In Situ Meting en de correlatie van de celdichtheid en lichte emissie van bioluminescente bacterie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bioluminescentie. Bijvoorbeeld, het vinden van optimale groeicondities voor maximale lichtopbrengst van bioluminescente bacteriën en het bepalen van het regelmechanisme. Het grote voordeel van deze techniek is de eenvoudige opstelling, die voor verschillende stammen en organismen kan worden gebruikt, evenals de eenvoudige en snelle aanpassingsmogelijkheden.

Deze methode volgen kan inzicht geven in de kenmerken van lux operon. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals bacteriële, omgevings-, rapportagesystemen of sensoren. Om te beginnen, bereid een overnachtcultuur voor door 100 milliliter LB-medium met kanamycine te inoculeren, met lux operon getransformeerde E.coli BL21 cellen van glycerol stock, of direct van een transformatieplaat.

Incubeer de cultuur gedurende een nacht bij 37 graden Celsius en 120 RPM. De volgende dag, inoculeer 800 milliliter LB kanamycine-medium met 8 milliliter van de overnachtcultuur. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 120 RPM in een incubator shaker tot de celdichtheid een OD600 van 0,6 tot 0,8 bereikt.

Verlaag de incubatietemperatuur tot 28 graden Celsius en induceer eiwitexpressie door 0,1 millimolair IPTG toe te voegen. Observeer vervolgens de cellen totdat ze beginnen te gloeien. Na het bereiden van media volgens het tekstprotocol, streek de bacteriële bioluminescente stammen op kunstmatige zeewatermedium agar platen en incubeer ze gedurende een nacht bij 24 tot 30 graden Celsius.

Bereid een overnachtcultuur voor door 100 milliliter kunstmatig zeewatermedium te inoculeren met een enkele kolonie van de plaat. Incubeer vervolgens de cultuur gedurende een nacht bij 24 tot 30 graden Celsius en 120 RPM. De volgende dag, inoculeer 800 milliliter kunstmatig zeewatermedium met 8 milliliter overnachtcultuur.

Incubeer de bacteriële cellen bij 24 tot 30 graden Celsius en 120 RPM en observeer de cellen totdat ze beginnen te gloeien. Steek de gewenste bioluminescente bacteriestam of gemodificeerde E.coli-stam op een agarplaat en incubeer de cultuur gedurende een nacht bij 28 graden Celsius. Inoculeer 3 milliliter medium met een enkele kolonie van de overnachtplaat en incubeer de cellen gedurende ongeveer een tot twee uur bij 28 graden Celsius en 180 RPM.

Meet de celdichtheid van een een-op-tien verdunning van de vloeibare cultuur bij 650 nanometer. Bereken vervolgens de verhouding en het volume voor één milliliter cultuur met een OD650 van 0,05. Pipetteer het berekende volume van cultuur en medium in een 24-welplate met een glazen bodem.

Om ervoor te zorgen dat de pET28a vector die het hele lux operon bevat niet verloren gaat en dat deze in de gemodificeerde E.coli-stam wordt geëxpresseerd, voegt u een microliter kanamycine en een microliter IPTG toe aan de monsters. Plaats vervolgens een deksel op de plaat om verdamping tijdens de metingen te voorkomen. Gebruik ten slotte een plate reader ingesteld op 28 graden Celsius en een script gevonden in het tekstprotocol om elke 10 minuten absorptie- en bioluminescentiemetingen te nemen, met schudden tussen de datapunten.

Deze figuur vergelijkt OD650 metingen van E.coli BL21 cellen, BL21 cellen met een lege pET28a vector en BL21 cellen met een pET28a vector met de lux-rib operon insert, maar zonder inductie. Alle drie de referentiemetingen voor lichtemissie tonen een sigmoïdale groeicurve met latentie, exponentiële en stationaire groeifasen, maar geen lichtemissie, behalve de laatste steekproef, die lichtemissie na 300 minuten vertoont, vanwege de lekkage van de T7-promotor. Hier werden de groeicurven en lichtintensiteiten van het lux operon geëxpresseerd in E.coli en de bioluminescente bacteriestam, photobacterium mandapamensis 27561, vergeleken bij 28 graden Celsius in LB of kunstmatig zeewatermedium.

De gemodificeerde E.coli-stam en P.mandapamensis groeien in kunstmatig zeewatermedium, evenals LB-medium, en beide vertonen lichtemissie. Maar in LB-medium geeft P.Mandapamensis helemaal geen licht af. Opmerkelijk is dat de gemodificeerde E.coli-stam een hogere maximale lichtintensiteit vertoont dan de bioluminescente bacteriën.

In dit experiment werd de genexpressie van het E.coli gebaseerde lux-rib operon gedurende 24 uur gemeten om de levensduur ervan te analyseren. De lichtemissie duurde 19 en een half uur, veel langer dan bij de bacteriestammen, waar een geleidelijke afname werd waargenomen, resulterend in zeer lage lichtemissie na 10 uur. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van bioluminescentie om lux operons in modelorganismen, zoals E.Coli, te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u met bioluminescente bacteriën kunt werken.