimentele methode voor de bouw van 3D cellulaire assemblages voor een groter aantal cellen van verschillende morphologies. Het optisch pincet systeem ontwikkeld door Ichikawa et al. 13 zou gelden voor dit doel de oriëntatie van de cellen kan worden bestuurd. Verdere proeven langs deze lijnen moeten zijn veelbelovend.

Terwijl menselijke weefsels samengesteld uit verschillende samenstellingen van de cellen zijn en helpen kunnen om de homeostase van het lichaam, afzonderlijke cellen zelf ook een belangrijke rol spelen via cel-naar-cel interactie. Daarom is het belangrijk om te verhelderen hoe afzonderlijke cellen kunnen worden gestimuleerd door externe signalen en hoe zij dergelijke signalen naar andere Adherente cellen overdragen. Voor dit doel, zijn verschillende methoden vastgesteld voor de bouw van één cel-gebaseerde 3-dimensionale (3D) vergaderingen1,2,3,4,5,6 ,7,8. De materialen die worden gebruikt voor het construeren van cellulaire assembly's kunnen echter nog worden verbeterd. Bijvoorbeeld, synthetische gels en polymeren waaronder polyethyleenglycol (PEG) bepaalde chemische, fysisch-chemische eigenschappen bezitten en kunnen van invloed zijn op de doelcellen (bijvoorbeeld toxiciteit).
Onlangs meldden wij een nieuw systeem dat tot een enkele cel-gebaseerde 3D vergadering van cellen met dextran (DEX leiden kan) door de oprichting van stabiele cel contact9. We hebben overwogen dat deze technologie op verscheidene onderzoeksgebieden, met inbegrip van regeneratieve geneeskunde en zelfs Kankerbiologie nuttig zou kunnen zijn. In dit verslag beschrijven we hoe we enkele cellen manipuleren en 3-dimensionale (3D) cellulaire assemblages in de aanwezigheid van verschillende hydrofiele biomacromoleculen met inbegrip van DEX zonder een kunstmatige steiger bouwen.

<table><tbody><tr><td>Microscope IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dextran(200,000; moleculair biologie-kwaliteit)</td><td>Wako</td><td>CAS.NO&nbsp; 9004-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td><td>JPK Instruments</td><td>S/N T-05-0200</td><td></td></tr><tr><td>Upper Objectieflens</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td></td></tr><tr><td>Lower Objectieflens</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Top Dekglas</td><td>MATUNAMI</td><td>C022401</td><td></td></tr><tr><td>Tussenliggend Dekglas (Spacer)</td><td>MATUNAMI</td><td>-</td><td>op maat gemaakt (afmeting = 10mm&times;10mm, dikte = 0,17mm)</td></tr><tr><td>Onderste Dekglas</td><td>MATUNAMI</td><td>C030401</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>The Imaging Source</td><td>DFK 31AF03</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoTracker2 PFM software</td><td></td></tr><tr><td>NMuMG cellen&nbsp;</td><td>RIKEN BRC</td><td>RCB2868</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Cell banker</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>ZR621</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japan</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japan</td><td>161-23181</td><td></td></tr></tbody></table>

manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3d cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regeneratieve geneeskunde en weefselengineering bieden verschillende voordelen voor de behandeling van hardnekkige ziekten, en verscheidene studies hebben aangetoond dat het belang van 3-dimensionale (3D) cellulaire assemblages in deze velden. Kunstmatige steigers zijn vaak gebruikt voor de bouw van 3D cellulaire assemblages. Echter de steigers gebruikt voor de constructie van cellulaire assemblages zijn soms giftig en de eigenschappen van de cellen kunnen wijzigen. Dus, zou het zinvol zijn om een niet-toxisch methode voor het vergemakkelijken van cel-cel contact. In deze paper introduceren wij een nieuwe methode voor de opbouw van stabiele cellulaire samenstellen met behulp van optisch pincet met dextran. Een van de voordelen van deze methode is dat het stabiel contact van cel naar cel binnen een paar minuten. Deze nieuwe methode kan de bouw van 3D cellulaire vergaderingen in een natuurlijke hydrofiel polymeer en zit verwachte voor zitten nuttig voor de bouw van de volgende generatie 3D eencellige-assembly's op het gebied van regeneratieve geneeskunde en weefselkweek.

Figuur 1 toont de Microscoop en de software die wordt gebruikt in deze studie. Figuur 2 is een schematische weergave van de procedure voor het plaatsen van de monsteroplossing met cellen. Figuur 3 toont de vorming van een piramidestructuur met behulp van dubbel-bundel optisch pincet. Als het experiment succesvol is, wordt met deze cellulaire assemblages stabiel blijven zelfs nadat de laser wordt uitgeschakeld.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> Figuur 1 : (a) het controlesysteem voor het lasersysteem overvullen (NanoTracker2 (11)). Het systeem wordt geactiveerd door de op de switch van de laser als volgt ①-③ draaien. (b) de software voor het beheersen van het lasersysteem overvullen. De camera, LED licht, scherpstelling aan te passen, en bewegen van fase worden geactiveerd door te klikken op pictogrammen ①, ② en ③ ④, respectievelijk. De microscopische opname wordt weergegeven in het deelvenster 1. De aan/uit controle voor de LED is in deelvenster 2. De focus wordt beheerd in deelvenster 3. De laserstralen worden bestraald op posities 1 en 2 door te klikken op pictogrammen I tot IV. De details van deze Laser overvullen objectiveren waarin Ref. (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> Figuur 2: vertegenwoordiger schema voor het plaatsen van het glas van dia. 20 µL van het monster (celsuspensie met dextran) is op de dia geplaatst en gebruikt voor het manipuleren van de laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> Figuur 3 : een) samenstellingen van epitheliale cellen (NMuMG) van een beoogde vorm in een medium met DEX (40 mg/mL): een piramide wordt weergegeven als een voorbeeld van een 3D-cluster. b) een schematische afbeelding van de piramide-vormige 3D cellulaire vergadering blijkt ook. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

We laten zien een nieuwe methode voor de bouw van een enkele cel-gebaseerde 3-dimensionale (3D) vergadering zonder een kunstmatige steiger.

Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Deze nieuwe methodologie stelt ons in staat om driedimensionale samenstellingen te construeren, aangepast van de gewenste individuele cellen, in een waterige bufferoplossing die niet-specifiek hydrofiele polymeer bevat, door stabiel celcelcontact tot stand te brengen. In deze video laten we zien hoe we de gewenste enkele cellen manipuleren en 3D cellulaire assemblages bouwen zonder kunstmatige steiger. Hier tonen we de experimentele procedure in ons medium met Dextran als voorbeeld.Om te beginnen, handhaven NAMRU muis borstklier epitheelcellen met vijf milliliter DMEM, met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine, in een 25 kubieke centimeter fles gedurende twee tot drie dagen. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, gebruik dan een aspirator om de aanvullende DMEM te verwijderen en voeg drie tot vijf milliliter PBS toe, die wordt voorverwarmd tot 37 graden Celsius om de cellen te wassen. Verwijder met behulp van een aspirator alle PBS uit de kolf.Voeg 1,5 milliliter trypsine toe die voorverwarmd is bij 37 graden Celsius. Incubeer in een CO2-incubator op 37 graden Celsius gedurende ten minste een tot twee minuten. Voeg hierna 3,5 milliliter DMEM toe met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine.Pipette op en neer om te mengen. Breng de celsuspensie over op een centrifugebuis van 15 milliliter en vercentrifugeer deze drie minuten op kamertemperatuur op 417 keer G. Dan, aspirate het medium.Voeg vijf millimeter verse DMEM toe met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine. En gebruik indien nodig een cryopreservatieoplossing om de cellen te cryopreserveeren, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Meng eerst 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine met 0,8 gram Dextran, om een 80 milligram per milliliter Dextran-oplossing voor te bereiden.Meng 200 microliter van deze Dextran-oplossing met 200 microliter van de eerder voorbereide celsuspensie, om een celsuspensie te creëren die 40 milligram per milliliter Dextran-medium bevat. Om te beginnen, zet laser, merk op dat het gebruik van een laserstraal met een golflengte in de rode tot bijna-infrarood regio is het meest effectief. Open vervolgens de software door te dubbelklikken op het softwarepictogram.Dubbelklik op het pictogram voor de camera en houd er rekening mee dat het bijbehorende scherm verschijnt. Klik vervolgens op de pictogrammen voor de lichtgevende diode, de focus aan te passen, en de bewegende fase te openen hun displays ook. Plaats eerst twee glazen afstandhouders op de onderste deksel glazen schuif.Breng 20 microliter, de eerder voorbereide Dextran aangevuld cel suspensie op de bodem deksel glas schuif. Plaats vervolgens de bovenste cover glas schuif op de afstandhouders die de cel suspensie. Plaats de monstercel op de onderste objectief lens met 10 microliter gedestilleerd water voor wateronderdompeling microscopie.Bevestig de bovenste objectieflens aan de bovenkant van de monstercel met 10 microliter gedestilleerd water. Klik vervolgens op de aan-uit knop in het verlichtingsvenster van de microscoop om de LED aan te zetten. Klik op de richtingsknoppen in het objectieve positioneringsvenster om de afstand tussen het monster en de onderste objectieflens aan te passen totdat deze scherp is.Stel de intensiteit van elke laserstraal in op 1500 milliwatt in het signaaldempingsvenster. Klik vervolgens op de twee laserpictogrammen om de laserstralen op positie één en positie twee te bestralen. Klik op de richtingsknoppen in het voorbeeldpositioneringsvenster om de voorbeeldfase te verplaatsen totdat een cel op positie één is vastgetrapt.Klik en sleep de cursor die positie twee aangeeft totdat een andere cel vastzit op positie twee. Om te beginnen manipuleert u een enkele cel, zodat deze in contact komt met een andere cel. Houd deze toestand gedurende 300 seconden, zodat de cel wordt blootgesteld aan een laser gedurende 300 seconden.Neem de x-y-as op. Val een andere cel en transport naar de eerste twee cellen om een willekeurige 2D-cel assemblage te construeren. Verplaats vervolgens het podium op en neer om een 3D cellulaire assemblage te bouwen.Bevestig dat de montage nog stabiel is, zelfs nadat de laser is uitgeschakeld. In deze studie worden oplosbare polymeren gebruikt bij de bouw van 3D-eencellige assemblages. Een voorbeeldstructuur gevormd met behulp van de dubbelbalk optische pincet wordt hier getoond.Als het experiment succesvol is, blijven deze cellulaire samenstellingen stabiel, zelfs nadat de laser is uitgeschakeld. Deze nieuwe methode is voor de bouw van 3D cellulaire assemblages in een waterig medium met natuurlijk hydrofiele polymeer. Het is zeer verwacht dat de bouw van een dergelijk soort van de volgende generatie cellulaire assemblages te starten met een aantal van de krachtige instrumenten op het gebied van regeneratieve geneeskunde en weefsel engineering.

manipulating-living-cells-to-construct-stable-3d-cellular-assembly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We presenteren twee processen voor de microfabricage van poreuze polymeer chips voor drie-dimensionale celkweek. De eerste is hot embossing gecombineerd met een damp van oplosmiddelen lasproces. De tweede maakt gebruik van een recent ontwikkelde microthermoforming proces in combinatie met ion-Track technologie leidt tot een aanzienlijke vereenvoudiging van de productie.

Microfabricage van Chip-en kleinbedrijf Stellingen voor drie-dimensionale celkweek

Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Celsferoïden worden beschouwd als een potentieel model op het gebied van biologische toepassingen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het schaalbaar genereren van celsferoïden met behulp van een 3D akoestisch assemblageapparaat, dat een efficiënte methode biedt voor de robuuste en snelle fabricage van uniforme celsferoïden.

Driedimensionaal akoestisch assemblageapparaat voor massaproductie van celsferoïden

Leer hoe je stabiele 3D-celassemblages bouwt zonder kunstmatig steiger met behulp van optische pincetten en hydrofiele polymeren zoals Dextran. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.

Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Meer video's verkennen