In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen van de bevolking heterogeniteit door de morfologische beoordeling van de cellen. In situ microscopie maakt studie teelt voorwaarden, proces opbrengsten, en productkwaliteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een in situ-meting, die real-time gegevens levert zonder bemonstering of het risico van besmetting met zich meebrengt.

In situ microscopie gekoppeld aan geautomatiseerde beeldherkenning kan aanvullende informatie over cellulaire structuren, vorm en cel agglomeratie meer dan grootte. Het is ook mogelijk om celconcentraties te meten. De methode heeft bewezen een betrouwbaar hulpmiddel te zijn.

Geen enkele alternatieve methode biedt dezelfde informatie in zo'n korte tijd en lage inspanning voor de voorbereiding van monsters. De methode is aangepast aan verschillende bioprocessen en micro-organismen, SEG filamenteuze schimmels, micro-allergie, en gist. De sonde wordt gebruikt in combinatie met een computer.

De hardware bestaat uit een enkele staafsonde met een CCD-camera met hoge resolutie. Cellen die door een verstelbare meetspleet gaan, worden door de camera in beeld gebracht. Licht komt in de opening tegenover de camera, wat betekent dat verlichting is door transmissie.

Stel de hardwareparameters in met celconcentraties die het verwachte bereik bestrijken. Begin met het voorbereiden van offline metingen. Gebruik een diktemeter om de meetspleet aan te passen.

Draai vervolgens de sondeschroefmoer om de meetkloof in te stellen op vijf of 10 keer de maximale verwachte celdiameter. Open op de computer de software van de sondecontroller. Selecteer in de software de gewenste sonde en ga naar sectieacties.

Druk vervolgens op Connect. Ga vervolgens naar het tabblad Probe Control en open het. Start het streamen van video's door op de afspeelknop te drukken.

Bevestig de sonde op een statief en voer de volgende stappen uit voor elke meting. Werk met de sonde en spuit ethanol in de meetkloof. Veeg vuil of vuil voorzichtig weg met optisch papier.

Gebruik op de computer live weergave om te controleren of het glas van de sensor vrij is van deeltjes. Plaats vervolgens een droog optisch papier in de meetkloof voor scherpstellen. Draai de bindschroef om de scherpstelling handmatig te verplaatsen.

Stop met scherpstellen wanneer enkele vezels van het papier in de meetkloof duidelijk zichtbaar zijn. Nu, neem een buis gevuld met cultuurbouillon. Dompel de microscoop in de bouillon, zodat de opening volledig is bedekt met celsuspensie.

Gebruik de bindschroeven om de focus op de cellen te verfijnen. Zodra deze focus is gedaan, niet opnieuw veranderen tijdens het experiment. Ga terug naar de software voor het experiment.

Ga naar het menu Triggering. Stel onder het menu Triggering de framesnelheid in. Eén hertz wordt aanbevolen voor offline metingen.

Ga van daaruit naar het veld Frames Per trigger en stel deze in als nodig voor goede statistieken. Hier, ongeveer 200. Ga ook naar het algemene menu.

Selecteer daar de map waarin de afbeeldingen worden opgeslagen. Begin met het verwerven van afbeeldingen met de knop Aankoop van de trigger starten. Beweeg de buis voorzichtig om de stroom in de meetspleet te induceren.

Gebruik de afbeeldingen uit de eerste run van het experiment als trainingsset. Hebben de open source software Fiji klaar en drop de beelden van het experiment in het venster. Wanneer u klaar bent, selecteert u Analyseren, gevolgd door Hulpmiddelen en vervolgens ROI Manager.

Kies vervolgens een selectiegereedschap. In de afbeelding, beslissen over een deeltje te annoteren dat is in focus. Teken er een cirkel omheen met het selectiegereedschap.

Druk op Toevoegen om de annotatie toe te voegen aan de ROI Manager. Selecteer vervolgens een penseelgereedschap en kies een geschikte pixelgrootte. Gebruik het penseel om de selectie te verfijnen.

Doorgaan met het markeren van alle objecten van belang op dezelfde manier op ongeveer 15 beelden. Sla de geannoteerde bestanden op en gebruik ze als trainingsset. Wanneer het herkenningsalgoritme is getraind en gereed, gebruikt u het om resultaten te visualiseren.

Ga in de resultatenanalyse naar Bestand, gevolgd door Bestand importeren. Selecteer daar het gewenste resultatenbestand. Ga verder door op de knop Grafiek maken te drukken.

Selecteer Distributiediagram. Dit zal de morfologische verspreiding van de cultuur weergeven. Ga terug naar Grafiek maken om gevoeligheidsplot te selecteren.

De weergegeven informatie kan helpen bepalen hoeveel cellen moeten worden geanalyseerd om de gewenste nauwkeurigheid te verkrijgen. Voer online metingen uit na het voltooien van offline metingen. Voor online metingen sluit u de sonde rechtstreeks aan op een bioreactor.

Eenmaal aangesloten, goed steriliseren van de montage. Selecteer Bewaking in het dashboard. Er is een afspeelknop om de aankoop van afbeeldingen te starten en een stopknop om deze te beëindigen.

Druk op de afspeelknop. Bij de bioreactor, beginnen inenting van de cultuur. De camera legt video van de cellen vast en identificeert ze automatisch voor analyse.

De monitoring biedt online gegevens van celgroottes en vormen van verschillende celmorfologieën tijdens de gehele fermentatie. De real-time resultaten kunnen op verschillende manieren worden opgemaakt en ook worden geëxporteerd voor verdere analyse. Dit plot van cumulatieve distributies van S.Cerevisiae celdiameter wordt gemaakt op basis van gegevens geanalyseerd met behulp van deze techniek.

Het toont de automatische celherkenning in staat is om ontluikende en niet-ontluikende cellen te onderscheiden. De vaste curve is de verdeling tijdens een teelt op drie uur. De gestippelde curve is de verdeling van dezelfde teelt op zeven uur.

De onderbroken curve vertegenwoordigt gegevens verzameld op 13 uur. De annotatieprocedure is tijdrovend, maar het is de sleutel voor het bereiken van de gewenste nauwkeurigheid voor de celidentificatie. Met deze procedure, als de meettijden korter zijn dan de procesdynamiek, kan de real-time meting worden gebruikt voor procesbesturing.

Deze techniek maakt de weg vrij voor het gebruik van de meting van de heterogeniteit van de bevolking als procesparameter voor microbiële teelten vanaf de vroege procesontwikkelingsstappen tot de productieschaal.