Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Deze nieuwe methodologie stelt ons in staat om driedimensionale samenstellingen te construeren, aangepast van de gewenste individuele cellen, in een waterige bufferoplossing die niet-specifiek hydrofiele polymeer bevat, door stabiel celcelcontact tot stand te brengen. In deze video laten we zien hoe we de gewenste enkele cellen manipuleren en 3D cellulaire assemblages bouwen zonder kunstmatige steiger. Hier tonen we de experimentele procedure in ons medium met Dextran als voorbeeld.

Om te beginnen, handhaven NAMRU muis borstklier epitheelcellen met vijf milliliter DMEM, met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine, in een 25 kubieke centimeter fles gedurende twee tot drie dagen. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, gebruik dan een aspirator om de aanvullende DMEM te verwijderen en voeg drie tot vijf milliliter PBS toe, die wordt voorverwarmd tot 37 graden Celsius om de cellen te wassen. Verwijder met behulp van een aspirator alle PBS uit de kolf.

Voeg 1,5 milliliter trypsine toe die voorverwarmd is bij 37 graden Celsius. Incubeer in een CO2-incubator op 37 graden Celsius gedurende ten minste een tot twee minuten. Voeg hierna 3,5 milliliter DMEM toe met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine.

Pipette op en neer om te mengen. Breng de celsuspensie over op een centrifugebuis van 15 milliliter en vercentrifugeer deze drie minuten op kamertemperatuur op 417 keer G. Dan, aspirate het medium.

Voeg vijf millimeter verse DMEM toe met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine. En gebruik indien nodig een cryopreservatieoplossing om de cellen te cryopreserveeren, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Meng eerst 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%Penicilline-Streptomycine met 0,8 gram Dextran, om een 80 milligram per milliliter Dextran-oplossing voor te bereiden.

Meng 200 microliter van deze Dextran-oplossing met 200 microliter van de eerder voorbereide celsuspensie, om een celsuspensie te creëren die 40 milligram per milliliter Dextran-medium bevat. Om te beginnen, zet laser, merk op dat het gebruik van een laserstraal met een golflengte in de rode tot bijna-infrarood regio is het meest effectief. Open vervolgens de software door te dubbelklikken op het softwarepictogram.

Dubbelklik op het pictogram voor de camera en houd er rekening mee dat het bijbehorende scherm verschijnt. Klik vervolgens op de pictogrammen voor de lichtgevende diode, de focus aan te passen, en de bewegende fase te openen hun displays ook. Plaats eerst twee glazen afstandhouders op de onderste deksel glazen schuif.

Breng 20 microliter, de eerder voorbereide Dextran aangevuld cel suspensie op de bodem deksel glas schuif. Plaats vervolgens de bovenste cover glas schuif op de afstandhouders die de cel suspensie. Plaats de monstercel op de onderste objectief lens met 10 microliter gedestilleerd water voor wateronderdompeling microscopie.

Bevestig de bovenste objectieflens aan de bovenkant van de monstercel met 10 microliter gedestilleerd water. Klik vervolgens op de aan-uit knop in het verlichtingsvenster van de microscoop om de LED aan te zetten. Klik op de richtingsknoppen in het objectieve positioneringsvenster om de afstand tussen het monster en de onderste objectieflens aan te passen totdat deze scherp is.

Stel de intensiteit van elke laserstraal in op 1500 milliwatt in het signaaldempingsvenster. Klik vervolgens op de twee laserpictogrammen om de laserstralen op positie één en positie twee te bestralen. Klik op de richtingsknoppen in het voorbeeldpositioneringsvenster om de voorbeeldfase te verplaatsen totdat een cel op positie één is vastgetrapt.

Klik en sleep de cursor die positie twee aangeeft totdat een andere cel vastzit op positie twee. Om te beginnen manipuleert u een enkele cel, zodat deze in contact komt met een andere cel. Houd deze toestand gedurende 300 seconden, zodat de cel wordt blootgesteld aan een laser gedurende 300 seconden.

Neem de x-y-as op. Val een andere cel en transport naar de eerste twee cellen om een willekeurige 2D-cel assemblage te construeren. Verplaats vervolgens het podium op en neer om een 3D cellulaire assemblage te bouwen.

Bevestig dat de montage nog stabiel is, zelfs nadat de laser is uitgeschakeld. In deze studie worden oplosbare polymeren gebruikt bij de bouw van 3D-eencellige assemblages. Een voorbeeldstructuur gevormd met behulp van de dubbelbalk optische pincet wordt hier getoond.

Als het experiment succesvol is, blijven deze cellulaire samenstellingen stabiel, zelfs nadat de laser is uitgeschakeld. Deze nieuwe methode is voor de bouw van 3D cellulaire assemblages in een waterig medium met natuurlijk hydrofiele polymeer. Het is zeer verwacht dat de bouw van een dergelijk soort van de volgende generatie cellulaire assemblages te starten met een aantal van de krachtige instrumenten op het gebied van regeneratieve geneeskunde en weefsel engineering.